Терапевтические дозовые характеристики химерного пептида MM-D37K при парентеральном введении мышам Balb/с nude с колоректальным раком человека НСТ-116 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ДОЗОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ХИМЕРНОГО ПЕПТИДА MM-D37K ПРИ ПАРЕНТЕРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ МЫШАМ BALB/C NUDE С КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ ЧЕЛОВЕКА HCT-116

Е.М. Уханова1, Т.М. Кулинич2, Е.А. Кудинова2, В.К. Боженко2, С.М. Ситдикова1, М.С. Калишьян1, Е.М. Трещалина1

1ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГБУ«Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Профсоюзная, 86

Контакты: Сурия Мансуровна Ситдикова suriyasitdikova@yandex.ru

Введение. В рамках конструирования молекул с патогенетической направленностью к опухолевой клетке создан ряд химерных пептидов, включающих функциональный фрагмент с аминокислотной последовательностью из группы SEQ ID NO: 1 — SEQ ID NO: 17 и транспортную последовательность. Эти пептиды при целевой доставке в клетку способны обнаруживать короткие функциональные домены в белках-регуляторах различных функций. Среди них ММ-D37K, блокирующий фазу G1 и индуцирующий апоптоз в клетках опухолей человека, в том числе колоректального рака HCT-116. Этот пептид рассматривается как потенциальный противоопухолевый агент с соответствующими этапами изучения.

Цель исследования — изучение дозовых характеристик MM-D37Kпри парентеральном введении на подкожных (п/к) ксено-графтах колоректального рака человека in vivo.

Задачи. 1. Изучение эффективности ММ-D37K в диапазоне доз при многократном п/к или внутривенном (в/в) введении мышам Balb/c nude c п/к ксенографтами колоректального рака человека HCT-116. 2. Оценка переносимости ММ-D37K при многократном парентеральном введении мышам с HCT-116.

Материалы и методы. Исследования химерного пептида MM-D37K (ингибитор циклинзависимых киназ 4/6) проведены на п/к ксенографтах колоректального рака человека HCT-116 у имммунодефицитных мышей Balb/c nude при использовании стандартных критериев оценка эффективности и переносимости и адекватной статистической обработке результатов с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни.

Результаты. Показано, что MM-D37K в разовых дозах 5 или 10 мг/кг при п/к или в/в 5-кратном введении через 48 ч (суммарные дозы 25 или 50мг/кг соответственно) значимо и достоверно ингибирует рост опухоли в течение 9 дней после окончания лечения на уровне Т/С = 27—43 % (p <0,05) (стандартный критерий Т/С <42 %) при удовлетворительной переносимости. При обоих путях введения выявлена слабая дозовая зависимость как по Т/С, так и по сроку достижения максимального эффекта при индивидуальной чувствительности к пептиду (вариабельность размеров опухолевых узлов при в/в введении большей дозы).

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о достаточной широте терапевтического действия химерного пептида MM-D37Kна модели колоректального рака человека HCT-116, позволяющей получить значимый достоверный противоопухолевый эффект при парентеральном многократном применении в 2-кратном диапазоне действующих доз.

Ключевые слова: химерный пептид MM-D37K, колоректальный рак человека, мыши Balb/c nude, эффективность, переносимость

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-36-41

THERAPEUTIC DOSE CHARACTERISTICS OF THE CHIMERIC PEPTIDE OF MM-D37K AT PARENTERAL INTRODUCTION TO THE BALB/C NUDE MICE WITH HUMAN COLORECTAL CARCINOMA HCT-116

E.M. Uchanova1, T.M.. Kulinich2, E.A. Kudiniva2, V.K. Bozenko2, S.M. Sitdikova1, M.S. Kalishjan1, H.M. Treshalina'

'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow 115478, Russia; 2Russian Scientific Center of Roengenology and Radiology; 86 Profsoyuznaya Str., Moscow 117997, Russia

Introduction. Within constructed of molecules with a pathogenetic orientation to a tumor cell a row the chimeric of the peptides including the functional fragment with the amino-acid sequence from the SEQ ID NO group is created: 1 — SEQ ID NO: 17 and transport sequence. These peptides are capable at target delivery in the cells to find short functional domains in proteins regulators of various functions. Among them there is MM-D37K blocking G1 phase and inducing an apoptosis in the human tumor cells, including a colorectal cancer HCT-116. It is considered as the potential antineoplastic agent with the corresponding stages of studying.

Aim. The aim of the study was an investigation of the MM-D37K dose characteristics at the parenteral administration on the human subcutaneous (s. c.) colorectal cancer xenografts HCT-116.

Research problems. 1. Studying of the efficacy of MM-D37K in the dose range at multiple parenteral administration to the Balb/c nude mice with HCT-116. 2. Tolerance control of MM-D37K at multiple parenteral administration to the Balb/c nude mice with HCT-116. Materials and methods. Researches of a chimeric peptide MM-D37K (an inhibitor the cyclin-dependent protein kinases 4/6) are conducted on hypodermic s. c. colorectal cancer xenografts HCT-116 at immunodeficient Balb/c nude mice when using reference criteria assessment of efficacy and tolerance under adequate statistical processing of the results with use of nonparametric Mann—Whitney U-test.

Results. It is shown that MM-D37K in single doses of 5 or 10 mg/kg at s. c. or intravenous (i. v.) 5-fold administration in 48 h (total doses 25 or 50 mg/kg) significantly and authentically inhibits the tumor growth within 9 days after the treatment on the level of T/C = 27—43 % (p <0.05) (reference criterion of T/C <42 %) at a well tolerance. At both routes of administration was observed the dose dependence foe efficacy as on T/C and on the maximal effect achievement. There was revealed big deviation of the tumor after the individual sensitivity to a peptide (variability of the tumor size at a larger dose by the i. v. administration).

Conclusion. The obtained data confirm the sufficient therapeutic range of a MM-D37K chimeric peptide in vivo on the model of a human colorectal cancer HCT-116 allowing to obtained significant reliable anticancer effect at parenteral multiple administrations in the double range of therapeutically doses.

Key words: chimeric peptide MM-D37K, human colorectal cancer, mice Balb/c nude, efficacy, tolerance

Введение

В конце XX — начале XXI вв. появились первые экспериментальные исследования ингибиторов циклинзависимых киназ (cyclin-dependent protein kinases — CDK), среди которых наибольший интерес в качестве перспективной мишени для онкологии вызвали специфичные ингибиторы CDK4/6, приводящие к восстановлению контроля клеточного цикла и блокаде пролиферации опухолевых клеток. Утрата контроля клеточного цикла, характерная для злокачественных новообразований, сопряжена с гиперактивацией CDK4/6, что влечет за собой потерю контроля над пролиферацией с инициацией клеточной прогрессии от фазы роста (G1) до фаз, связанных с репликацией ДНК (S) [1—4]. Практическая значимость этих исследований связана с большой частотой (40—60 %) мутаций или гиперметилирования промоторов генов-ингибиторов CDK при злокачественном росте. Дополнительным основанием для поиска технологий применения естественных белковых ингибиторов пролиферации стало открытие коротких последовательностей аминокислот (n = 15—30), способных выполнять векторные (транспортные) функции в отношении пептидных последовательностей и соединений другой химической природы (РНК, ДНК). Одним из путей создания ингибиторов CDK стало использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов. Появилась технология пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, весьма перспективная ввиду слабой иммуногенности и возможности переноса достаточно крупных молекул. Таким образом, соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных

доменов в белках-регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул, имеющих патогенетическую направленность. Так были созданы химерные пептиды, включающие функциональный фрагмент с аминокислотной последовательностью из группы SEQ ID NO: 1 — SEQ ID NO: 17 и транспортную последовательность [5—10].

Первый препарат палбоциклиб (Ибранса), созданный на основе CDK4/6-специфического ингибитора, показал заметный противоопухолевый эффект в опытах на культурах клеток и исследованиях на животных, особенно по отношению к карциномам люминального типа (ER+/HER2). В настоящее время на разных стадиях разработки и клинических испытаний находятся несколько экспериментальных ингибиторов CDK, например, абемациклиб и рибо-циклиб. Поскольку спектр их потенциального применения широк, CDK представляются перспективной мишенью для онкологии [11].

В русле этого направления были созданы технологически адекватный оригинальный химерный пептид D37K со свойствами ингибиторов CDK4/6 и его модифицированный аналог MM-D37K, с 2014 г. проходящий клинические испытания у онкологических пациентов в РФ [12]. По данным in vitro, благодаря блокированию клеточного цикла в фазе G1 MM-D37K индуцирует апоптоз в клетках различных опухолей человека, в том числе колоректального рака HCT-116. Также показано, что химерные пептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1 — SEQ ID NO: 17 усиливают цитотоксичность цитостатиков, в том числе паклитаксела (Таксола) [13—15].

Эти сведения послужили основанием для углубленного доклинического изучения MM-D37K in vivo на модели колоректального рака человека

HTC-116 с оценкой in vitro синергизма в комбинации с паклитакселом (Таксолом). Соответственно цель настоящего исследования состояла в изучении дозо-вых характеристик MM-D37K при парентеральном введении на подкожных (п/к) ксенографтах колорек-тального рака человека in vivo.

Задачи: изучить эффективность MM-D37K в диапазоне доз при многократном п/к или внутривенном (в/в) введении мышам Balb/c nude c п/к ксено-графтами колоректального рака человека HCT-116, оценить переносимость MM-D37K.

Материалы и методы

Животные

Исследование проводилось на 41 мыши Balb/c nude (самки в возрасте 8 нед с массой тела 20—22 г разведения ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) Минздрава России). Мышей содержали в специализированном однокоридорном кондиционированном отсеке на брикетированном стерильном корме (ООО «МЭСТ», Москва), стерильной воде и стерильной бумажной подстилке (марка Е2) при нормированном температурно-влажностном режиме с соблюдением требований, предъявляемых к конвенциональным животным [16].

опухолевый материал

Штамм колоректального рака человека HCT-116 получен из коллекции опухолевых штаммов человека ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России [17]. Для получения стандартного прививочного материала штамм пассирован п/к 2 раза по 50 мг опухолевой взвеси в 0,5 мл питательной среды № 199. Для проведения эксперимента взят 3-й пассаж, который использован в качестве опухолевого материала для билатеральной трансплантации.

Агент

Субстанция химерного пептида ММ^37К — белый кристаллический порошок во флаконе [14, 15].

таблица 1. Динамика роста подкожных ксенографтов колоректального рака человека HCT-116 под действием MM-D37K

Для введения мышам субстанцию растворяли в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида до нужных концентраций и использовали ex tempore. Условия проведения экспериментов В опыте 5 групп мышей: 1 группа использована для контроля роста опухоли (КРО) без лечения (n = 5, опухолей 10), 4 группы (n = 9, опухолей 18) получали лечение MM-D37K. Агент вводили п/к или в/в в разовых дозах 5 или 10 мг/кг (суммарные дозы 25 или 50 мг/кг соответственно) 5-кратным курсом на 2, 4, 6, 8 и 10-е сутки после трансплантации опухоли. оценка противоопухолевого эффекта Использовали стандартный показатель торможения роста опухоли — Т/С, % (treatment/control), критерий Т/С <42 %. Для расчета показателя 2 раза измеряли 3 взаимно перпендикулярных диаметра каждого опухолевого узла для расчета индивидуальных и средних объемов (Vp) в течение 9 дней после окончания лечения [18].

Статистическая обработка данных Для измерений использовали штангенциркуль (Mitutoyo, Япония), соединенный при помощи USB-порта со статистической программой Microsoft Office Excel (Windows 7) для расчета непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Достоверными считали различия при p <0,05. В иллюстрациях приведены критические значения для уровня значимости, равного 0,05.

оценка переносимости

О переносимости MM-D37K судили по качеству жизни мышей с опухолью. В период наблюдения оценивали состояние и поведение мышей, следили за возможной гибелью от токсичности, павших и умерщвленных мышей подвергали аутопсии с оценкой наличия патологических изменений внутренних органов.

Завершение эксперимента

На 24-е сутки после перевивки опухоли и выполнения 6 измерений опухолей мыши были умерщвле-

Группа Путь число опухолей, n* доза, мг/кг Средний объем опухоли (мм3) на сутки после трансплантации

введения разовая суммар ная** 11 15 19

Контроль роста опухоли* внутривенно 10 142± 100 398 ± 222 810±735

подкожно 18 5 25 71 ± 63 190± 176 303 ± 254

ММ^37К 10 50 77*** 133 ± 80 248 ± 229

внутривенно 18 5 25 74 ± 71 173± 171 595***

10 50 67*** 130 ± 113 222***

Примечание. *Билатеральная трансплантация; **введение на 2-10-е сутки после перевивки; ***разброс больше средней.

Таблица 2. Ингибированиероста подкожных ксенографтов колоректального рака человека НСТ-116под действием ММ-D37K

Препарат Путь Доза, мг/кг Т/С, % на сутки после окончания лечения

введения разовая суммарная 1 5 9

подкожно 5 25 50 48 32*

ММ^37К 10 50 52 34* 31*

внутривенно 5 25 52 44 41

10 50 47 33 27

Примечание. *р <0,05.

■

1600

1400 1200

1000

3 800 600

400 К" 1 группа:1 группа:2

200 0 ^^ 2 __________

группа:3 группа:4

11 15 19 23 День после перевивки опухоли ц группа:5

Рис. 1. Динамика среднего объема подкожных узлов колоректального рака человека НСТ-116 после 5-кратного курса введения ММ-D37K: группа 1 — группа контроля роста опухоли; группа 2 — MM-D37K 25 мг/кг подкожно; группа 3 — MM-D37K 50 мг/кг подкожно; группа 4 - MM-D37K25мг/кг внутривенно; группа 5 - MM-D37K 50мг/кг внутривенно

ны с применением гуманных методов, разрешенных в РФ [19, 20].

от V, = 142 ± 100 мм3 до V, = 890 ± 860 мм3. Терапия ММ^37К в суммарной дозе 50 мг/кг показала относительно лучший противоопухолевый эффект, Т/Сш1п = 27—31 %, наступавший при в/в введении на 4 дня раньше (5 суток против 9 суток). Большой разброс размеров опухоли при большой дозировке, особенно при в/в введении, может быть следствием индивидуальной чувствительности к пептиду (табл. 1, 2; рис. 1).

Независимо от этого статистическая обработка полученных данных показала значимую достоверность выявленных отличий от группы КРО (табл. 3, 4).

Анализ переносимости многократной парентеральной терапии ММ^37К показал отсутствие каких-либо изменений в состоянии и поведении подопытных мышей в процессе и после введения ММ^37К, а также патологических изменений при аутопсии умерщвленных животных независимо от пути введения и величины примененной дозы в изученном диапазоне.

Результаты исследования

Показано, что колоректальный рак человека НСТ-116 без лечения (группа КРО) отличается умеренной скоростью роста. В период с 11-го по 23-й день роста опухолевые узлы увеличились в 6,7 раза

Заключение

Проведенные исследования показали, что химерный пептид ММ^37К, ингибитор CDK4/6, в разовых дозах 5 или 10 мг/кг при п/к или в/в 5-кратном через 48 ч введении (суммарные дозы

Таблица 3. Сравнение независимых переменных показателей динамики роста подкожных ксенографтов колоректального рака человека НСТ-116 под действием ММ^37К

А. Критерий Уилкоксона (обработка 2_17_11_10^а) Б. Критерий знаков (обработка 2_17_11_10^а)

Сравниваемые группы мышей Число опухолей, п Т Ъ Р* Сравниваемые группы мышей число опухолей, п Процент Ъ Р*

Группа 1 и группа 2 17 4,0 3,309361 0,000935 Группа 1 и группа 2 16 12,5 2,75 0,00596

Группа 1 и группа 3 13 7,0 2,510287 0,012064 Группа 1 и группа 3 12 8,33333 2,598076 0,009375

Группа 1 и группа 4 17 5,0 3,257652 0,001123 Группа 1 и группа 4 16 6,25 3,25 0,001154

Группа 1 и группа 5 16 8,0 2,953402 0,003143 Группа 1 и группа 5 15 20,0 2,065591 0,038867

Примечание. *Выделенные критерии значимы на уровне р <0,05.

таблица 4. Сравнение морфометрических показателей эффективности в группах MM—D37Kи контроля роста опухоли с помощью непараметрического и-критерия Манна—Уитни

MM-D37K 25 мг/кг подкожно MM-D37K 50 мг/кг подкожно, 19-й день роста опухоли

Группа Суммарный ранг u Z р =* n Группа Суммарный ранг u Z р =* n

Группа 1 22,0 6,0 0,00 2,12132 0,033896 4 3 Группа 1 26,0 10,0 0,00 2,309401 0,020922 4 4

MM-D37K 25 мг/кг внутривенно MM-D37K 50 мг/кг внутривенно

Группа Суммарный ранг u Z р =* n Группа Суммарный ранг u Z р =* n

Группа 1 28,0 17,0 2,0 1,959592 0,050044 4 5 Группа 1 26,0 10,0 0,00 2,309401 0,020922 4 4

Примечание. *Выделенные критерии значимы на уровнеp <0,05.

25 или 50 мг/кг соответственно) значимо и достоверно ингибирует рост п/к ксенографтов колоректального рака человека HCT-116 при удовлетворительной переносимости.

Ингибирующее действие регистрируется на уровне Т/С = 27—41 % (p <0,05) (стандартный критерий Т/С <42 %). Выявлена слабая дозовая зависимость как по Т/С, так и по срокам достижения максимального эффекта после окончания курса (от 5 до 9 сут),

особенно при в/в введении при индивидуальной чувствительности к пептиду (вариабельность размеров опухолевых узлов в отдаленные сроки).

Полученные данные in vivo свидетельствуют о достаточной широте терапевтического действия химерного пептида MM-D37K на модели колоректального рака человека HCT-116, позволяющей получить значимый достоверный противоопухолевый эффект при 2-кратном диапазоне действующих доз.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Hirama T., Koeffler H.P. Role

of the cyclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer. Blood 1995;86(3):841-54. PMID: 7620180.

2. Aleem E., Kiyokawa H., Kaldis P. CDC2-cyclin E complexes regulate

the G1/S phase transition. Nat Cell Biol 2005;7(8):831-36. PMID: 16007079. DOI: 10.1038/ncb1284.

3. Shapiro G.I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol 2006;24(11):1770-83. PMID: 16603719.

DOI: 10.1200/JC0.2005.03.7689.

4. Самусенко А.В. Нарушения клеточного цикла и старение клеток в ответ на повреждение ДНК. Вопросы онкологии 2009;55(5):521-7.

PMID: 20020645.

5. Derossi D., Joliot A., Chassaing G., Prochiantz A. The 3rd helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.

J Biol Chem 1994;269(14):10444-50. PMID: 8144628.

6. Morris M.C., Depollier J., Mery J. et al. A peptides carrier for the delivery

of biologically active proteins in

mammalian cells. Nat Biotechnology

2001;19(12):1173-6.

PMID: 11731788. DOI: 10.1038/

nbt1201-1173.

7. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г. и др. Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов цикли-новых киназ. Вопросы онкологии 2007;53(4):448-52. PMID:17969409.

8. Finn R.S., Dering J., Conklin D. et al. PD 0332991, a selective cyclin-D-kinase 4/6 inhibitor, preferentially inhibits proliferation of luminal estrogen receptor-positive human breast cancer cell lines in vitro. Breast Cancer Res 2009;11(5):R77.

DOI: 10.1186/bcr2419.

9. de Araujo C.B., Russo L.C., Castro L.M. et al. A novel intracellular peptide derived from G1/S cyclin D2 induces cell death. J Biol Chem 2014;289(24):16711-26. PMID 24764300.

10. Bhattacharya S., Ray R.M., Johnson L.R. Cyclin-dependent kinases regulate apoptosis of intestinal epithelial cells. Apoptosis 2014;19(3):451-66. DOI: 10.1007/s10495-013-0942-3.

11. Aleem E., Arceci R.J. Targeting cell cycle regulators in hematologic malignancies. Front Cell Dev Biol 2015;3:16. PMID: 25914884.

DOI: 10.3389/fcell.2015.00016.

12. Имянитов Е.Н. Эволюция системного лечения гормонозависимого рака молочной железы: от чередования препаратов к комбинированной терапии. Опухоли женской репродуктивной системы 2016;12(2): 46-51.

13. Bozhenko V.K., Kulinich T.M., Kudinova E.A. et al. New targeted anti CDK4/6 peptide MM-D37K. J Clin Oncol 2013;31:e13545.

14. Патент РФ № 2435783. 2011 г. Боженко В.К. Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний.

15. Патент PCT/RU2014/000199 WO2014163535 A1. 2014 г. Боженко В.К. Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний.

16. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши разведения РОНЦ

им. Н.Н. Блохина РАМН. Возможно-

Оригинальные статьи 41

сти использования. М.: Издательская группа РОНЦ, 2010. С. 16.

17. Трещалина Е.М. Коллекция штаммов опухолей человека. Под ред. М.И. Давыдова. М.: Практическая медицина, 2009. С. 88-90.

18. Трещалина Е.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекар-

ственньж средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственный средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. С. 642-657.

19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. ЕЭС, Страсбург, 1985. Ланималогия 1993;1:29.

20. Большаков О.П. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика 2002;9:1-15. РМГО: 27296126.