CC BY
71
УДК 616-002.3-085.831:615.849.19
P.I. Tolstych1, V.A. Derbenyov1,1.Y. Kuleshov1, A.M. Azimshoev1, V.I. Eliseenko1, A.B. Solovyova2, A.V. Ivanov3, N.S. Melic-Nubarov4, S.N. Makoev1, E.F. Shin1
THEORETICAL AND PRACTICAL ASPECTS OF LASER PHOTOCHEMISTRY IN INFECTED WOUNDS MANAGEMENT
JLaser medicine State Research Center, Moscow 2N.N. Semenov Institute of Chemical Physics RAS, Moscow 3N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 4M. Lomonosov Moscow State University
ABSTRACT
A brief characteristics of modern photosensitizers for treatment of some surgical and cancer diseases have been proposed. We have observed that the use of immobilized photoditazine on amphiphilic polymers allows to increase considerably procedure's efficiency. We have confirmed this by treatment of 130 patients with infected wounds of various genesis. We conclude that photodynamic therapy is highly effective and pathogenetically proved method in management of infected wounds.
Key words: photosensitizers, photoditazine, photodynamic therapy.
П.И. Толстых1, B.A. Дербенев1, И.Ю. Кулешов1, A.М. Aзuмшoeв1, В.И. Елисеенко1, A.Б. Соловьева2, A.B. Иванов3, H.C. Мелик^убаров4, C.H. Макоев1, Е.Ф. Шин1
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛАЗЕРНОЙ ФОТОХИМИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНЫХ РАН
ФГУ ГHЦлазерной медицины Росздрава, Москва 2Институт химической физики им. H.H. Ceмeнoвa PAH, Москва 3ГУ POHЦ им. H.H. Блохина PAMH, Москва 4МГУ им. M.B. Ломоносова, Москва
PEЗЮME
В статье дана краткая характеристика современных фотосенсибилизаторов для лечения ряда онкологических и хирургических заболеваний. Отмечено, что использование иммобилизированного фотодитазина на амфифильных полимерах позволяет на порядок увеличить эффективность процедур ФДT гнойных ран. Эффективность ФДT гнойных ран подтверждена экспериментально и на опыте лечения 130 больных гнойными ранами различного генеза. Метод ФДT патогенетически обоснован и высокоэффективен.
Ключевые слова: фотосенсибилизаторы, фотодитазин, фотодинамическая терапия.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важных составляющих лазерной фотохимии является фотодинамическая терапия (ФДТ). В настоящее время методы ФДТ нашли достаточно широкое применение при лечении ряда онкологических и хирургических заболеваний. Принцип ФДТ основан на использовании фундаментальных свойств порфириновых фотосенсибилизаторов (ПФС) — способности избирательно накапливаться в опухолевых и патологически измененных тканях, а также в клетках бактерий и вирусов и под воздействием освещения генерировать активные формы кислорода [3; 7]. Активный кислород (главным образом в синглетном Ю2 состоянии) запускает каскад окислительных процессов, приводящих к гибели клеток.
Начиная с 70-х годов XX века, американскими учеными в медицинскую практику был внедрен фотосенсибилизатор фотофрин на основе производных гематопорфиринов. На той же основе в разные годы были созданы препараты фотосан (Германия), фотогем (Россия). Были получены удовлетворительные показатели эффективности ФДТ при некоторых заболеваниях, таких, как стенозирующий рак пищевода, рак пищевода Баррета, опухоли мочевого пузыря. Однако фотосенсибилизаторы на основе гематопорфиринов имеют целый ряд серьезных недостатков:
• относительно низкую избирательность накопления в опухолях (тумаротропность) по сравнению со здоровой тканью (превышение в 2 - 3 раза), что является причи-
ной возможного травмирования здоровых тканей при проведении ФДТ;
• относительно низкую эффективность преобразования энергии излучения в цитотоксические продукты (свободные радикалы, активные формы кислорода) при длительном времени выведения фотосенсибилизатора из организма (от 4 до 6 нед), что вынуждает пациента находиться в этот период в затемненном помещении для исключения ожогов кожи из-за ее фотосенсибилизации.
Поиски решения проблем, выявившихся при использовании фотосенсибилизаторов на основе гематопорфиринов, привели к формулированию требований к свойствам фотосенсибилизаторов 2-го поколения. Их можно сформулировать следующим образом:
• высокая тумаротропность по отношению к опухолевым клеткам при незначительном накоплении в здоровых тканях;
• низкая токсичность и быстрое выведение из организма;
• устойчивость при введении в организм, а также при хранении;
• наличие люминесценции для надежной диагностики опухоли;
• максимум фотопоглощения в области 660 - 900 нм при повышенном квантовом выходе синглетного кислорода как фактора, наиболее эффективно воздействующего на опухоли.
Перспективной основой для создания фотосенсибилизаторов 2-го поколения оказались хлорины и их производные, максимально удовлетворяющие приведенным требованиям. В настоящее время лучшим из известных фотосенсибилизаторов является фотодитазин — препарат отечественной разработки на основе хлорина Е6 (патенты № 2144538, № 2276976). Фотодитазин практически нетоксичен (LDjo = 168 мг/кг при терапевтической дозе 0,7 - 1,4 мг/кг), имеет полосу поглощения 662 нм с достаточно высоким квантовым выходом синглетного кислорода, обладает высокой тумаро-тропностью. При этом фотосенсибилизация кожи настолько мала, что исключает ожоги от воздействия солнечного света. Время выведения препарата из организма составляет не более 26 ч. Приведенные показатели существенно отличают фотодитазин от других фотосенсибилизаторов на основе гематопорфиринов, что является основой его высокой клинической эффективности. По данным литературы терапевтический эффект достигается в 62 - 83 % случаев в зависимости от вида и стадии заболевания [5].
При исследовании механизмов реакций in vivo, протекающих в организме в процессе процедуры ФДТ и после ее завершения, установлено, что в дополнение к прямому повреждению мембран и других клеточных структур свободными радикалами происходит выделение клетками воспалительных и иммунных медиаторов. Среди них идентифицированы цитокины ИЛ-6, ИЛ-2, фактор некроза опухолей, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, факторы роста и другие иммунорегуляторы, компоненты каскада комплемента, вазоактивные субстанции. Они, в свою очередь, запускают процессы, ответственные за дальнейшее развитие цитотоксического эффекта. Возрастающее число фактов указывает, что полное разрушение опухоли в результате ФДТ не обходится без участия иммунной системы [2;
4-6]. Воспалительный процесс при ФДТ может послужить инициатором формирования эффективного иммунитета, в том числе противоопухолевого или противовирусного.
Все же одной из серьезных проблем фотодинамической терапии (ФДТ) при лечении новообразований остается повышение селективности накопления фотосенсибилизаторов (ФС) в пораженных тканях и органах и снижение терапевтической дозы вводимых препаратов. При внутривенном способе введения большинства ФС накопление достаточной концентрации препарата в очаге поражения обычно сопровождается его высоким содержанием во всем организме, что является причиной длительного токсического эффекта и опасности экспозиции больного на свету.
В этой связи перспективным способом применения ФДТ может оказаться использование фотосенсибилизатора в виде комплексов с низкотоксичными амфифильными полимерами [8]. Нами была предложена лекарственная форма препарата для ФДТ опухолей, предусматривающая локальное использование ФС, в том числе фотодитазина, иммобилизованных на амфифильном полимерном носителе (патент РФ № 2314806), что позволяет значительно снизить лекарственную дозу ПФС и улучшить лечебный эффект, повышая биологическую доступность препарата.
Исследования показали, что ряд амфифильных полимеров (на основе алифатических простых или сложных эфиров и спиртов) образуют комплексы с порфиринами в водной и органической фазе, в которых порфириновые фотосенсибилизаторы (ПФС) находятся в виде агрегатов размерами ~ 100
- 300 нм. Оказалось, что использование таких иммобилизованных систем позволяет на порядок увеличивать эффективность ФДТ и тем самым значительно снизить концентрации используемых ФС, что ведет к снижению терапевтической дозы препарата и побочных токсических осложнений.
Эксперименты in vitro на культурах опухолевых клеток человека (аденокарцинома молочной железы HBL-100, ЛАК-фаза 22 - 24 ч, и карцинома яичника Skov-З, ЛАК-фаза 26 - 30 ч), нормальных и раковых мышиных фибробластах NIH/3T3 и лабораторных животных показали, что использование комплексов ПФС-АП при воздействии на опухоли позволяет не только снизить концентрации используемых ФС, но и в ряде случаев уменьшить количество отдаленных метастазов у лабораторных животных. Было установлено, что терапевтическая эффективность комплексов при воздействии на опухоли разной природы определяется, в первую очередь, природой полимера. Исследовано 14 полимеров разной молекулярной массы и химической природы. Наиболее эффективными оказались сополимеры этиленок-сидов и пропиленоксидов, полиспирты с мол. массами ~ 10
- 20 тыс. Da, а также их смеси.
Приведенные данные по использованию фотосенсибилизатора в онкологической практике позволяют рассматривать данный препарат как весьма эффективный для применения и в хирургической практике. Была исследована эффективность таких систем при лечении ран у крыс. Оказалось, что гель, содержащий один из сополимеров и фотодитазин (0,1 мг на 1 мл геля), вызывает заживление гнойных ран в 1,5 раза быстрее по сравнению с традиционным лечением антисептиком хлоргексидином и в 1,2 раза быстрее по сравнению с терапией коммерческим препаратом Фотодитазин-гель (1 мг на 1 мл геля).
В клинической практике гель на основе амфифильных полимеров и фотодитазина для лечения гнойных ран различного генеза по данным доступной литературы и патентной информации до настоящего времени не применялся. Нами была проведена оценка результатов лечения 130 больных гнойными ранами, сформировавшимися после некрэкто-мии, хирургической обработки абсцессов и т.д.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Всего лечились 130 больных, 70 (53,8 %) мужчин и 60 (46,2 %) женщин трудоспособного возраста. Все пациенты были в возрасте от 30 до 60 лет. Длительность заболевания от момента заболевания до момента госпитализации составила от 2 до 10 сут. До поступления в поликлиниках были прооперированы 10 человек (7,7 %). При госпитализации общее состояние 87 пациентов (66,9 %) было удовлетворительное, 31 (23,9 %) больного — средней тяжести, а в 12 (9,2 %) случаях расценено как тяжелое.
В качестве фотосенсибилизатора использовали фотодитазин (диглутаминовая соль хлорина Е6) в виде 1%-ного водного раствора или в составе геля. Раствор фотодитазина и Фотодитазин-гель, содержащий 1 % фотодитазина, предоставлены фирмой «Вета гранд».
Исследуемый комплекс фотодитазина с амфифильным полимером представлял собой 0,1%-ный раствор фотоди-тазина в плюронике F127 (плюроник производства фирмы «Ва81>>).
Облучение проводили лазером «Аткус-10» с длиной волны 660 нм.
Локализация очагов гнойно-некротических поражений мягких тканей была различной. В зависимости от расположения в мягких тканях гнойно-воспалительного процесса послеоперационные раны были разделены на поверхностные и глубокие. Поверхностные раны составляли 60 % (78 наблюдений), глубокие — 40 % (52). Наиболее часто гнойные раны мягких тканей в обеих группах располагались на нижних конечностях - у 64 (49,3 %) пациентов. На верхних конечностях раны располагались у 31 (23,8 %), на туловище у 20 (15,4 %) больных, в области головы и шеи — у 15 (11,5 %). По нозологическим формам у больных преобладали флегмоны и абсцессы различной локализации — 94 (72,3 %).
После постановки диагноза и показаний к оперативному лечению производили хирургическое вмешательство в следующие сроки: в день поступления 81 (62,3 %), на следующие сутки — 21 (16,6 %). Через сутки после ФДТ уровень микробной обсемененности в ранах снижался на 3 - 4 порядка, в 50 % случаев из раны исчезали грамположительные бактерии — стафилококки, грамотрицательные бактерии сохранялись дольше.
Все больные в зависимости от примененного местного метода лечения ран были распределены на 4 группы (табл. 1).
В 1-й контрольной группе (лечение хлоргексидином) обследованы 35 пациентов, во 2-й группе (20 пациентов) в лечении применяли 1%-ный раствор фотодитазина. Марлевую салфетку, смоченную 1%-ным раствором фотодитазина, накладывали на рану на 90 - 120 мин, затем раневую поверхность облучали светом лазерного аппарата «АТКУС 2» (длина волны 660 нм) при постоянной мощности 1 Вт/см2 с плотностью энергии 25 - 30 Дж/см2, время воздействия за-
висело от площади раневой поверхности. При лечении 30 пациентов 3-й группы использовали коммерческий препарат 1%-ный Фотодитазин-гель, который накладывали на рану на 90 - 120 мин, а затем освещали рану аналогично методике в предыдущей группе. В 4-й группе из 45 пациентов для ФДТ использовали 0,1%-ный наноразмерный комплекс ФД-АП (плюроник F127), параметры экспозиции и воздействия лазерным светом были аналогичны предыдущим группам.
Таблица 1
Распределение больных в зависимости от метода местного лечения ран
Группы больных Методы лечения Количество больных
Абс. число %
1-я Традиционное (контрольная группа) 35 26,9
2-я ФДТ с использованием 1%-ного раствора фотодитазина в димексиде 20 15,4
3-я ФДТ с использованием 1%-ного фотодитазина в коммерческом геле 30 23,1
4-я Комплекс фотодитазин-АП 45 34,6
Всего 130 100
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки результатов лечения изучена динамика раневого процесса в зависимости от метода проведенного местного лечения (табл. 2). Для больных, которым выполняли ФДТ, была характерна более быстрая санация гнойных ран по сравнению с контрольной группой.
Таблица 2
Динамика раневого процесса в зависимости от варианта лечения
Метод лечения Средние сроки (сут)
Очищения Появления грануляций Краевой эпители- зации
Традиционный 6,5 ± 0,7 7,8 ± 0,6 7,8 ± 1,2
ФДТ с использованием 1%-ного раствора фотодитазина в 25%-ном растворе димексида 4,1 ± 0,5* 4,7 ± 0,4* 6,1 ± 0,4*
ФДТ с использованием 1%-ного фотодитазина в геле 3,6 ± 0,3** 3,6 ± 0,3** 5,1 ± 0,5**
Комплекс плюроник-фотодитазин, содержание фотодитазина — 0,1% 2,3 ± 0,5*** 2,4 ± 0,5*** 4,0 ± 0,7***
*р < 0,05 — по сравнению с традиционным методом; **р < 0,05 — по сравнению с использованием 1%-ного раствора фотодитазина; ***р < 0,05 — по сравнению с использованием 1%-ного фотодитазина в геле
Как показано в табл. 2, сроки очищения гнойных ран, появления грануляций и начала краевой эпителизации при ис-
пользовании геля с комплексом ФД-АП (содержащего 0,1 % фотодитазина) в среднем в 1,5 - 2,3 раза лучше, чем в контрольной группе и достоверно меньше сроков при использовании коммерческого препарата Фотодитазин-гель. Быстрый переход раневого процесса в регенераторно-репаративную фазу способствует сокращению сроков заживления гнойных ран в 1,5 - 2 раза по сравнению с традиционным методом. Данные клинического исследования были подтверждены результатами цитологических и гистохимических исследований.
Гистологические и гистохимическое изучение биопта-тов ран до начала лечения показали, что морфологическая картина характеризуется наличием гнойно-некротического экссудата, богатого микрофлорой с выраженным микро-циркуляторными нарушениями (внутрисосудистый стаз и сладж эритроцитов, микротромбы, лейкостазы, эндо-и пери-васкулиты, деструкция и десквамация эндотелия, повышенная проницаемость стенок и др.), а также отеком, обильной нейтрофильной инфильтрацией, геморрагиями, дистрофическими и некротическими изменениями клеток (фибро-бластов, моноцитов, эпидермиса). Фагоцитарная активность нейтрофилов резко снижена, макрофагальная реакция и пролиферация фибробластов угнетены, грануляционная ткань отсутствовала или обнаруживалась в виде небольших очагов и имела незрелый характер.
Цитологическое исследование раневого экссудата на 3-и, 7-е и 10-е сут после начала традиционного лечения показало замедленное очищение ран от бактериальной инфекции и некротического детрита, торможение перехода от незавершенного фагоцитоза к завершенному, от преобладания дистрофических и некротических форм нейтрофилов к неизмененным формам. Это свидетельствует о торможении перехода некротически воспалительной фазы раневого процесса в воспалительную и репаративную, что проявляется в образовании небольшого количества макрофагов с активной фагоцитарной функцией и фибробластов, а также задержка процессов эпителизации ран.
По данным гистологических исследований при традиционном лечении через 7 сут после операции имело место недостаточное очищение раневой поверхности от гнойнонекротического экссудата, сохранялись микроциркуляторные изменения, отек, нейтрофильная инфильтрация, лимфостаз
и васкулит. Угнетение макрофагальной реакции в ранах задерживает очищение раны от продуктов распада и микрофлоры, а также выработку цитокининов, стимулирующих пролиферацию фибробластов и синтез коллагена. Это тормозит формирование и созревание грануляционной ткани, развитие краевой эпителизации раневой поверхности, которая отмечалась в биоптатах только к 14 сут. Регенерирующий эпителий на 14-е сут имеет незрелый характер, плохо связан с подлежащей тканью и легко отторгается.
Под воздействием фотодинамической терапии происходит интенсификация раневого процесса. Это проявляется на 5-е - 7-е сут значительным снижением воспалительных проявлений: уменьшением отека, нормализацией проницаемости стенок микрососудов, разрешением сладжа эритроцитов и агрегации тромбоцитов, усилением фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов к бактериям, активи-ровацией макрофагальной реакции, пролиферации фибро-бластов и новообразованных капилляров. На 7-е - 10-е сут выявлено фиброзирование слоя горизонтальных фибробла-стов с превращением последних в малоактивные фиброциты, значительное уменьшение числа клеток воспалительной реакции — нейтрофилов и макрофагов, нормализация системы микроциркуляторного русла, активная эпителизация раневой поверхности с формированием зрелого эпителиального пласта.
Микробиологические исследования показали, что до начала лечения все больные имели высокий уровень обсе-мененности раневой поверхности (7,4 ± 0,2 LgКОЕ/см2), микробная флора отличалась разнообразием штаммов: S. aureus,
S. epidermidis, P aeruginosa, E. coli, Proteus mirabilis. На 3-и сут после фотодинамической терапии выявлено значительное снижение микробной обсемененности гнойных ран до 2,0 ± 0,3 LgTOE/см2.
Для иллюстрации эффективности воздействия ФДТ с использованием комплексов ФД-АП, содержащих 0,1 % фотодитазина, на раневой процесс приводим следующий пример.
Больной М. 35 лет поступил с диагнозом карбункул лопаточной области, сахарный диабет 2-го типа, декомпенсация. На рис. 1 изображена гнойно-некротическая рана после некроэктомии на 2-е сут; рис. 2 — на 5-е сут после ФДТ с гелем, содержащим 1%-ный наноразмерный
Рис. 1. Исходное состояние после некроэктомии
Рис. 1. Исходное состояние после некроэктомии
Рис. 3. Отдаленные результаты лечения
комплекс ФД-АП, рана очистилась от раневого детрита, гранулировала. На рис. 3 изображена рана после аутодермопластики и эпителизации на 30-е сут от начала лечения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты лечения гнойных ран различного генеза с использованием препаратов на основе фотодитазина доказали, что разработанный метод ФДТ с использованием геля на основе наноразмерных комплексов амфифильных полимеров и фотодитазина по данным клинических, морфологических, микробиологических методов исследований патогенетически вполне обоснован, высокоэффективен и по лечебной эффективности превосходит традиционные методы, позволяет сократить сроки заживления и эпителизации в 1,5 - 2 раза с хорошим функциональным и косметическим эффектом.
Работа была выполнена при поддержке РФФИ (грант
02-07-00066).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гелъфонд М.Л. Возможности фотодинамической терапии в онколгической практике // Физическая медицина. - 2005. - 7(1). - С. 8-11.
2. Гелъфонд М.Л. Предварительные результаты применения фотомодификации крови, сенсибилизированной
фотодитазином, в лечении распространенных форм злокачественных новообразований // Физическая медицина. - 2005. - 7(1). - С. 12-16.
3. Странадко Е.Ф. Механизмы действия фотодинамической терапии // Российский онкологический журнал. - 2000. - 4. - С. 52-56.
4. Abe K., Kurakin A., Mohseni-Maybodi M. et al. The complexity of TNF related apoptosis-inducing ligand // Ann N Y Acad Sci. - 2000. - 926. - P. 52-63.
5. Agarwal R., Athar M. Bickers D.R., Mukhtar H. Evidence for the involvement of singlet oxygen in the photodestruction by chloroaluminum phthalocyanine tetrasul-fonate // Biochem Biophys Res Commun. - 1990. - 173.
- P. 34-41.
6. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers // Photochem Photobiol. - 1996. - 64. - P. 469-485.
7. Dougherty T.J. An update on photodynamic therapy applications // J Clin Laser Med Surg. - 2002. - 20. - Р.
3-7.
8. Fabris C., Valduga G., MiottoG. et al. Photosensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis // Cancer Res. - 2001. -61. - P. 749-750.
Поступила 01.07.2008.
