CC BY
107
637.146
ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЛАКТООЛИГОСАХАРИДОВ
А.Г. ХРАМЦОВ, А.Б. РОДНАЯ, А.Д. ЛОДЫГИН, С.А. РЯБЦЕВА
Северо-Кавказский государственный технический университет,
355029, г. Ставрополь, пр-т Кулакова, 2; электронная почта: [email protected]
Представлены данные о динамике патентования способов получения галактоолигосахаридов по странам и направлениям. Проведен анализ достоинств и недостатков разных способов, выявлены тенденции развития технологии галак-тоолигосахаридов.
Ключевые слова: галактоолигосахариды, пребиотики, способы получения, патентование.
Производные лактозы, галактоолигосахариды (ГОС), могут быть получены в результате реакции трансгалактозилирования. По химической структуре ГОС - это олигосахариды, включающие от 1 до 7 остатков галактозы, соединенных с остатком глюкозы. Общая структура ГОС может быть выражена формулой: Gal-(Gal)n-Glc, где Gal - остаток галактозы, Glc -остаток глюкозы, n = 0.. .7.
Первые упоминания о ГОС связаны с исследованием в 1950-х годах трансферазных реакций Р-галактози-даз, которые были использованы для получения глюко-зо-галактозных сиропов из лактозы в молочной промышленности [1-3]. В контексте гидролиза лактозы олигосахариды рассматривались как нежелательные побочные продукты, поскольку они обладали низкой растворимостью, низкой сладостью и плохой перева-риваемостью [4]. Позже было обнаружено, что ГОС обладают бифидогенными свойствами и могут использоваться в качестве олигосахаридов-пребиотиков при производстве продуктов здорового питания [5]. С этой точки зрения многие свойства галактоолигосахаридов, считавшиеся нежелательными в процессе гидролиза лактозы, оказались полезными для нового продукта, и с этого времени началось активное развитие технологии ГОС.
Практическая применимость препаратов галактоолигосахаридов в пищевой промышленности, кормопроизводстве, медицине, их биологическая ценность, лечебные и пребиотические свойства, а также возможность их получения из вторичного лактозосодержащего сырья молочной промышленности обусловливают научную и практическую ценность исследований в этой области.
С целью выявления тенденций развития способов получения ГОС нами был проведен поиск и анализ патентной информации по этому направлению за последние 25 лет. На рис. 1 представлены данные о динамике патентования изобретений, связанных с совершенствованием технологии ГОС, а также показано соотношение патентов в разных странах, позволяющее судить об активности патентования.
Анализ диаграмм свидетельствует, что подавляющее большинство изобретений в 80-90-е годы 20 века было сделано в Японии, после чего они были запатентованы в других странах, прежде всего США. Ведущей фирмой-разработчиком в этой области является УакиИ НошИа, ей принадлежит более половины всех японских патентов. Начиная с середины 1990-х годов появляются европейские патенты. В нескольких странах патенты единичны (Корея, Россия, Франция, Польша, Китай, Португалия, Великобритания и др.). В целом всплеск активности патентования приходится на 1990-е годы, наблюдается рост числа патентов и в последние несколько лет, что свидетельствует об актуальности работ в этой области.
В настоящее время можно выделить три основных способа промышленного получения ГОС:
химический метод, катализируемый минеральными кислотами;
микробиологический метод - трансформация углеводов с помощью микроорганизмов, обладающих высокой трансгликозилирующей активностью;
ферментативный метод, основанный на реакции трансгалактозилирования, катализируемой Р-галакто-зидазой.
С учетом этого выявленные патенты были условно разделены на 4 группы: патенты с использованием хи-
1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
□ Япония в Международные В США ■ Европа Н Другие страны
Рис. 1
1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 ■ ферментативный В микробиологический б выделение и очистка □ химический
Рис. 2
мического, микробиологического, ферментативного метода, а также посвященные методам выделения и очистки ГОС. Динамика патентования и соотношение количества патентов по этим направления показаны на рис. 2.
Как видно на графиках, в течение всех лет наиболее активно патентовались ферментативные способы получения ГОС - 59% от общего количества патентов. Значительную долю занимают также изобретения, в которых используются различные микроорганизмы -мицелиальные грибы, дрожжи, бактерии (в том числе молочнокислые и бифидобактерии). Представим краткое описание и анализ наиболее важных способов получения ГОС в соответствии с предложенной классификацией.
Один из первых методов производства ГОС был запатентован японской компанией Yakult Honsha в США [6]. Это изобретение, связанное с методом изготовления композиции для стимулирования роста бифидобактерий, состоящей по существу из смеси ГОС, характеризуется тем, что лактозу или содержащее лактозу сырье обрабатывают ß-галактозидазой, произведенной из Aspergillus oryzae. Согласно патенту, реакция трансгликозилирования протекает при концентрации лактозы в субстрате 10-50%, pH 3-8, концентрации фермента 1-100 ед. и температуре от 20 до 50°С.
Недостатки этого способа (низкая начальная концентрация лактозы, невысокая степень конверсии, большое содержание в продукте остаточной лактозы и моносахаров) устраняются в изобретении, запатентованном в разных странах [7]. В нем описывается метод производства ГОС путем реакции лактозы с ß-галактозидазой из Asp. oryzae, отличающийся тем, что концентрация лактозы в смеси достигает 50-90%, а температура реакции находится в диапазоне от 55°С до температуры, при которой фермент инактивируется. Эти методы базируются на том, что ß-галактозидаза из Asp. oryzae не инактивируется в растворе лактозы высокой концентрации даже при высоких температурах.
Продуцентами ферментов, необходимых для получения ГОС, могут быть разнообразные виды плесеней, дрожжей и бактерий. Японские компании запатентовали методы производства ГОС с использованием ß-га-лактозидаз, полученных из различных микроорганизмов: принадлежащих к роду Thermus [8], порядку
Dothideales [9], видам Bacillus circulans [10] (позднее был запатентован метод модификации фермента из этого микроорганизма [11]), Streptococcus thermophilus [12], Sterigmatomyces elviae [13]. В большинстве указанных методов производства ГОС применяется лактоза или лактозосодержащее сырье. Молочная кислота в качестве сырья используется в патентах [10] и [12].
Реакция трансгликозилирования превалирует над гидролизом, только если содержание лактозы в растворе является высоким (более 10%). Поэтому для получения молочных продуктов с ГОС предлагается проведение операций сгущения или добавления сухого молока, чтобы увеличить содержание лактозы в молоке. Например, в способе [14], запатентованном в нескольких странах, описан процесс производства порошка обезжиренного молока с содержанием ГОС 10-15%. Процесс включает операции сгущения молока до содержания сухих веществ 20-50%, добавления ß-галактозида-зы, нагревания смеси при температуре 70-85°C и распылительной сушки.
Цель другого изобретения [15] - получить новый пищевой продукт, имеющий карамельный вкус и содержащий ГОС, обладающий антиоксидантным эффектом и высокой хранимоспособностью. В сгущенное молоко добавляется гидролизующий лактозу фермент в количестве 0,05-0,1%, и лактоза ферментируется при 15-25°C. Затем смесь нагревается при атмосферном давлении или выше до коричневого цвета. Для полного предотвращения кристаллизации лактозы ее ферментацию продолжают до степени конверсии более 50%.
Описанные методы, однако, не могут быть использованы для производства питьевого молока с ГОС. Так как молоко-сырье или обезжиренное молоко не может быть непосредственно обработано ферментом для получения ГОС, оно должно подвергнуться сгущению, ферментации и последующему разведению водой, чтобы обеспечить оптимальную консистенцию питьевого молока. Этот процесс очень сложен, кроме того, при такой обработке неизбежна тепловая денатурация белков молока. Поэтому был предложен метод, в котором для производства ГОС в продукт на основе молока добавляют лактозу и фруктозу [16].
Такой метод неизбежно сопровождается увеличением содержания углеводов в продукте, что имеет неблагоприятные последствия (увеличение калорийности и степени сладости). Это связано с тем, что смеси после ферментации обычно содержат не только олигосахариды, но также ди- и моносахариды в количествах, сопоставимых с содержанием ГОС. Семейство патентов-аналогов [17] посвящено способу производства обработанного молока, содержащего ГОС, который не имеет вышеупомянутых недостатков, так как ß-галак-тозидаза из Streptococcus thermophilus или Lactobacillus bulgaricus катализирует преобразование в ГОС по крайней мере 15% лактозы, первоначально содержавшейся в молоке.
В последние годы были запатентованы несколько способов получения ГОС с использованием ферментов, полученных из бифидобактерий. Так, изобретения [18, 19] предусматривают применение новой ß-галак-
тозидазы с трансгалактозилирующей активностью, полученной из Bifidobacterium bifidum, в которой удален С-терминальный участок, в результате чего такой усеченный фермент имеет более высокую трансгалакто-зилирующую активность. В семействе патентов-аналогов [20] используют новую ß-галактозидазу из Bifidobacterium bifidum, которая образует смесь ß-га-лактоолигосахаридов, а также дисахарид галактобиозу с а-связью.
Некоторые патенты предполагают последовательное использование двух ферментов. Например, метод получения ГОС [21] характеризуется тем, что лактозу или лактозосодержащее сырье обрабатывают по крайней мере двумя видами ß-галактозидаз, которые произведены различными микроорганизмами. Авторы изобретения считают, что могут быть использованы различные комбинации ß-галактозидаз, полученных от безопасных микроорганизмов, однако рекомендуют применять комбинацию ферментов с максимально отличающимися свойствами, например, плесневые и дрожжевые ß-галактозидазы.
Такой процесс можно провести при одновременном внесении двух ферментов в реакционную смесь. Однако более управляемым и продуктивным будет процесс, при котором после обработки одним ферментом последний инактивируют, а затем вносят второй фермент. Такая последовательность операций предлагается в патенте [22], целью которого является получение ГОС высокой чистоты и с хорошим выходом. Лактозу или сухую сыворотку растворяют в горячей воде, при этом концентрация лактозы достигает 10-90%. Для выполнения первой ферментативной обработки к полученному раствору добавляется ß-галактозидаза, полученная из Bullera singularis или Bacillus circulans. Затем к смеси добавляется ß-галактозидаза, полученная из Streptococcus thermophilus или Lactobacillus bulgaricus. Ферменты могут быть использованы в иммобилизованной форме.
Ряд патентов-аналогов [23] посвящен уменьшению ингибирующего действия глюкозы. Для этого используют глюкозоизомеразу, которую добавляют либо в реакционную смесь, либо вносят ее уже после завершения реакции лактозы с ß-галактозидазой. Часть глюкозы превращается во фруктозу, тем самым снижается ее ингибирующее воздействие на ß-галактозидазу
Следует отметить, что наблюдается тенденция к патентованию максимально широкой области: от последовательности ДНК, фермента, кодируемого этой последовательностью ДНК, рекомбинантного вектора, включающего эту последовательность ДНК, клетки-хозяина, включающей последовательность ДНК или вектор, причем клетка - бактериальная, дрожжевая или плесневая и отобрана из группы, состоящей из Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus и Aspergillus, до процесса производства фермента и использования фермента или клетки для получения смеси олигосахаридов, которая может применяться в ряде молочных продуктов (сухом и питьевом молоке, мороженом, сырах, кисломолочных напитках), фруктовых соках, детском питании, кашах, хлебе, кондитерских изделиях, пищевых добавках,
пробиотических и пребиотических продуктах, кормах и лекарствах [20].
Анализ литературы по вопросам получения ГОС показывает, что каждый из методов имеет определенные недостатки. Химический синтез требует использования концентрированных кислот и высоких температур, а реакция кислотного трансгликозилирования имеет невысокую специфичность. Микробиологическая трансформация протекает при низких температурах и обладает специфичностью, но требует дополнительных операций отделения клеток микроорганизмов и очистки раствора от продуктов метаболизма, которые мешают выделению ГОС. При ферментативном синтезе ГОС в водных системах равновесие реакции сдвигается в сторону гидролиза, что приводит к низкому выходу олигосахаридов. Однако в целом ферментативный способ является наиболее перспективным вследствие своей специфичности, доступности, экологической безопасности. Кроме того, этот способ производства не требует дорогостоящей очистки продукта. К основным направлениям совершенствования технологии ГОС можно отнести следующие:
увеличение селективности реакции трансгалакто-зилирования путем уменьшения показателя активности воды, в частности путем повышения концентрации лактозы при оптимальной для действия фермента температуре;
получение новых продуцентов лактаз, обладающих термостабильностью и высокой трансгалактозилирую-щей активностью, методами генетической инженерии;
использование иммобилизованных ферментов;
применение современных, в том числе мембранных методов, для решения проблемы очистки реакционной смеси от остатков лактозы и моносахаридов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wallenfels K. Enzymatische Synthese von Oligosacchariden auf Disacchariden // Naturwissenschaften. - 1951. - № 38. -P.306-308.
2. Aronson M. Transgalactosidation during lactose hydrolysis // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1952. - № 39. -P.370-378.
3. Pazur J.H. The enzymatic conversion of lactose into galactosyl oligosaccharides // Science. - 1953. - № 117. - P. 355-356.
4. Smart J.B. Transferase reactions of ß-galactosidases - new product opportunities // Bulletin of the IDF 289. - Brussels: Intern. Dairy Federation, 1993.
5. Gibson G.R. Prebiotics: development and application /
G.R. Gibson, R.A. Rastall, 2006.
6. US Patent № 4435389, A61K 031/71; C12P 019/04. Composition for promoting growth of bifidobacteria / Mutai M., Terashima T., Takahashi T. et al., pat. 06.03.84.
7. European Patent № 0266177, C12P19/00; C12N1/38;
C12P19/14. Method for producing oligosaccharides / Kan T., Kobayashi Y., pat. 04.05.88. Патенты-аналоги: US 4957860, NZ 222301, KR 960006579.
8. Japan Patent № 2000041693, C12N9/38; C12P19/14;
C12R1/01; C12N9/38. Production of galactooligosaccharide / Hayasawa
H., Takase M., Okogi S., pat. 15.02.2000.
9. Japan Patent № 2003274991, C12P19/14. Method for producing galactooligosaccharide / Fujii T., Fujii N., pat. 30.09.03.
10. Japan Patent № 1051094, C07H3/06; C12P19/14.
Production of galactooligosaccharide / Matsuno R., Nakanishi K., Ozaki A., pat. 27.02.89.
11. Japan Patent № 11018763, C12N9/38; C12P19/14;
C12N9/38; C12R1/09. Modification of beta-galactosidase / Matsumoto K., Ikeda M., Ooeda K. et al., pat. 26.01.99.
12. Japan Patent № 9238696, C12P19/18. Production of
saccharide composition containing 3'galactooligosaccharide / Kimura K., Watanabe Y., Matsumoto K. et al., pat. 16.09.97.
13. Japan Patent № 7236480, C12N9/38; C12R1/645;
C12N9/38. New beta-galactosidase and its production / Onishi I., Tanaka T., pat. 12.09.95.
14. Japan Patent № 4030744, A23C9/13; C12P19/04. Skimmed milk containing galactooligosaccharide and its preparation / Shukke S., Yanagidaira S., Kobayashi T., pat. 03.02.92. Патенты-аналоги: EP 0458358.
15. Japan Patent № 8256680, A23C9/12; A23C9/18;
A23C9/12; A23C9/00. New food material and its production / Takaine M., Goto T., Aiuchi M., pat. 08.10.96.
16. International Patent WO 2008/037839, C12P 19/04, A23C 9/12, C12P 19/12, A23C 13/16. Method for producing products containing galactooligosaccharides and use thereof / Sibakov T., Kajander K., Harju M. (FI), pat. 03.04.08.
17. Japan Patent № 1168234, A23C9/12; A23C9/152;
C12N9/38 et al. Production of galactooligosaccharide-containing processed milk / Kobayashi Y., Suga T., Terajima T., pat. 03.07.89. Патенты-аналоги: EP 0323201, US 4944952, KR 930005847, NZ 227440.
18. International Patent WO 2001/090317, C12N 9/38. Beta-galactosidase isolated from a Bifidobacterium / Jorgensen F., Hansen O. C., Stougaard P. (DK), pat. 29.11.01.
19. US Patent № 6555348, C12P 019/44; C12N 009/10; C12N 009/26; A23C 019/00; A23C 017/00. Enzyme isolated from a Bifidobacterium / Jorgensen F., Hansen O.C., Stougaard P. (DK), pat. 29.04.03. Патенты-аналоги US 2002086358, US 2003162280, US 7081355.
20. International Patent WO 2007/110619, C12N5/10;
C12N9/38; C12N15/63; C12N5/10; C12N9/38; C12N15/63.
Beta-galactosidase with transgalactosylating activity / Tzortzis G., Goulas A., Goulas T. (GB), pat. 04.10.07. Патенты-аналоги: US 2009117080, NO 20083896, KR 20090003260, GB 2449209.
21. European Patent № 0263700, C12N1/38; C12P19/00;
C12P19/14; C12R1/69 et al. Method for producing oligosaccharides / Kobayashi Y., Kan T., Terashima T., pat. 13.04.88. Патенты-аналоги: EP 0263700, EP 0263700, US 489580, NZ 222056.
22. Japan Patent № 2215392, C07H3/06; C12N1/38;
C12P19/14. Production of galactooligosaccharide / Matsumoto K., Kobyashi Y., Suga T., pat. 28.08.90.
23. Japan Patent № 2100693, C12P19/04; C12P19/00;
C12P19/18; C12P19/24 et al. Production of galactooligosaccharide / Matsumoto K., Kobyashi Y., Suga T., pat. 12.04.90. Патенты-аналоги: EP 0363214, US 5032509, NZ 230882, DE 68920814, CA 2000127.
Поступила 21.06.10 г.
TRENDS OF GALACTOOLIGOSACCARIDES PRODUCTION METHODS DEVELOPMENT
A.G. KHRAMTSOV, A.B. RODNAYA, A.D. LODYGIN, S.A. RYABTSEVA
North Caucasus State Technical University,
2, Kulacov av., Stavropol, 355029; e-mail: [email protected]
The data about dynamics of galactooligosaccharides production methods patenting are shown. The analysis of advantages and disadvantages is carried out; trends of galactooligosaccharides technology development are revealed.
Key words: galactooligosaccharides, prebiotics, methods of production, patenting.
637.5.04/.07
ПРИЧИНЫ ОБРАЗОВАНИЯ И СПОСОБЫ КЛАССИФИКАЦИИ МЯСНОГО СЫРЬЯ НЕТРАДИЦИОННОГО КАЧЕСТВА
Н.В. ТИХОНОВА1, В.М. ПОЗНЯКОВСКИЙ2
1 Уральская государственная академия ветеринарной медицины,
457100, Челябинская обл., г. Троицк, ул. Гагарина, 13; тел.: (35163) 2-32-21, электронная почта: [email protected] 2 Кемеровский технологический институт пищевой промышленности,
650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47; тел./факс: (3842) 75-69-67
Причины образования мясного сырья нетрадиционного качества разнообразны: генетическая предрасположенность, несбалансированное кормление, воздействие стресса на животных и др. Определяющей причиной снижения качества мяса является стресс. Представлены различные способы классификации мяса нетрадиционного качества.
Ключевые слова: мясо нетрадиционного качества, PSE и DFD свойства, стрессоустойчивость животных.
Среди видов мясного сырья нетрадиционного каче- Существуют значительные отличия в качестве мяса
ства наиболее проблемным является мясо с PSE (блед- в зависимости от пород и вида убойных животных [6].
ное (pale), дряблое или мягкое (soft), водянистое Причиной образования мяса нетрадиционного качест-
(exsudative), рН менее 5,2) и DFD (темное (dark), плот- ва является нарушение горм°нальног° г°ме°стаза.
ное (firm), сухое (dry), рН более 6,4) свойствами [1,2]. С помоЩью гормональных стмуляшрот повышаю>т
Для свинины характерны признаки PSE, для говядины рост; развитие и усвояемость кормов. В качестве тагах
- DFD [1]. В силу его качественных характеристик мя- стимуляторов используют половые гормоны, а также
со со свойствами PSE необходимо использовать при заменяющие их синтетические гормоноподобные со-
производстве сырокопченых колбас и окороков, со единения (биостимуляторы), что отрицательно влияет
свойствами DFD - для вареных колбас [3-5]. на качество продукции [7].
