CC BY
66
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
флюоресцентный зонд и обратный праймер для выявления каждого полиморфизма. З'-конец одного из каждой пары прямых праймеров соответствовал нуклеотиду нормальной последовательности ДНК исследуемого гена, а другой соответствовал нуклеотиду мутантной последовательности. Для идентификации мутаций в функциональном гене GBA и исключения выявления мутаций в псевдогене подбирали обратный праймер, полностью гомологичный участку последовательности функционального гена и имеющий различия на З'-конце с соответствующим участком псевдогена. Амплификация псевдогена в таком случае была исключена. Все олигонуклеотиды были синтезированы для проведения мультиплексной ПЦР-РВ в формате Taqman.
Результаты и обсуждение. Разработаны тест-системы для специфичного и быстрого выявления указанных полиморфизмов. Каждая из тест-систем предусматривает параллельное проведение двух мультиплексных ПЦР-РВ: первая -
с нормальными праймерами, вторая - с мутантными. При появлении соответствующего ПЦР-продукта только в первой реакции образец классифицируют как "без мутаций", при появлении ПЦР-продукта только во второй реакции - как "гомозигота по мутации", в обеих реакциях - как "гетерозигота по мутации".
Заключение. Тест-системы для выявления наиболее часто встречаемых мутаций, вызывающих наследственный ге-мохроматоз, болезни Вильсона-Коновалова и Гоше апробированы в ФГБУ Гематологический научный центр (Москва) и являются незаменимым инструментом для выявления и верификации диагнозов этих болезней. Кроме того, мы полагаем, что применение метода аллель-специфической ПЦР-РВ для обнаружения заведомо известных точечных мутаций, делеций и инсерций является высокоспецифичной, быстрой и недорогой заменой секвенированию и другим методам исследования мутаций.
Определение ПНГ-клона у больных апластической анемией в процессе иммуносупрессивной терапии
Фидарова З.Т.1, Михайлова Е.А.1, Гальцева И.В. 1 , Устинова Е.Н. 1, Троицкая В.В.1, Луговская С.А.2, Наумова Е.В. 2, Почтарь М.Е.2,
Паровичникова Е.Н.1, Савченко В.Г.1 'ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва; 2Кафедра клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО РМАПО, Москва
Введение. Современная иммуносупрессивная терапия (ИСТ) значительно повышает эффективность лечения больных апластической анемией (АА), но 20-30% больных остаются рефрактерными к проводимой терапии. По данным международных исследований выявление ПНГ-клона при АА может расцениваться как фактор, предопределяющий хороший ответ на ИСТ.
Цель работы. Выявление и мониторирование ПНГ-клона у больных АА и определение его значения для оценки эффективности ИСТ.
Материалы и методы. В исследование включены 38 больных de novo АА в период с 05.2011 по 11.2013 г, медиана наблюдения 12 мес, медиана возраста 26 лет. Больных разделили на группы: 1-я группа - с наличием ПНГ-клона, 2-я группа - с отсутствием ПНГ-клона. Всем проводили ИСТ (АТГ и ЦА). Ответ на лечение оценивали как гематологическое улучшение - ГУ [Hb > 80 г/л, Гр > 1,0 (для ТАА > 0,5), Тр > 30]. ПНГ-клон определяли методом проточной цитоме-трии. Минорный клон менее 1%.
Результаты. До начала ИСТ ПНГ-клон выявлен у 55,2% больных: медиана эр. - 0,1%, гр. - 0,76%, мон. - 5%. К 3 мес лечения ГУ достигнуто у 47,4% больных, из которых 77,8% из 1-й группы и только 22,2% из 2-й группы. Среди больных, у которых не достигнуто ГУ к 3-му месяцу терапии (52,6%), соответственно превалировали больные из 2-й группы (65%), а у больных 1-й группы (35%) отличие было только по большему значению ПНГ-клона на моноцитах - 5,8% против 0,7% у ответивших на лечение. На момент анализа ГУ получено у 73,7% больных: в 1-й группе - у 47,4%, во 2-й группе - у 26,3%. У 6 больных 2-й группы отмечались появление и персистенция ПНГ-клона. Среди больных 1-й группы с ГУ у 1 больного наблюдалось исчезновение клона, а у 3 - увеличение клона и появление клинически выраженного внутрисосудистого гемолиза.
Заключение. Положительный ответ чаще достигался в группе больных с изначально выявленным ПНГ-клоном. Появление и персистенция ПНГ-клона у 6 больных после проведения ИСТ наблюдались при положительном ответе на терапию, что указывает на связь ответа на ИСТ с присутствием ПНГ-клеток.
Текстурный анализ морфологических особенностей лейкоцитов при заболевании лейкозом
Фурман О.Г., Глушен С.В.
Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова; Белорусский государственный университет,
Минск, Республика Беларусь
Введение. Актуальность проблемы своевременной диагностики лейкозов обусловлена высокой степенью распространенности этой группы заболеваний. Современные методы терапии позволяют излечивать таких больных, которые еще в недавнем прошлом считались безнадежными. Однако жизнь пациента во многом зависит от того, как скоро начато лечение, поэтому своевременная постановка диагноза приобретает особое значение. Применение методов диагностики, отличающихся повышенной точностью, объективностью и высокой скоростью получения результатов, на первом этапе обследования позволило бы существенно упростить задачу выявления и дифференциальной диагностики лейкозов.
Цель работы. Изучить перспективность компьютерного анализа цитологических препаратов периферической крови больных с различными формами лейкозов с помощью текстурных параметров для дифференцировки заболеваний кроветворной системы на основе различий в фенотипах лейкоцитов.
Материалы и методы. Для изучения фенотипических особенностей лейкоцитов периферической крови была разработана методика количественной оценки их морфологии после окрашивания их флюорохромом Rhodamin B. Данная методика, реализованная с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 50i (объектив Nikon 60x/0.80) и камеры Nikon DS-5M (цифровую съемку проводили программой Nis-elements F 3.0), позволила измерить текстурные параметры изображений клеток. Компьютерную обработку изображений производили с помощью программы CellProfiler (CellProfiler.com). Фенотипы лейкоцитов регистрировали по 13 параметрам: Angular Second Moment, Contrast, Correlation, Variance, Sum Variance, Difference Variance, Inverse Difference Moment (IDM), Sum Average, Entropy, Sum Entropy, Difference Entropy, Information Measure of Correlation 1, Information Measure of Correlation 2. Для обработки результатов использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).
Приложение 1
Результаты. Исследование показало, что наиболее информативными параметрами для характеристики фенотипа лейкоцитов при окрашивании клеток флюорохромом Rhodamin B являются Contrast, Difference Entropy, Difference Variance, Inverse Difference Moment. С помощью данной методики выявлены количественные различия морфологии лейкоцитов при заболеваниях острым миелобластным лейкозом (формы М1, М2, М3 и М4), острым лимфобластным лейкозом, хроническим миелобластным лейкозом и хроническим лимфо-
бластным лейкозом. Полученные характеристики текстурных параметров клеток в целом соответствуют морфологическим особенностям лейкоцитов, известным из литературы.
Заключение. Полученные результаты позволяют заключить, что компьютерный анализ изображений лейкоцитов после окрашивания флюорохромом Rhodamin В может быть использован для дополнительной характеристики различных форм лейкозов в диагностических и прогностических исследованиях.
KIR/HLA-ассоциации у взрослых больных острыми лимфобластными лейкозами
Хамаганова Е.Г., Кузьминова Е.П., Юшкова А.А., Е.Н. Паровичникова ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва
Введение. Распознавание HLA-лигандов KIR-рецеп-торами (иммуноглобулинподобными рецепторами натуральных киллеров - NK) опосредует толерантность NK к собственным клеткам с нормальной экспрессией HLA-молекул. Функционально компетентными (лицензированными) являются NK, для KIR-рецепторов которых существует соответствующий(е) НЬА-лиганд(ы) в геноме собственного организма. В основном лигандами KIR являются молекулы HLA-С. Имеются противоречивые сообщения об ассоциациях между генами KIR и предрасположенностью к ОЛЛ у детей (Z.Almalte и соавт., 2011; F.Babor и соавт., 2012). ОЛЛ у взрослых отличается от ОЛЛ у детей многими биологическими характеристиками.
Цель работы. Изучение распределения KIR-генов и их HLA-лигандов у взрослых больных ОЛЛ и доноров компонентов крови для установления возможных ассоциаций.
Материалы и методы. KIR- и HLA-генотипированы 60 взрослых больных ОЛЛ (возраст 18-58 лет, медиана 35,3 года) и 93 неродственных донора компонентов крови в возрасте от 19 до 55 лет, медиана возраста 32,1 года (контрольная группа). Генотипирование проводили методом PCR-SSP наборами Invitrogen (США) в соответствии с рекомендациями производителя. Статистическую значимость различий показателей между группами определяли с помощью х2, вычисляли относительный риск (RR) развития заболевания и доверительный интервал (CI).
Результаты и обсуждение. HLA-С молекулы диморфны по позиции 80 пептидсвязывающей бороздки: аллели, не-
сущие аспарагин, относятся к группе HLA-C1 и являются лигандами KIR2DL2/3; аллели, несущие лизин, относятся к группе HLA-C2 и являются лигандами KIR2DL1. Среди больных ОЛЛ по сравнению со здоровыми донорами снижено число пациентов, гомозиготных по БЬА-С2/С2 (10 против 24%; р = 0,033; RR = 0,358; CI = 0,136-0,945), и имеется тенденция к увеличению числа гетерозигот БЬА-С1/С2 (57 против 45%). По сравнению с донорами у больных ОЛЛ не установлено отклонений в распределении частот KIR-генов, однако при анализе лицензированных KIR выявлено снижение числа больных с единственным лицензированным KIR-рецептором - KIR2DL1 (без лицензированного KR2DL2/3) - 8 против 19% у доноров компонентов крови (р = 0,063; RR = 0,37; CI = 0,132-1,08), а также тенденция к повышению числа больных ОЛЛ с двумя лицензированными KIR-рецепторами - KIR2DL1 + KR2DL2/3 (54 против 44% у доноров).
Заключение. Полученные данные позволяют предполагать наличие ассоциаций между KIR-генами, их HLA-лигандами и предрасположенностью/резистентностью к развитию ОЛЛ во взрослом возрасте. Схожие KIR/ HLA-ассоциации отмечаются при некоторых так называемых вирусассоциированных опухолях. Гомозиготность по БЬА-С2/С2 (отсутствие HLA-d-лигандов) является фактором, ассоциирующимся с резистентностью к развитию ОЛЛ у взрослых. Другой возможный протектор развития ОЛЛ у взрослых - носительство только одного функционально активного KIR-рецептора 2DL1.
Использование клеточного биочипа в диагностике волосатоклеточного лейкоза
Хвастунова А.Н.1,2, Аль-Ради Л.С.3, Луговская С.А.4, Капранов Н.А.2, Горгидзе Л.А.3, Джулакян У.Л.3, Атауллаханов Ф.И. 12,3, Кузнецова С.А. 1,2,3 'ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д.Рогачева Минздрава России; 2ФГБУН Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН; 3ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России; 4ГБОУ ДПО Российская медицинская академия
последипломного образования Минздрава России, Москва
Введение. Для диагностики волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ) необходимо определение иммунофенотипа особой популяции лимфоцитов с ворсинчатой морфологией. Проточная цитометрия не позволяет оценить морфологию исследуемых лимфоцитов.
Цель работы. Исследование чистой популяции опухолевых лимфоцитов пациентов с подозрением на ВКЛ и параллельное исследование их иммунофенотипа и морфологии или активности кислой фосфатазы с помощью биочипа на основе анти-CD-антител.
Материалы и методы: Биочип представляет собой прозрачную пластиковую подложку, на которой иммобилизованы антитела к 32 основным поверхностным дифференцировоч-ным антигенам лейкоцитов, каппа и ламбда легким цепям ^ и контроль. Биочип инкубируется с суспензией клеток, выделенных из периферической крови в градиенте плотности
Histopaque-1077. Лимфоциты, несущие определенный поверхностный антиген, связываются с иммобилизованными на биочипе антителами. После отмывки неспецифически связавшихся клеток на подложке остаются области, покрытые лимфоцитами, несущими тот или иной поверхностный антиген. После этого биочип высушивают и к связавшимся с ним клеткам применяют стандартные методы морфологической или цитохимической окраски, разработанные для стандартных мазков.
Результаты. Исследованы образцы крови 60 пациентов с подозрением на ВКЛ, у 49 был подтвержден ВКЛ, у 7 была диагностирована лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки, у 1 - хронический лимфолейкоз, у 3 онкогематологиче-ских нарушений не было. Ворсинчатые лимфоциты больных ВКЛ составляли от 1 до 97% лимфоцитов и имели характерный иммунофенотип CD11c (100%), CD19 (100%), CD20 (100%), CD22 (100%), CD25 (96%), CD103 (96%), CD200 (96%), CD10
