CC BY
329
Море информации в капле крови. Мультиплексная технология xMAP в клинической лабораторной диагностике: возможности и перспективы
^ А.Н. Данилов
Кафедра клинической фармакологии Лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова
В статье изложены принципы нового метода лабораторной диагностики — проточного мультиплексного хемилюминесцентного анализа на микросферах. Рассмотрены основные технические характеристики и преимущества новой технологии перед стандартными методами исследования, а также перспективы ее клинического применения и дальнейшего развития. Ключевые слова: мультиплекс, хемилюминесценция, проточная цитометрия, микросферы, лабораторная диагностика.
Лабораторные исследования давно стали неотъемлемой частью диагностического процесса как в стационаре, так и в амбулаторной практике. С каждым годом число стандартных лабораторных показателей и количество анализов в расчете на одного пациента неуклонно растет, что повышает нагрузку на клинические лаборатории и требует расширения парка лабораторного оборудования. В то же время увеличивается объем биологического материала, необходимого для успешного проведения назначенных пациенту исследований. Напри -мер, у пациента отделения реанимации и интенсивной терапии суммарный объем крови, взятой для проведения лабораторных исследований, может достигать 150 мл и более. Отдельную проблему составляет получение достаточного количества крови в педиатрической практике. Для проведения биохимического или иммунохимичес-кого исследования крови с определением 15—20 аналитов даже при условии приме-
Контактная информация: Данилов Александр Николаевич, brain3001@gmail.com
нения современных педиатрических вакуумных пробирок минимальный необходимый объем сыворотки составляет не менее 1,0 мл (т.е. 2,0—2,5 мл цельной крови). Кроме того, для различных исследований часто требуются разные первичные пробирки, что может быть обусловлено как особенностями конкретных лабораторных тестов, так и спецификой используемого оборудования.
Другой актуальной проблемой является соблюдение клиническими лабораториями высоких требований к качеству проведения исследований и расширение парка оборудования по мере роста диагностических потребностей лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ). Большинство ЛПУ, однако, не может позволить себе содержать большое количество лабораторной техники и тем более организовать работу нескольких лабораторий. Для успешного решения освещенных выше проблем требуется универсальное высокопроизводительное оборудование, способное заменить несколько анализаторов и измерять большое число
Лечебное дело 4.2011
аналитов в микроколичествах любого биоматериала.
Существующие решения для мультиплексирования на основе слайд-технологии и биочипов, позволяющие определять сотни параметров в биологическом образце, пока не нашли широкого клинического применения ввиду малодоступности оборудования и сложности его обслуживания. Определенные успехи достигнуты в области внедрения в клиническую практику биочипов для генотипирования системы цитохрома Р450. Тем не менее данный метод остается недоступным для большей части клиницистов. Биочипы служат незаменимым инструментом для научных приложений, требующих крайне высокой степени мультиплексирования (>100 параметров), например в протеомных исследованиях. Мультиплексная полимеразная цепная реакция и ее модификации имеют существенные ограничения по числу детектируемых каналов (в настоящее время не более 6), что связано со спектральными характеристиками флюорофоров.
Проточное мультиплексирование на микрочастицах (технология хМАР) позволяет исследовать до 100 параметров одновременно, что вполне приемлемо для многих научных приложений и оптимально для клинической лаборатории. Минимальный объем биологического материала составляет всего 12,5 мкл (сыворотка или плазма). Для определения количества биомолекул в технологии хМАР используются любые комплементарные взаимодействия, поэтому область применения мультиплексного анализа на ее основе чрезвычайно широка. В настоящее время уже решен ряд задач клинической лабораторной диагностики с помощью хМАР, в том числе: изотипирова-ние иммуноглобулинов (^), составление ци-токинового и метаболического профилей, комплексная оценка уровня маркеров острой фазы, ангиогенеза, апоптоза, вирусных инфекций, онкомаркеров. Перспективными направлениями для приложения техно-
Лечебное дело 4.2011------------------
логии хМАР являются аллергология, ЫЬА-и БКР-генотипирование, исследование инфекционных и аутоиммунных заболеваний; при этом реагенты для данных областей применения доступны уже сегодня. Более того, платформы Ьиттех и Бю-Р1ех, реализующие технологию хМАР, являются открытыми, что обеспечивает максимальные возможности для расширения номенклатуры исследований.
Под корпусом анализатора скрывается несколько передовых технологий. Первая технология (собственно хМАР) разработана корпорацией Ьиттех. Это полистиро-ловые микрочастицы (микросферы), меченные двумя флюоресцентными красителями с разной длиной волны излучения. Различные пропорции красителей позволяют составить до 100 спектральных адресов микрочастиц. Каждому “оттенку” соответствует один аналит: на поверхность микросфер ковалентно “пришит” его комплементарный партнер по межмолекуляр-ному взаимодействию (например, антитело или олигонуклеотид). Концентрация ана-лита рассчитывается на основании интенсивности флюоресценции микросфер, измеренной после взаимодействия детектирующих биотинилированных биомолекул со стрептавидином, несущим флюорофор-ную метку. В качестве флюорофора в системе Бю-Р1ех используется фикоэритрин с длиной волны возбуждения 546 нм и длиной волны излучения 575 нм.
Вторая технология — проточная цитометрия с использованием: двух лазеров для возбуждения свечения флюорофоров; проточной кюветы, ширина которой сопоставима с диаметром микросферы; оптической схемы; лавинных фотодиодов с температурной компенсацией; чувствительного фотоумножителя для регистрации флюоресценции внутри и на поверхности микрочастиц. Один лазер, с длиной волны 635 нм (красный), используется для возбуждения флюоресценции смеси красителей, определяющих тип микросферы, другой лазер, с
Технология xMAP в лабораторной диагностике
длиной волны 532 нм (зеленый), возбуждает свечение фикоэритрина. Именно проточная цитометрия позволила определять интенсивность флюоресценции для каждой микросферы в отдельности. Учитывая, что число микросфер в одной лунке (на каждый аналит) измеряется сотнями и тысячами, качество измерения флюоресцентного сигнала и концентрации аналита является чрезвычайно высоким. Чувствительность детекции также очень высокая — 1000 молекул фикоэритрина на 1 микросферу (с автоматическим вычетом флюоресценции раствора).
Наконец, третья технология, сделавшая возможным создание Вю-Р1ех, представляет собой высокоскоростной цифровой сигнальный процессор для эффективной обработки флюоресцентного сигнала от тысяч микросфер. Только современные процессоры в состоянии “переварить” такой колоссальный поток информации.
Исходно технология хМАР разрабатывалась для исследовательских лабораторий. Ее существенным недостатком было наличие в технологическом процессе ручной вакуумной фильтрации (на этапе “отмывки” микросфер), которая требует от персонала определенных навыков и служит источником увеличения вариабельности результатов и, следовательно, снижения их воспроизводимости. В мультиплексных тест-системах второго поколения микросферы обладают ферромагнитными свойствами, поэтому вместо вакуумной фильтрации используется магнитная сепарация. Более качественная отмывка магнитных частиц позволила повысить чувствительность и специфичность метода. Средний остаточный объем жидкости минимизирован до 2,7 мкл, а потери частиц после серии отмывок не превышают 8% (при вакуумной фильтрации они достигают 30—40%). Для клинического применения особенно важными являются достигнутые в последние годы автоматизация и стандартизация ус-
Сравнение ИФА и Вю-Р1ех при исследовании 27 цитокинов в 80 образцах сыворотки или плазмы крови
Параметры ИФА Bio-Plex
Количество цитокинов 27 27
Количество образцов 80 80
Общее количество результатов 2160 2160
Число 96-луночных планшетов 27 1
Время, необходимое для анализа, ч >60 3
Объем биологического образца, мкл >1000* 12,5
Динамический диапазон измерения, пг/мл 2-3000 0,2-32000
* Из расчета 50 мкл образца на каждую лунку.
ловий проведения мультиплексных исследований.
Несомненным плюсом системы Вю-Р1ех 200 является использование привычного 96-луночного формата, с которым работает подавляющее большинство отечественных лабораторий. В то же время производительность Вю-Р1ех 200 значительно превышает показатели классического твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) при существенно меньшем объеме биоматериала. Приведенные в таблице данные позволяют получить представление о затратах времени, реактивов и биоматериала при исследовании цитокинового профиля с помощью классического ИФА и Вю-Р1ех: современный метод позволяет сократить время более чем в 20 раз и потратить в 2 раза меньше биоматериала.
Система Вю-Р1ех может работать и в “моноплексном” режиме, когда детектируется один-единственный аналит в биологической жидкости. Однако чем выше степень мультиплексирования, тем экономически выгоднее использование Вю-Р1ех. Тем не менее даже в случае изучения единичного аналита скорость и точность измерения оставляют стандартные методики далеко позади. Например, результаты ис-------------------Лечебное дело 4.2011
следования E. Gomez et al. свидетельствуют о том, что использование технологии xMAP в серодиагностике сифилиса позволяет сэкономить до 2,8 ч на 100 образцов и увеличить производительность в 4 раза по сравнению с методом ИФА.
Особенно перспективно применение системы Bio-Plex в диагностике аутоиммунных заболеваний и аллергии, когда для анализа полученных результатов и их связи с клинической картиной требуется одномоментная оценка нескольких десятков параметров. Панель аутоантител уже успешно применяется в клинической практике. Сравнение этой панели с иммуно-ферментными, хемилюминесцентными и мультиплексными методами при диагностике системной красной волчанки доказывает высокую сопоставимость полученных результатов; при этом Bio-Plex демонстрирует лучшую корреляцию результатов с развитием волчаночного нефрита. Изучение профиля противовирусных антител у пациентов с гранулематозом Вегенера с помощью технологии xMAP позволило выявить связь между активностью васкулита, поражением почек и желудочно-кишечного тракта и наличием противовирусного гуморального иммунитета, а у пациентов с неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона установлена высокая распространенность антител к Toxoplasma gondii.
При диагностике инфекционного моно-нуклеоза система Bio-Plex дает комплексный ответ, включающий IgM и IgG к кап-сидному антигену вируса Эпштейна-Барр, а также IgG к раннему и ядерному антигенам вируса, что позволяет точно периоди-зировать заболевание. При этом чувствительность и специфичность Bio-Plex не уступают показателям иммунохемилюминес-центных тест-систем ведущих европейских производителей, а при сравнении с ИФА наблюдается существенная экономия времени за счет повышения производительности. Аналогичные данные получены при изучении мультиплексной тест-системы
для определения IgG к вирусу простого герпеса 1-го и 2-го типов. При сравнении с аналогичными анализаторами Вю-Р1ех имеет максимальную скорость выполнения тестов. В акушерской и педиатрической практике для одновременного определения серологических маркеров успешно применяется панель Вю-Р1ех MMRV (вирусы кори, краснухи, паротита, вирус герпеса 3-го типа) и Вю-Р1ех ToRC (токсоплазма, вирус краснухи, цитомегаловирус).
Клиническая комплексная лабораторная диагностика цитокинового статуса на основании исследования различных биологических жидкостей стала возможной только с помощью мультиплексирования на микросферах. Данный метод позволяет не только оценить общий баланс цитоки-нов, но и сделать выводы о состоянии местного иммунитета, что уже реализовано в клинических исследованиях ряда офтальмологических заболеваний. Особенно впечатляют возможности применения метода для оценки риска развития отторжения трансплантата роговицы по уровню цито-кинов в слезной жидкости.
В кардиологии и эндокринологии перспективно исследование метаболических панелей Вю-Р1ех, включающих маркеры сахарного диабета (С-пептид, инсулин, глюкагон, GLP-1) и ожирения (лептин, адипсин, адипонектин). Детальное изучение метаболического статуса помогает точнее стратифицировать риск развития сердечно-сосудистых осложнений, сделать заключение о глубине метаболических нарушений и причинах ожирения. Данные о гормональном профиле пациентов, находящихся на инсулинотерапии, позволяют оптимизировать проводимое лечение. Важным представляется это исследование и для оценки метаболической безопасности лекарственных средств, используемых в кардиологической практике.
Таким образом, точность, универсальность, высокая пропускная способность и экономия биоматериала обусловливают
Технология xMAP в лабораторной диагностике
особенную привлекательность применения технологии xMAP в клинико-диагностических лабораториях. В ближайшем будущем мультиплексные анализаторы будут играть важную роль как в научной, так и в клинической практике. Можно надеяться, что широкое внедрение мультиплексного анализа поможет не только улучшить технические показатели существующих лабораторных тестов, но и решить многие клинические проблемы на новом уровне.
Рекомендуемая литература
Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР в реальном времени. 2-е изд. М.: Бином, 2009. 223 с.
Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрическо-го анализа крови. М.: МИА, 2004. 128 с. Bardin N, Desplat-Jego S., Daniel L. et al. BioPlex 2200 multiplexed system: simultaneous detection of anti-dsDNA and anti-chromatin antibodies in patients with systemic lupus erythematosus // Autoimmunity. 2009. V. 42. № 1. P. 63-68.
Berth M, Bosmans E. Comparison of three automated immunoassay methods for the determination of Epstein-Barr virus-specific immunoglobulin M // Clin. Vaccine Immunol. 2010. V. 17. № 4. P. 559-563.
Binnicker M.J., Jespersen D.J., Harring J.A. et al. Evaluation of a multiplex flow immunoassay for detection of Epstein-Barr virus-specific antibodies // Clin. Vaccine Immunol. 2008. V. 15. № 9. P. 1410-1413.
Binnicker M.J., Jespersen D.J., Harring J.A. Evaluation of three multiplex flow immunoassays compared to an enzyme immunoassay for the detection and differentiation of IgG class antibodies to herpes simplex virus types 1 and 2 // Clin. Vaccine Immunol. 2010. V. 17. № 2. P. 253-257.
Gomez E., Jespersen D.J., Harring J.A., BinnickerM.J. Evaluation of the Bio-Rad BioPlex 2200 syphilis multiplex flow immunoassay for the detection of IgM- and IgG-class antitreponemal antibodies // Clin. Vaccine Immunol. 2010. V. 17. № 6. P. 966-968.
Hanly J.G., Su L., Farewell V., Fritzler M.J. Comparison between multiplex assays for autoantibody detection in systemic lupus erythematosus // J. Immunol. Methods. 2010. V. 358. № 1-2. P. 75-80.
Hanly J.G., Thompson K., McCurdy G. et al. Measurement of autoantibodies using multiplex methodology in patients with systemic lupus erythematosus // J. Immunol. Methods. 2010. V. 352. № 1-2. P. 147-152.
Lidar M., Langevitz P., Barzilai O. et al. Infectious serologies and autoantibodies in inflammatory bowel disease: insinuations at a true pathogenic role // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2009. V. 1173. P. 640-648.
Lidar M., Lipschitz N., Langevitz P. et al. Infectious serologies and autoantibodies in Wegener’s granulomatosis and other vasculitides: novel associations disclosed using the Rad BioPlex 2200 // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2009. V. 1173. P. 649-657.
Shovman O., Gilburd B., Barzilai O. et al. Evaluation of the BioPlex 2200 ANA screen: analysis of 510 healthy subjects: incidence of natural/predictive autoantibodies // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1050. P. 380-388.
A Drop of Blood — a Lot of Information. Multiplex Technology xMAP for Clinical Laboratory Diagnostics: Potentials and Perspectives A.N. Danilov
The article deals with a new method of laboratory diagnostics - flow multiplex chemiluminescence analysis on microspheres. Its technical characteristics, advantages, perspectives for clinical use and further development are discussed.
Key words: multiplex, chemiluminescence, flow cytometry, microspheres, laboratory diagnostics.
