Научная статья на тему 'ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ HAND-MADE CLONING (обзор литературы)'

ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ HAND-MADE CLONING (обзор литературы) Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
311
45
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
клонирование / перенос ядра соматической клетки / эмбрион / Hand-made Cloning / cloning / somatic cell nuclear transfer / embryo / Hand-made Cloning

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Кириенко Константин Владимирович, Апрышко Валентина Петровна, Яковенко Сергей Александрович

Тема настоящего обзора посвящена технике Hand-made Cloning, т. е. технике «ручного» клонирования, которая является альтернативным методом переноса ядер соматических клеток. Классический метод ядерного переноса с целью получения клонированных животных требует использования дорогостоящего и сложного оборудования, в том числе инвертированного микроскопа и микроманипуляторов. Инновационный подход техники Hand-made Cloning подразумевает манипулирование с ооцитами и эмбрионами, лишенными блестящей оболочки, так как удаление zona pellucida существенно облегчает и ускоряет отдельные этапы технологии клонирования, что приводит к сравнимому, или даже более высокому уровню рождаемости, чем при использовании традиционного клонирования. Применение Handmade Cloning радикально снижает затраты на приобретение дорогостоящего оборудования и потребность в квалифицированной рабочей силе. Кроме того, техника Hand-made Cloning позволяет интенсифицировать производственный процесс получения клонированных эмбрионов и увеличить эффективность технологии клонирования в целом.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Кириенко Константин Владимирович, Апрышко Валентина Петровна, Яковенко Сергей Александрович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

FARM ANIMAL CLONING TECHNOLOGY BY HAND-MADE CLONING (literature review)

The topic of this review is devoted to the Hand-made Cloning technique, i.e. the technique of “manual” cloning, which is an alternative method of somatic cells nuclear transfer. The classical method of nuclear transfer to obtain cloned animals requires the use of expensive and sophisticated equipment, including an inverted microscope and micromanipulators. The innovative approach of the Hand-made Cloning technique involves the manipulation of zona pellucida free oocytes and embryos, since the removal of the zona pellucida greatly facilitates and speeds up the individual steps of the cloning technology, resulting in a comparable or even higher birth rate than using traditional cloning. The application of Hand-made Cloning radically reduces the cost of acquiring expensive equipment and the need for skilled labor. In addition, the Hand-made Cloning technique makes it possible to intensify the production process for obtaining cloned embryos and increase the efficiency of cloning technology as a whole.

Текст научной работы на тему «ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ HAND-MADE CLONING (обзор литературы)»

DOI: 10.24412/2074-5036-2023-4-15-22 УДК: 591.392

Ключевые слова: клонирование, перенос ядра соматической клетки, эмбрион, Hand-made Cloning

Key words: cloning, somatic cell nuclear transfer, embryo, Hand-made Cloning

Кириенко К. В., 'Апрышко В. П., 1,2 Яковенко С. А.

ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

МЕТОДОМ HAND-MADE CLONING (обзор литературы)

FARM ANIMAL CLONING TECHNOLOGY BY HAND-MADE CLONING

(literature review)

'Биотехнологическая лаборатория «Альтраген» (ООО «Альтраген»). Адрес: 352333, Краснодарский край, г. Усть-Лабинск, ул. Тельмана, д. 47

Biotechnological laboratory "Altragen" ("Altragen" LLC) Address: 352333, Krasnodarsky Krai, Ust-Labinsk, Telmana st., 47 2ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова». Адрес: 119991, Российская Федерация, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, с. 2.

Moscow State University named after M. V. Lomonosov. Address: Leninskie Gory, 1 bld. 2, Moscow, 119991, Russian Federation

Кириенко Константин Владимирович; к. б. н.; ведущий эмбриолог. E-mail: [email protected]

Kirienko Konstantin Vladimirovich; PhD of Biological Sciences; Leading Embryologist.

Е-mail: kkiriyenko@ramblerru Апрышко Валентина Петровна; к. б. н.; ведущий эмбриолог. E-mail: [email protected] Apryshko Valentina Petrovna; PhD of Biological Sciences; Leading Embryologist. Е-mail: [email protected] Яковенко Сергей Александрович; к. ф.-м. н.; ведущий эмбриолог биотехнологической лаборатории «Альтраген»; научный сотрудник МГУ им. М. В. Ломоносова, физический факультет,

кафедра биофизики. E-mail: [email protected] Yakovenko Sergey Aleksandrovich, PhD of Physical and Mathematical Sciences; Leading Embryologist of the Biotechnological Laboratory "Altragen"; Researcher of Moscow State University, Faculty of Physics,

Biophysics Department. Е-mail: [email protected]

Аннотация: Тема настоящего обзора посвящена технике Hand-made Cloning, т. е. технике «ручного» клонирования, которая является альтернативным методом переноса ядер соматических клеток. Классический метод ядерного переноса с целью получения клонированных животных требует использования дорогостоящего и сложного оборудования, в том числе инвертированного микроскопа и микроманипуляторов. Инновационный подход техники Hand-made Cloning подразумевает манипулирование с ооцитами и эмбрионами, лишенными блестящей оболочки, так как удаление zona pellucida существенно облегчает и ускоряет отдельные этапы технологии клонирования, что приводит к сравнимому, или даже более высокому уровню рождаемости, чем при использовании традиционного клонирования. Применение Handmade Cloning радикально снижает затраты на приобретение дорогостоящего оборудования и потребность в квалифицированной рабочей силе. Кроме того, техника Hand-made Cloning позволяет интенсифицировать производственный процесс получения клонированных эмбрионов и увеличить эффективность технологии клонирования в целом.

Summary: The topic of this review is devoted to the Hand-made Cloning technique, i.e. the technique of "manual" cloning, which is an alternative method of somatic cells nuclear transfer. The classical method of nuclear transfer to obtain cloned animals requires the use of expensive and sophisticated equipment, including an inverted microscope and micromanipulators. The innovative approach of the Hand-made Cloning technique involves the manipulation of zona pellucida free oocytes and embryos, since the removal of the zona pellucida greatly facilitates and speeds up the individual steps of the cloning technology, resulting in a comparable or even higher birth rate than using traditional cloning. The application of Hand-made Cloning radically reduces the cost of acquiring expensive equipment and the need for skilled labor. In addition, the Hand-made Cloning technique makes it possible to intensify the production process for obtaining cloned embryos and increase the efficiency of cloning technology as a whole.

Введение

После рождения в 1996 г. овечки Долли методом переноса ядра соматической клетки (somatic cell nuclear transfer, SCNT), клонирование стало широко использоваться для получения сельскохозяйственных животных [52]. Клонированных животных получают бесполым путем из реконструированных эмбрионов, посредством слияния энуклеированного ооцита (цитопласта) с ядром соматической клетки (кариопласта), содержащим двойной набор хромосом (2n) [52]. В настоящее время SCNT имеет два методических исполнения: традиционное клонирование (с использованием микроманипуляторов) и так называемое «ручное» клонирование (Hand-made cloning, HMC).

Техника HMC - это один из вариантов SCNT, для выполнения которого нет необходимости в использовании микроманипуляторов и инвертированного микроскопа (основного дорогостоящего оборудования, используемого при традиционном SCNT), а все манипуляции выполняются «вручную» с использованием бинокулярной лупы. Данный метод приобрел популярность из-за своей низкой стоимости и нетребовательности к квалификации персонала, необходимого для его выполнения. Техника HMC может быть использована не только для внутривидового, но и с целью межвидового клонирования (для сохранения исчезающих видов), в получении трансгенных животных, для нужд регенеративной терапии, а также в создании экспериментальных животных, как моделей для изучения заболеваний [50]. Эта техника была впервые предложена австралийским эмбриологом Габором Вайтой [39]. В настоящее время HMC применяется для клонирования различных видов животных с равной или даже большей эффективностью, в сравнении с традиционной техникой SCNT.

История создания HMC

Клонирование млекопитающих путем переноса клеточных ядер в энуклеированные ооциты считается революционной и самой передовой отраслью биологии, однако его основные принципы были изложены уже более 80 лет назад [41], метод был успешно апробирован на земноводных в начале 1950-х годов [5]. Впоследствии были успешно получены фертильные клонированные лягушки, что проложило путь для клонирования млекопитающих [12].

Первая клонированная мышь была получена в 1981 г. с использованием в качестве донора ядра стволовой клетки, полученной из внутренней клеточной массы эмбриона, и перенесенной

в энуклеированную зиготу [13], а технология переноса клеточного ядра, используемая в настоящее время большинством лабораторий на млекопитающих, была опубликована еще в 1984 году [51].

С технической точки зрения, за последние 25 лет, единственным реальным изменением в технологии стало использование в качестве доноров кариопластов соматических клеток, вместо ранних эмбриональных клеток [52]. Получение овечки Долли (в качестве донора ядра использовалась дифференцированная эпителиальная клетка молочной железы) произвело революцию в мире клонирования, и впоследствии были клонированы различные виды животных.

В течении последней четверти века велся поиск различных технических решений, направленных на совершенствование технологии клонирования, и после многочисленных неудач была предложена реальная альтернатива традиционному клонированию. Как ни странно, основной идеей нового подхода явилось радикальное упрощение технологии, что повлекло за собой значительное сокращение затрат времени, снижение инвестиций в оборудование и требований к квалификации персонала [46].

Принцип нового подхода оказался прост. Сложившееся мнение о необходимости для развития эмбриона блестящей оболочки (zona pellucida) ограничивало разработку и внедрение новых методических подходов. Предпринимались лишь спорадические попытки нарушить эту догму. Однако, постепенно накапливающие -ся данные, сначала о возможности оплодотворения in vitro без блестящей оболочки [53], а затем о возможности активации партеногенеза и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота и свиней [2, 3] постепенно открыли путь для манипуляций in vitro без zona pellucida. Первая опубликованная работа, в которой осуществили ядерный перенос в энуклеированные цито-пласты без zona pellucida, была выполнена в 1995 году [44]. К сожалению, метод энуклеации (центрифугирование ооцитов без zona pellucida в градиенте плотности) был ненадежным и после слияния с эмбриональными клетками не было получено телят. Однако изобретение в 1998 г. группой Пеура «ручной» энуклеации при помощи лезвия и приклеивания полярного тела (в качестве ориентира) к оолеме фитоге-магглютинином с последующим слиянием двух энуклеированных ооцитов в один, позволило создать надежную систему реконструирования [32]. К сожалению, даже после получения нескольких клонированных телят, эта группа уче-

ных оказалась от использования предложенной ими техники реконструирования [31].

Собрать воедино методические подходы и сформировать альтернативную технику SCNT удалось лишь к 2001 году. Решение оказалось простым: энуклеацию осуществляли вручную при помощи лезвий, перед слиянием соматическую клетку приклеивали к поверхности цито-пласта с помощью фитогемагглютинина, а реконструированные эмбрионы культивировали индивидуально в капиллярах или микролунках [45, 48, 49].

Для предотвращения агрегации отдельных реконструированных эмбрионов без zona pellucida во время культивирования наиболее эффективной оказалась модифицированная система культивирования WOW (well-of-the-well, «лунка в лунке») [3]. В отличие от обычно используемых микрокапель, система WOW с микролунками конической формы предоставляет уникальные преимущества для культивирования эмбрионов без zona pellucida, удерживая бластомеры вместе и обеспечивая стабильное микроокружение для развивающегося эмбриона. Значительный вклад в разработку техники HMC наряду с системой культивирования WOW внес Габор Вайта [48].

В связи с тем, что все манипуляции можно выполнить вручную, без использования сложных инструментов, технология получила название «ручное клонирование» (Hand-made Cloning, HMC) [49]. Несмотря на появление такой упрощенной альтернативной техники, некоторые специалисты в области клонирования до сих пор предпочитают использовать микроманипуляторы для энуклеации ооцитов (как с блестящей оболочкой, так и без нее) [2, 3]. Позднее в результате работы нескольких исследовательских групп по внедрению и усовершенствованию техники HMC было получено клонированное потомство от различных видов животных, таких как крупный рогатый скот [1, 39, 49], овцы [19] свиньи [2, 8], верблюды [28] и мыши [34].

Основные этапы техники HMC

Техника HMC уникальна тем, что для энуклеации и слияния цитопласта с донорской клеткой используются ооциты без zona pellucida. Основные этапы HMC представлены на рисунке 1.

В результате энуклеации при отрезании части ооцита, содержащей экструдирующееся веретено деления, происходит потеря части цитоплазмы (15-50 % объема ооцита). Чтобы компенсировать эту потерю, с донорской клеткой сливают две энуклеированные половинки ооцитов, таким образом у реконструированного эмбриона проис-

ходит восстановление объема цитоплазмы [29]. Уменьшение объема цитоплазмы реципиентного ооцита/ов может негативно повлиять на способность реконструированного эмбриона развиваться до стадии бластоцисты [54].

Дозревание ооцитов in vitro и энуклеация

Дозревание ооцитов in vitro проводят в течение 22-24 часов с использованием специальных сред, содержащих такие гормоны, как ФСГ, ЛГ и эстрадиол [14]. После дозревания ооцит-ку-мулюсные комплексы денудируют при помощи мягкой обработки на вортексе в растворе гиалу-ронидазы. Экструзию веретена деления у ооцитов провоцируют обработкой в течение 1-2 ч де-

1 а. •в •at

г. • ' 1 Д- И,

т ж. 9 3. • ^ и.

% м.

Рис. 1. Основные этапы клонирования техникой HMC (на примере ооцитов/эмбрионов крупного рогатого скота). а. - Ооцит-кумулюсные комплексы выделенный из яичника; б. - Ооцит-кумулюсные комплексы после дозревания in vitro; в. - Зрелые денуди-рованные ооциты на стадии MII после удаления клеток кумулюса с помощью гиалуронидазы; г. - Ооциты без zona pellucida после обработки демекольцином и проназой с экструдирующимся веретеном деления; д. - Энуклеация ооцита с помощью микролезвия путем отрезания части ооцита, содержащей веретено деления; е. - Донорская клетка, приклеенная с помощью фитогемагглютинина к оолеме одного из цитопластов;

ж. - Комплекс цитопласт/кариопласт/цитопласт между электродами в камере для электрослияния;

з. - Триплет в процессе слияния; и. - Слитый триплет (реконструированный эмбрион) через 1 час после электрослияния; к. - реконструированный эмбрион, культивирующийся в лунке WOW; л. - 9-клеточный клонированный эмбрион, в лунке WOW; м. - клонированный эмбрион на стадии бластоцисты.

мекольцином (0,4-0,5 мкг/мл) с последующим удалением zona pellucida проназой, после чего лишенные блестящей оболочки ооциты поступают для энуклеации. Энуклеация осуществляется путем ориентированного отсечения микролезвием части ооцита, содержащей экс-трудирующееся веретено деления и/или полярное тельце [46, 48, 49].

Отбор клеток доноров кариопластов

В технологии клонирования очень важен выбор клеток доноров ядер. Кариопласты могут отличаться в отношении типа клеток, из которых они были получены, и стадии клеточного цикла.

На реконструированных эмбрионах козы не было обнаружено достоверных различий в жизнеспособности клонированных эмбрионов, полученных из фетальных фибробластов, или из фибробластов взрослого животного [14]. Сравнительное исследование влияния донорских клеток, полученных из различных источников у буйвола (фетальные фибробласты, фибробласты от новорожденных телят и от взрослого животного, клетки кумулюса), на эффективность технологии HMC показало, что кумулюсные клетки превосходят все остальные типы клеток по способности клонированных эмбрионов развиваться до стадии бластоцисты [38]. В другом исследовании в качестве кариопластов были использованы соматические клетки, выделенные из мочи, в результате чего методом HMC удалось получить клонированного теленка буйвола [26].

В работах по клонированию буйволов в качестве клеток доноров с успехом использовали лимфоциты, выделенные из периферической крови и соматические клетки, выделенные из молока [15, 16]. Для должного репрограммирования клеточного ядра в реконструированном эмбрионе также важен отбор донорских клеток на стадии G0/G1 клеточного цикла. Исследование влияния роско-витина на улучшение синхронизации донорских клеток на стадии G0/G1 показало, что обработка росковитином (30 мкМ) клеток доноров способствует более высокой частоте развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты (62,9 %) по сравнению с использованием клеток, находящихся в экспоненционной фазе роста [37].

При получении HMC эмбрионов свиньи использовали обработку дигитонином (пермеа-билизирующего агента) и экстрактом икринок Xenopus laevis свиных фибробластов, которые впоследствии использовались как донорские клетки [24]. Интересно, что и дигитонин, и экстракт икринок значительно увеличивали частоту формирования бластоцист у клонированных

эмбрионов. Для получения HMC козьих эмбрионов использовали три типа клеток доноров: фи-бробласты взрослых животных, эмбриональные стволовоподобные клетки и лимфоциты [9]. Эмбриональные стволовоподобные клетки превосходили другие типы клеток по способности клонированных эмбрионов развиваться до стадии бластоцисты.

Электрослияние, активация и культивирование HMC эмбрионов

Донорская клетка прикрепляется к одному из цитопластов при помощи фитогемагглютинина, после чего мембраны комплекса цитопласт/ка-риопласт сливают при помощи прямоугольного электрического импульса в камере для электрослияния. Возможен вариант слияния триплета цитопласт/кариопласт/цитопласт. Были оптимизированы параметры электрослияния при реконструировании эмбрионов буйвола и козы [14, 37]. Выравнивание триплетов цитопласт/кариопласт/ цитопласт в переменном электрическом поле проводили при 4 В с последующим одноэтап-ным слиянием прямоугольным импульсом постоянного тока 2,1-3,36 кВ/см в течение 4-5 мкс. После электрослияния реконструированный эмбрион подвергают воздействию Ca-ионофора и 6-диметиламинопурина (6-DMAP) с целью снятия блока MII и партеногенетической активации развития. Реконструированные эмбрионы после активации переносят в культуральную среду для последующего развития эмбрионов. Было обнаружено, что HMC эмбрионы с ранним дроблением превосходят по жизнеспособности эмбрионы, первое дробление которых происходит с запозданием (> 24 ч после культивирования in vitro) [17]. В исследовании по получению HMC эмбрионов минипигов был использован уникальный способ агрегации и культивирования клонированных эмбрионов [40]. Три клонированных эмбриона, находящихся на 4-клеточной стадии развития, объединяли в один, после чего культивировали in vitro до стадии бластоцисты и переносили в матку суррогатной матери. Данная стратегия объединения эмбрионов позволила почти в два раза повысить частоту образования бластоцист (73,6 % против 35,1 %), чем при культивировании одного клонированного эмбриона.

Эпигенетическое репрограммирование ядра донорской клетки

Аномалии, наблюдаемые у клонированных животных, полученных в результате проведения традиционного SCNT или с использованием техники HMC, в значительной степени связаны

с ненадлежащим эпигенетическим репрограм-мированием хроматина ядра донорской клетки в течение раннего развития клонированного эмбриона. Основной причиной неудач технологии клонирования при SCNT является аберрантное эпигенетическое репрограммирование, в особенности геномное гиперметилирование [36].

Эпигенетические модификации генома могут быть вызваны искусственно в условиях in vitro с использованием химических агентов при культивировании клеток доноров или в процессе культивирования самих эмбрионов. Так, в исследовании по обработке донорских клеток вальпроевой кислотой (VPA, ингибитор гистондеацетилазы) увеличилась частота развития HMC эмбрионов до стадии бластоцисты с одновременным снижением доли дегенеративных эмбрионов [42].

Исследование действия трихостатина-А (TSA, ингибитор гистондеацетилазы) и 5-аза-2'-дезоксицитидина ^-аза-dC, ингибитор ДНК-метилтрансферазы) показало их превосходное действие, оказываемое на развитие HMC эмбрионов буйвола [35]. Обработка свиных реконструированных эмбрионов TSA позволила увеличить их развитие до стадии бластоцисты с 54 до 80 % и получить живых поросят [23]. Также с целью улучшения репрограмирования генома при получении HMC эмбрионов применяют другой ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) скриптэйд (scriptaid) [30]. Использование скриптэйда в концентрации 1 мкМоль/л через 10 часов после реконструирования HMC эмбрионов буйвола значительно увеличило долю дробящихся эмбрионов, а также их развитие до стадии бластоцисты. С целью улучшения репрограмирования генома может также применяться аскорбиновая кислота [6]. Добавление аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкг/мл в среду для культивирования улучшало развитие эмбрионов до стадии бластоцисты и увеличивало общее число клеток в ней [18].

Получение трансгенных животных с использованием техники HMC

Получение генетически модифицированных организмов уже стало реальностью и с каждым днем приобретает все большую популярность в связи с их широким применением в трансгенном животноводстве и биофармацевтике. В настоящее время множество исследовательских групп по всему миру получают трансгенных с.-х. животных, используя хорошо зарекомендовавшую себя технику HMC в сочетании с трансгенозом. Данный симбиоз технологий уже широко используется и является признанным методом получения трансгенных свиней [47].

Недавно были получены нокаутированные по двум генам свиньи с использованием системы CRISPER/Cas9 и техники НМС [11]. В свиных эмбриональных фибробластах были нокаутированы два гена: а1,3-галактозилтрансфераза (GGTA1) и гидроксилаза цитидинмонофосфат-^ацетилнейраминовой кислоты (СМАН). Полученные трансгенные свиньи могут быть использованы как доноры для трансплантации органов человеку (ксенотрансплантации), в связи со сниженной реакцией отторжения трансплантата. В другом исследовании с использованием реком-бинантных донорских клеток были получены НМС трансгенные поросята, несущие ген fat-1 нематоды (Caenorhabditis elegans) (п-3 десатура-за жирных кислот) [56]. Фермент п-3 десатураза жирных кислот, отсутствующий у млекопитающих, превращает п-6 жирные кислоты в п-3 полиненасыщенные жирные кислоты, что повышает питательную ценность свинины за счет синтеза омега-3 жирных кислот. Так же с использованием трансгенных фибробластов, несущих ген mfat-1 (кодон-оптимизированный ген fat-1) и техники НМС, были получены трансгенные ягнята [55]. Сочетанное использование технологии транс-геноза и техники НМС позволило получить модельных по болезни Альцгеймера поросят [20].

Преимущества и недостатки НМС

Ряд исследовательских групп в области клонирования провели критическую оценку техники НМС и сообщили о ее преимуществах и недостатках [27, 39, 46, 50].

Несомненные преимущества новой техники клонирования были продемонстрированы на двух видах сельскохозяйственных животных: на крупном рогатом скоте и свиньях.

Эффективность энуклеации достаточно высока (96-98 %), поэтому процедура может быть успешно проведена практически на всех ооцитах М11, при этом отпадает необходимость в дальнейшем окрашивании и отборе цитопластов без хроматина. Соответственно, нет необходимости в приобретении дорогостоящего инвертированного флуоресцентного микроскопа и использования потенциально вредной УФ-микроскопии.

Резкое снижение стоимости оборудования и инструментов (для НМС требуется только бинокулярная лупа и электропоратор, в отличие от используемых при классическом SCNT микроманипуляторов, инвертированных микроскопов, микрокузниц для изготовления инструмента или дорогих микропипеток) на порядок снижает требуемые инвестиции, чтобы превратить обычную лабораторию в современный центр клонирования [39].

Специалист, обладающий базовыми знаниями в области эмбриологии, может освоить HMC крупного рогатого скота за одну неделю, а HMC свиней - за 2-3 недели, причем частота развития реконструированных эмбрионов до стадии бла-стоцисты может достигать 50 % [21].

Применяя технику HMC, опытный специалист по клонированию может получить от 30 до 50 реконструированных эмбрионов на стадии бластоцисты из 200 ооцитов, полученных со скотобойни. Данные свидетельствуют об отсутствии снижения частоты наступления беременности после криоконсервации эмбрионов, полученных методом HMC [46].

Перенос эмбрионов без zona pellucida также не представляет из себя никакой технической проблемы. Все большее число наблюдений показывает, что отсутствие блестящей оболочки не мешает нормальному развитию эмбрионов.

Широкомасштабное применение систем культивирования эмбрионов без zona pellucida повысило общую эффективность эмбриологического этапа у домашних животных и не привело к каким-либо неблагоприятным последствиям [25].

Как у крупного рогатого скота, так и у свиней возможно достичь уровня беременности порядка 50 % на 1 перенесенный клонированный эмбрион без zona pellucida [7]. По имеющимся данным, у крупного рогатого скота не наблюдалось существенной разницы в частоте возникновения врожденных аномалий развития между эмбрионами SCNT и НМС, а у полученных после НМС поросят, не было обнаружено серьезных нарушений развития. С помощью HMC был получен максимальный приплод (10 поросят) от одной свиноматки, в том числе и при пересчете на один перенесенный клонированный эмбрион (22 %) [7]. Аналогичные результаты были получены при переносах клонированных эмбрионов без zona pellucida у лошадей и мышей [22, 33].

Следует, конечно, отметить и недостатки, присущие HMC по сравнению с использованием традиционного SCNT, хотя они являются достаточно условными. Единственная отрицательная особенность HMC заключается в том, что свободные от зон ооциты, цитопласты и реконструированные эмбрионы могут приклеиваться друг к другу; их последующее разделение требует времени и иногда приводит к потерям. Соблюдая некоторую осторожность и используя среды с повышенным содержанием макромолекул этой проблемы можно полностью избежать. Другой часто упоминаемой проблемой является отсутствие защитного слоя - блестящей оболочки, что может привести к контаминации болезнетворны-

ми агентами [10]. Однако, говоря об этом, нельзя игнорировать тот факт, что zona pellucida не является целостной и в технологии традиционного SCNT, поэтому теоретическая опасность контаминации приблизительно одинакова для обоих способов [46].

Культивирование эмбрионов без zona pellucida может также приводить к дезорганизации бласто-меров, что может негативно повлиять на процесс компактизации [43]. Однако, данного феномена можно полностью избежать, используя культивирование эмбрионов по типу «лунка в лунке».

Может вызывать опасения гетероплазмия, вызванная тремя разными источниками митохондрий, однако до сих пор отсутствуют экспериментальные или практические доказательства негативного влияния такой гетероплазмии.

Дальнейшие перспективы HMC

Самым большим потенциальным преимуществом является возможность автоматизации техники HMC. Микроканальная или микрофлюидная технология сегодня широко используется в различных отраслях знаний, в том числе в биологии, а ее применение уже опробовано в эмбриологии. Единственная серьезная проблема, которую еще предстоит решить, - это интеграция отдельных этапов в единую производственную линию. Это открыло бы совершенно новые горизонты для технологии клонирования в частности и для эмбриологии в общем, позволяя получать эмбрионы высшего качества с помощью строго стандартизированных и воспроизводимых методов [46].

Список литературы

1. Bhojwani S., Developmental Competence of HMC Derived Bovine Cloned Embryos Obtained from Somatic Cell Nuclear Transfer of Adult Fibroblasts and Granulosa Cells / S. Bhojwani, G. Vajta, H. Callesen, K. Roschlau, A. Kuwer, F. Becker, H. Alm, H. Torner, W. Kanitz, R. Poehland // J. Reprod. Dev. 2005, 51, 465-475.

2. Booth P. J. Application of the zona-free manipulation technique to porcine somatic nuclear transfer. / P. J. Booth, S. J. Tan, P. Holm, H. Callesen // Cloning Stem Cells. 2001;3(4):191-7. doi: 10.1089/15362300152725909.

3. Booth P. J. Simplification of bovine somatic cell nuclear transfer by application of a zona-free manipulation technique. / P. J. Booth, S. J. Tan, R. Reipurth, P. Holm, H. Callesen // Cloning Stem Cells. 2001;3(3):139-50. doi: 10.1089/153623001753205098.

4. Booth P. J. Application of the zona-free manipulation technique to porcine somatic nuclear transfer. / P. J. Booth, S. J. Tan, P. Holm, H. Callesen // Cloning Stem Cells 3, (2001)191-197. doi: 10.1089/15362300152725909.

5. Brigg R. Nuclear transplantation studies on the early gastrula (Rana pipiens). / R. Briggs, T. J. King // Dev. Biol. 1952. 2, 252-270.

6. Chawalit S. Trichostatin A and ascorbic acid assist in the development of porcine handmade cloned embryos via different

physiologic pathways. / S. Chawalit, N. T. Nguyen, J. K. Tseng, N. W. Lo, C. F. Tu, J. C. Ju // Reprod Sci. 2012, 19(9), 976-86.

7. Du Y. Piglets born from handmade cloning, an innovative cloning method without micromanipulation. / Y. Du, P. M. Kragh, Y. Zhang, J. Li, M. Schmidt, I. B. B0gh, X. Zhang, S. Purup, A. L. J0rgensen, A. M. Pedersen, K. Villemoes, H. Yang, L. Bolund, G. Vajta // Theriogenology. 2007 Nov;68(8):1104-10. doi: 10.1016/j.theriogenology.2007.07.021.

8. Du Y. High overall in vitro efficiency of porcine handmade cloning (HMC) combining partial zona digestion and oocyte trisection with sequential culture / Y. Du, P. M. Kragh, X. Zhang, S. Purup, H. Yang, L. Bolund, G. Vajta // Cloning Stem cells, 2005, 7(3), 199-205. doi: 10.1089/clo.2005.7.199.

9. Dutta R. Production and characterization of putative ntES cells from handmade cloned goat embryos derived from adult fibroblast donor cells / R. Dutta, D. Malakar, Y. S. Akshey, S. Sahu, M. K. Jena, D. Banerjee et al.// J Reprod Stem Cell Biotechnol. 2011;2:64-76.

10. Elsheikh A. S. Developmental ability of mouse late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. / A. S. Elsheikh, Y. Takahashi, M. Hishinuma, H. Kanagawa // J Vet Med Sci. 1997;59:107-113. doi: 10.1292/ jvms.59.107.

11. Gao H. Production of alpha1,3-galactosyltransferase and cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase gene double-deficient pigs by CRISPR/Cas9 and handmade cloning. / H. Gao, C. Zhao, X. Xiang et al. // J reprod dev. 2017;63(1):17-26.

12. Gurdon J. B. "Fertile" intestine nuclei. / J. B. Gur-don, V. Uehlinger // Nature 1966, 210, 1240-1241. doi: 10.1038/2101240a0.

13. Illmensee K. Nuclear transplantation in Mus musculus: developmental potential of nuclei from preimplantation embryos. / K. Illmensee, P. C. Hoppe // Cell, 1981, 23, 9-18. doi: 10.1016/0092-8674(81)90265-8.

14. Jena M. K. Handmade cloned and parthenogenetic goat embryos - A comparison of different culture media and donor cells. / M. K. Jena, D. Malakar, A. K. De, S. Garg, Y. S. Akshey, R. Dutta et al. // Small Rumin Res. 2012;105:255-262. doi: 10.1016/j.smallrumres.2012.03.001.

15. Jyotsana B. Use of peripheral blood for production of buffalo (Bubalus bubalis) embryos by handmade cloning. / B. Jyotsana, A. A. Sahare, A. K. Raja, K. P. Singh, N. Nala, S. K. Singla, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta // Theriogenology 2016, 86(5), 1318-1324. Doi: 10.1016/j. theriogenology.2016.04.07.

16. Jyotsana B. Handmade Cloned Buffalo (Bubalus bubalis) Embryos Produced from Somatic Cells Isolated from Milk and Ear Skin Differ in Their Developmental Competence, Epigenetic Status, and Gene Expression. / B. Jyotsana, A. A. Sahare, A. K. Raja, K. P. Singh, S. K. Singla, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta // Cell Reprogram. 2015, 17(5), 393-403. doi: 10.1089/cell.2015.0027.

17. Kaith S. Early cleavage of handmade cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos is an indicator of their developmental competence and quality. / S. Kaith, M. Saini, A. K. Raja, A. A. Sahare, B. Jyotsana, P. Madheshiya et al. // Reprod Domest Anim. 2015;50:214-220. doi: 10.1111/rda.12472.

18. Kere M. Ascorbic Acid Improves the Developmental Competence of Porcine Oocytes After Parthenogenetic Activation and Somatic Cell Nuclear Transplantation / M. Kere, C. Siriboon, N.-W. Lo, N. T. Nguyen, J. C. Ju // J Reprod Dev. 2013, 59(1), 78-84. doi: 10.1262/jrd.2012-114.

19. Khan S. Comparison of efficiency of in vitro cloned sheep embryo production by conventional somatic cell nuclear transfer and handmade cloning technique. / S. Khan, M. Tali, A. Khan, S. Bhat, A. Ashraf, M. H. Bhat, F. Khan,

R. A. Shah // Reprod Dom Anim. 2018;00:1-7. Doi: 10.1111/ rda.13138/

20. Kragh P. M. Hemizygous minipigs produced by random gene insertion and handmade cloning express the Alzheimer's disease-causing dominant mutation APPsw. / P. M. Kragh, A. L. Nielsen, J. Li, Y. Du, L. Lin, S. Schmidt, I. B. B0gh, I. E. Holm, J. E. Jakobsen, M. G. Johansen, S. Purup, L. Bolund, G. Vajta, A. L. J0rgensen // Transgenic Res. 2009;18:545-558.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

21. Kragh, P. M. Efficient in vitro production of porcine blastocysts by handmade cloning with combined electric and chemical activation. / P. M. Kragh, Y. Du, T. J. Corydon, S. Purup, L. Bolund, G. Vajta // Theriogenology (2005) 64, 1536-1545. doi: 10.1016/j.theriogenology.2005.03.02.

22. Lagutina I. Somatic cell nuclear transfer in horses: effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. / I. Lagutina, G. Lazzari, R. Duchi, S. Colleoni, N. Ponderato, P. Turini, G. Crotti, C. Galli // Reproduction. 2005 0ct;130(4):559-67. doi: 10.1530/rep.1.00772.

23. Li J. High in vitro development after somatic cell nuclear transfer and trichostatin A treatment of reconstructed porcine embryos. / J. Li, O. Svarcova, K. Villemoes, P. Kragh, M. Schmidt, I. B. B0gh, Y. Zhang, Y. Du, L. Lin, S. Purup, Q. Xue, L. Bolund, H. Yang, P. Maddox-Hyttel, G. Vajta // Theriogenology 2008, 70(5), 800-8. doi: 10.1016/j. theriogenology.2008.05.046.

24. Liu Y. Increased blastocyst formation of cloned porcine embryos produced with donor cells pre-treated with Xenopus egg extract and/or digitonin. / Y. Liu, O. Ostrup, J. Li, G. Vajta, L. Lin., P. M. Kragh, S. Purup, P. Hyttel, H. Callesen // Zygote, 2012. 20 (1): 61-6. doi: 10.1017/S096719941000064X.

25. Madani S. An Alternative Way to Improve Mammalian Embryo Development In Vitro: Culture of Zona Pellucida-Free Embryos. / S. Madani, Z. Machaty, G. Vajta // Cellular Reprogramming. 2022. Vol. 24, No. 3, 111-117. doi: 10.1089/ cell.2022.0012.

26. Madheshiya, P. K. Production of a Cloned Buffalo (Bubalus bubalis) Calf from Somatic Cells Isolated from Urine. / P. K. Madheshiya, A. A. Sahare, B. Jyotsana, K. P. Singh, M. Saini, A. K. Raja, S. Kaith, S. K. Singla, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta // Cell Reprogram, v.17, n.3, p.160-169, 2015. doi: 10.1089/cell.2014.0097.

27. Mahdi E. Handmade cloning: an alternative technique for somatic cell nuclear transfer. / E. Mahdi, H. Fakhrisadat // Annals of Biological Research. 2012;3:3043-3048.

28. Moulavi F. Development of a modified method of handmade cloning in dromedary camel. / F. Moulavi, S. M. Hos-seini // PLoS ONE. 2019. 14(4): e0213737. Doi: 10.1371/ journal.pone.0213737.

29. Panda S. K. Effect of cytoplasmic volume on developmental competence of buffalo (Bubalus bubalis) embryos produced through hand-made cloning. / S. K. Panda, A. George, A. P. Saha, R. Sharma, R. S. Manik, M. S. Chauhan, P. Palta, S. K. Singla // Cell. Reprogram. 2011. 13: 257-262. doi: 10.1089/cell.2010.0096.

30. Panda S. K. Effect of scriptaid, a histone deacetylase inhibitor, on the developmental competence of Handmade cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos. / S. K. Panda, A. George, A. Saha, R. Sharma, A. K. Singh, R. S. Manik, M. S. Chauhan, P. Palta, S. Singla // Theriogenology 2012, 77(1), 195-200. doi: 10.1016/j.theriogenology. 2011.07.033.

31. Peura T. T. Development of bovine embryo-derived clones after increasing rounds of nuclear recycling. / T. T. Peura, M. W. Lane, I. M. Lewis, A. O. Trounson // Mol Reprod Dev. 2001 Apr;58(4):384-9. doi: 10.1002/1098-2795 (20010401)58:4<384::AID-MRD5>3.0.CO;2-N.

32. Peura T. T. The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle. / T. T. Peura, I. M. Lewis, A. O. Trounson

// Mol Reprod Dev. 1998 Jun;50(2):185-91. doi: 10.1002/ (SICI)1098-2795(199806)50:2<185::AID-MRD9>3.0.C0;2-G.

33. Ribas R. Modifications to Improve the Efficiency of Zona-Free Mouse Nuclear Transfer. / R. Ribas, B. Oback, W. Ritchie, T. Chebotareva, J. Taylor, A. C. Mauricio, M. Sousa, I. Wilmut // Cloning and Stem Cells. Mar 2006.10-15. doi: 10.1089/clo.2006.8.10.

34. Ribas R. Development of a zona-free method of nuclear transfer in the mouse. / R. Ribas, B. Oback, W. Ritchie, T. Chebotareva, C. Clarke, I. Wilmut // Cloning Stem Cells, 2005, 7, 126-138. Doi: 10.1089/clo.2005.7.126

35. Saini M. Treatment of Donor Cells and Reconstructed Embryos with a Combination of Trichostatin-A and 5-aza-2'-Deoxycytidine Improves the Developmental Competence and Quality of Buffalo Embryos Produced by Handmade Cloning and Alters Their Epigenetic Status and Gene Expression. / M. Saini, N. L. Selokar, H. Agrawal, S. K. Singla, M/ S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta // Cell Reprogram. 2017, 19(3), 208-215. doi: 10.1089/cell.2016.0061.

36. Selokar N. L. Downregulation ofDNA Methyltransferase 1 in Zona-Free Cloned Buffalo (Bubalus bubalis) Embryos by Small Interefering RNA Improves In Vitro Development But Does Not Alter DNA Methylation Level. / N. L. Selokar, M. Saini, H. Agrawal, P. Palta, M. S. Chauhan, R. Manik, S. K. Singla // Cell Reprogram. 2015, 17(2), 89-94. doi: 10.1089/ cell.2014.0056.

37. Selokar N. L. Effect of post-fusion holding time, orientation and position of somatic cell-cytoplasts during electrofusion on the development of handmade cloned embryos in buffalo (Bubalus bubalis). / N. L. Selokar, R. A. Shah, A. P. Saha, M. Muzaffar, M. Saini, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta, S. K. Singla // Theriogenology 2012, 78(4), 930-6. doi: 10.1016/j.theriogenology.2012.03.018

38. Shah R. A. Pregnancies established from handmade cloned blastocysts reconstructed using skin fibroblasts in buffalo (Bubalus bubalis). / R. A. Shah, A. George, M. K. Singh, D. Kumar, T. Anand, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta, S. K. Singla // Theriogenology 2009, 71(8), 1215-9. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2008.10.004.

39. Singla S. K. Hand-made Cloning: A Guide for Cloning Water Buffaloes. / S. K. Singla, A. Raja, N. Nala, M. S. Chauhan, R. S. Manik, P. Palta // MGM J Med Sci 2014;1(3):126-131.

40. Siriboon C. Production of viable cloned miniature pigs by aggregation of handmade cloned embryos at the 4-cell stage. / C. Siriboon, C. F. Tu, M. Kere, M. S. Liu, H. J. Chang, L. L. Ho, M. E. Tai et al. // Reprod Fertil Dev. 2014;26:395-406. doi: 10.1071/RD12243.

41. Spemann H. Embryonic Development and Induction. / H. Spemann. Yale University Press, 1938. P. 211.

42. Sun J. M. Suberoylanilide hydroxamic acid, a novel histone deacetylase inhibitor, improves the development and acetylation level of miniature porcine handmade cloning embryos. / J. M. Sun, K. Q. Cui, Z. P. Li, X. R. Lu, Z. F. Xu,

Q. Y. Liu, B. Huang, D. S. Shi // Reprod Domest Anim. 2017, doi: 10.1111/rda.12977.

43. Suzuki H. Developmental ability of zona-free mouse embryos is influenced by cell association at the 4-cell stage. / H. Suzuki, M. Togashi, J. Adachi, Y. Toyoda // Biol Reprod. 1995;53:78-83. doi: 10.1095/biolreprod53.1.78.

44. Tatham B. G. Enucleation by centrifugation of in vitromatured bovine oocytes for use in nuclear transfer. / B. G. Tatham, A. T. Dowsing, A. O. Trounson // Biol Reprod. 1995 Nov;53(5):1088-94. doi: 10.1095/biolreprod53.5.1088.

45. Thouas G. A. The GO system - a novel method for microculture for in vitro development of mouse zygotes to the blastocyst stage. / G. A. Thouas, G. M. Jones, A. O. Trounson // Reproduction. 2003 Aug;126(2):161-9. doi: 10.1530/rep.0.1260161.

46. Vajta G. Handmade cloning: the future way of nuclear transfer? / G. Vajta // Trends Biotechnol. 2007;25(6):250-3. doi: 10.1016/j.tibtech.2007.04.004.

47. Vajta G. Establishment of an efficient somatic cell nuclear transfer system for production of transgenic pigs. /

G. Vajta, H. Callesen // Theriogenology. 2012, 77(7), 1263-74. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.10.040.

48. Vajta G. Somatic cell cloning without micromanipulators. / G. Vajta, I. M. Lewis, P. Hyttel, G.A. Thouas, A. O. Trounson // Cloning. 2001;3(2):89-95. doi: 10.1089/15204550152475590.

49. Vajta G. Handmade somatic cell cloning in cattle: analysis of factors contributing to high efficiency in vitro. / G. Vajta, I. M. Lewis, A. O. Trounson, S. Purup, P. Maddox-Hyttel, M. Schmidt, H. G. Pedersen, T. Greve, H. Callesen // Biol Reprod. 2003 Feb;68(2):571-8. doi: 10.1095/biolreprod.102.008771.

50. Verma G. Handmade cloning: recent advances, potential and pitfalls. / G. Verma, J. Arora, R. Sethi et al. // J Animal Sci Biotechnol 6, 43 (2015). doi: 10.1186/s40104-015-0043-y.

51. Willadsen S. M. Nuclear transplantation in sheep embryos. / S. M. Willadsen // Nature 1986, 320, 63-65.

52. Wilmut I. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. / I. Wilmut, A. Schnieke, J. McWhir, A. J. Kind, K. H. S. Campbell // Nature 385, 810-813 (1997). https://doi.org/10.1038/385810a0.

53. Wu G.-M. Birth of piglets by in vitro fertilization of zonafree porcine oocytes. / G.-M. Wu et al. // Theriogenology. 2004. 62, 1544-1556.

54. Zakhartchenko V. Enucleation of bovine oocytes with minimal cytoplasmic volume: Effect on development of nuclear transfer embryos. / V. Zakhartchenko, M. Stojkovic, G. Palma, E. Wolf, G. Brem // Theriogenology, 1997, 47, 238.

55. Zhang P. Handmade Cloned Transgenic Sheep Rich in Omega-3 Fatty Acids. / P. Zhang, P. Liu, H. Dou, L. Chen, L. Chen, L. Lin et al. (2013) // PLoS ONE. 2013. 8(2): e55941. doi: 10.1371/journal.pone.0055941.

56. Zhang, P. Handmade Cloned Transgenic Piglets Expressing the Nematode Fat-1 Gene / P. Zhang, Y. Zhang,

H. Dou, J. Yin, Y. Chen, X. Pang, G. Vajta // Cell Reprogram. 2012, 14(3), 258-266. doi: 10.1089/cell.2011.0073.

I Подписной индекс журнала |

| «Актуальные вопросы ветеринарной биологии» |

1 в каталоге «ПРЕССИНФОРМ» - 33184 |

^ммммммммммммммммммммммммммммммммммм

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.