Технология «Капиллярный электрофорез-исп-мс» в метабономике Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

Калетин Г.И., Калетина Н.И., Брусиловский А.И.

Российская Академия медико-технических наук

ТЕХНОЛОГИЯ «КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ-ИСП-МС» В МЕТАБОНОМИКЕ

Методом КЭФ - ИСП-МС в режиме реального времени исследованы образцы крови экспериментальных животных, разделены металлотионеин и ферритин, определены уровни содержания в них кадмия, меди, цинка и железа. В эксперименте установлено значительное увеличение уровня кадмия в кадмий-металлотионеиновом комплексе, а также(по данным гамма-резонансной спектроскопии) констатировано изменение электронного состояния атомов железа в ферритине за счет конформацион-ных перестроек глобуллы

Метод капиллярного электрофореза (КЭ) с успехом применяется в медицине, биохимии, судебной химии, криминалистике, экологии, входном и технологическом контроле производства, для анализа катионов металлов, неорганических и органических анионов, наркотиков и других [1]. Мицел-лярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) - одна из форм КЭ, которая делает возможным разделение катионов, нейтральных растворенных веществ, анионов, смеси энантиомеров. КЭ является перспективным методом для технологий метаболомики и метабономики. Усовершенствование метода заключается в уменьшении размеров аналитических устройств (ЪаЪ-оп-сЫр). Идентификация пиков в КЭ происходит подобно тому же процессу в ВЭЖХ. Отличие заключается в том, что пробы движутся через детектор намного быстрее, а их количество и концентрация меньше приблизительно в 10 раз. Детектирование веществ происходит электрохимически, спектрально или с применением масс-спектрометра.

Если встает вопрос об опосредованном действии в результате антагонистического взаимодействия металлов, дисбалансе микроэлементов (МЭ) или нарушении метало-лигандного гомеостаза (МЛГ), то необходимы методы, позволяющие определять изменение содержания МЭ в белках со специфическим металлсвязывающими свойствами (например, в кадмий-металлотионеиновом комплексе - CdMT или ферритине. Для этих целей могут быть использованы тандемные технологии.

Возможность разделять биологически важные металлосодержащие молекулы в биологических жидкостях в режиме реального времени дает использование технологии «капиллярный электрофорез -ИСП-МС».

В наших исследованиях методом КЭФ - ИСП-МС были разделены металлотионеин и ферритин, а также определены уровни содержания кадмия, меди, цинка и железа в крови экспериментальных животных.

Анализ электрофореграммы позволил выявить разделение металлотионеина и ферритина в

крови экспериментального животного после проведения 5 сеансов интенсивной дистанционной лучевой терапии опухоли мочевого пузыря. При этом содержание в металлотионеине цинка и меди значительно меньшее, чем кадмия, в ферритине -высокий уровень железа. Предел обнаружения -10-10 -10-8 моль/л.

В контрольной группе животных достоверного различия в содержании кадмия, цинка и меди в металлотионеине не наблюдали, уровень железа в ферритине соответствовал естественному содержанию.

Разделение проводили в кварцевом капилляре внутренним диаметром 50 мкм и длиной 100 см на оборудовании фирмы Termo electron corporation.

Использовали электрокинетическое введение пробы. При этом способе ввода сосуд с пробой, в который погружен капилляр, соединяется с источником напряжения, и под действием короткого импульса напряжения компоненты пробы перемещаются в разделительный капилляр. Образец не должен быть более кислым или щелочным по сравнению с используемым буферным раствором. Значительная разница в рН и/или молярности может дать большую ошибку при анализе методом КЭ.

Для проверки воспроизводимости времени миграции в течение 2 мес. периодически проводили исследования тестовой смеси в выбранных условиях. Время миграции воспроизводимо для всех исследованных образцов. Относительное стандартное отклонение времени миграции за этот период не превышало 0,5%.

Программное обеспечение использованного прибора позволяет создавать собственные библиотеки спектров, по которым можно проводить сравнение получаемых в опыте результатов.

Неспецифическое связывание с белками, например, с сывороточным альбумином и гемоглобином, играет важную роль в процессах транспорта металлов в кровеносном русле и распределения металлов между эритроцитами и плазмой. Белки со специфическим металлсвязывающими свойством участвуют в транспорте металлов в клетку. Металлотионеины (МТ) - низко молеку-

114 ВЕСТНИК ОГУ №12/ДЕКАБРЬ'2006 Приложение БИОЭЛЕМЕНТОЛОГИЯ

Г i I '1ЛЛ

лярные металлсвязывающие белки (молекулярный вес приблизительно 7000 Да), состоящие из 61 аминокислотного остатка. МТ способен связывать 7-10 атомов металлов (Zn, Cu, Cd, Hg, Au, Ag) и предохраняет организм от интоксикации ионами металлов. МТ - класс серосодержащих металлс-вязывающих белков, продукция которых значительно усиливается в ответ на поступление ряда металлов, в том числе, кадмия, ртути, цинка, меди, цинка и некоторых других[4]. Разная степень сродства ионов к тем или иным биолигандам может быть причиной их антагонизма.

В экспериментах in vivo в режиме реального времени нарушение баланса МЭ сопровождалось повышением содержания МТ, образованием кад-мий-металлотионеинового комплекса (CdMT) с

высоким уровнем кадмия в соединении. Ферри-тин - белок, осуществляющий хранение железа в ретикулоэндотелиальных клетках печени, селезёнки и костей. Ферритин может функционировать как детоксикант, так как связывает многие токсичные металлы, включая кадмий, цинк, бериллий, алюминий.

Электронное состояние атомов железа в фер-ритине экспериментальных животных, во многом определяющее его функциональные свойства, по данным гамма-резонансной спектроскопии (ГРС) изменено, но не за счет изменения лигандного состава или зарядового состояния железа, а за счет незначительных конформационных перестроек глобулы. Полученные знания открывают новые пути управления функционированием белков.

Список использованной литературы:

1. Weinberger R. Practical Capillary Electrophoresis, Second Edn, New Y ork, Academic Press.- 2000.-487р.

2. A Textbook of Modern Toxicology /Edited by Ernest Hodgson.- John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. USA.- 2004. - 612p.

3. Калетина Н.И., Калетин Г.И. Микроэлементы-биологические регуляторы.//М.:изд. РАН, Наука в России.-2007.- №1(в печати).

4. Toxicogenomics: prinples and applications/ edited by Hisham K. Hamadeh, Cynthia A. Afshari. Wiley- Liss, USA.- 2004.- 361p

5. Brusilovskiy A.I. Two worlds in Histology: HxE and AB HxE. // Los Angeles, CA, USA.- Newsletter, July-December.- 2004.- 6р.

HM/LU

ВЕСТНИК ОГУ №12/ДЕКАБРЬ'2006 Приложение БИОЭЛЕМЕНТОЛОГИЯ 115