ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ХОЛОДНОГО ЖЕЛЕЗИСТОГО ИСТОЧНИКА ДАБАН-ГОРХОН (ВИТИМСКОЕ ПЛОСКОГОРЬЕ) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

БИОЛОГИЯ

Научная статья УДК 579.26

DOI: 10.18101/2542-0623-2023-3-7-16

ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ХОЛОДНОГО ЖЕЛЕЗИСТОГО ИСТОЧНИКА ДАБАН-ГОРХОН (ВИТИМСКОЕ ПЛОСКОГОРЬЕ)

Т. Г. Банзаракцаева, Д. Д. Бархутова

© Банзаракцаева Туяна Геннадьевна

кандидат биологических наук tuyana_banz@mail.ru

© Бархутова Дарима Дондоковна

кандидат биологических наук darima_bar@mail.ru

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН Россия, 670043, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6

Аннотация. Были изучены экологические условия обитания микробных сообществ воды и донных осадков железистого источника Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье). Вода Дабан-Горхонского источника характеризуется как гидрокарбонатная, кальциево-магниево-натриевая с содержанием железа 2,16 мг/л, температурой 8 °С в летний период. В воде и донных осадках источника с помощью молекулярно-гене-тических методов было изучено таксономическое разнообразие микробных сообществ, в которых доминировали представители филумов Proteobacteria, Bacteroidota, Actinobacteriota. Результаты исследования таксономического разнообразия на уровне родов показали, что основу микробных сообществ воды и донных осадков холодного железистого источника Дабан-Горхон составляют прокариоты из низкотемпературных пресноводных местообитаний. Была установлена высокая представленность в исследуемых сообществах бактерий цикла железа, распространению которых способствует присутствие железа в воде.

Ключевые слова: холодные источники, железистый источник, микробные сообщества, таксономическое разнообразие, психрофилы, Дабан-Горхон, микробная экология, микроорганизмы.

Благодарности

Работа выполнена в рамках темы госзадания № 121030100229-1. Для цитирования

Банзаракцаева Т. Г., Бархутова Д. Д. Таксономическое разнообразие микробного сообщества холодного железистого источника Дабан Горхон (Витимское плоскогорье) // Природа Внутренней Азии. Nature of Inner Asia. 2023. № 3(25). С. 7-16. DOI: 10.18101/2542-0623-2023-3-7-16

Введение

Жизнь на Земле развивалась в холодных условиях. Самая большая часть глобальной биосферы представлена сообществами, растущими и выживающими при температуре ниже 5 °C [Siddiqui & Cavicchioli 2006; Margesin & Miteva, 2011]. Психрофильные микроорганизмы являются естественными обитателями холодной среды. Исследования в области микробной экологии холодной среды с помощью культурозависимых и независимых от культуры молекулярных методов получили широкое распространение и сформировали комплекс знаний о разнообразии и экологической роли микробных сообществ в холодных экосистемах. Постоянно холодные наземные источники широко распространены и разнообразны по гидрохимическому составу, рН и минерализации. Однако микробные сообщества данных экосистем в настоящее время еще малоизучены [Rudolph et al., 2001, Camacho et al., 2005, Perreault et al., 2007; Perreault et al., 2008, Chaud-hary et al., 2009, Li et al., 2012; Guómundsdóttir et al., 2019]. Исходя из задач микробной экологии, одной из которых является получение представления об особенностях распространения микроорганизмов в различных местах их обитания, необходимо расширять сведения и знания о разнообразии и функционировании микробных сообществ в постоянно холодных наземных источниках.

Целью данной работы было изучение таксономического разнообразия микробных сообществ воды и донных осадков в постоянно холодном железистом источнике Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье).

Материал и методика

Дабан-Горхонский холодный железистый источник (52°25'277"N 111°48'422"E) находится на левобережье реки Уды, в 22 км от села Сосново-Озерское (Еравнин-ский район, Бурятия). Источник имеет чашеобразную воронку диаметром 10-12 м. Вода здесь применяется в лечебных целях при различных заболеваниях.

Пробы воды и донных осадков были отобраны в стерильную стеклянную и пластиковую посуду. Температуру и значения рН в воде измеряли портативным прибором «РН-200» (HM Digital, Китай), минерализацию тест-кондуктометром TDS-4 (Сингапур). Концентрация анионов и катионов, перманганатная окисляемость и жесткость в воде были определены общепринятыми гидрохимическими методами [Унифицированные методы... 1973].

Для выделения ДНК воду фильтровали до забития фильтра через нитроцел-люлозные фильтры (диаметр пор 0,22 мкм). Тотальную ДНК с фильтров извлекали с помощью механической гомогенизации и ферментативного лизиса [Бель-кова, 2009]. Для выделения ДНК из проб донных осадков использовали набор реактивов MACHEREY-NAGEL Nucleo Spin Soil (MACHEREY-NAGEL, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Качественную оценку выделенной ДНК проверяли на приборе Nano Drop 8000 (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Quantus (Promega, США) с применением набора Quanti Fluords DNA (Promega, США).

Высокопроизводительное секвенирование. ДНК-библиотеки для секве-нирования были созданы с использованием праймеров к вариабельной области V3-V4 гена 16S рРНК S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-21

согласно протоколу Illumina (http://support.illumina.com/documents/documentation/ chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf [Klindworth et al., 2013]. Секвенирование проводили в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН на секвенаторе Mi Seq (Illumina, США) с использованием Reagent Kit V3 PE600 (Illumina, США).

Качество прочтений оценивали с помощью программы Fast QC v0.11.5. Объединение парноконцевых ридов в контиги (объединенные риды) проводили с использованием программы PEAR [Zhang, 2014]. Для фильтрации объединенных ридов по качеству и длине использовали команду fastq_filtr в программе USEARCH v9.0.1623_win32 [Edgar, 2010]. Последовательности были сгруппированы в OTU (operational taxonomic unit) путем последовательной дерепликации и кластеризации на уровне 97 %, с использованием алгоритма UPARSE [Edgar, 2013]. В процессе кластеризации тестировали и удаляли химерные последовательности. Количественная представленность полученных OTU в образцах оценивалась через глобальное выравнивание последовательностей OTU на первоначальные объединенные риды. Из полученных данных исключали последовательности, встречающиеся однократно (синглтоны) или дважды (даблтоны).

Для оценки характеристик разнообразия микробных сообществ были рассчитаны индексы разнообразия с использованием программы Past 3.14 с предварительной нормализацией переменных [Hammer et al., 2001].

Результаты и обсуждение

Вода Дабан-Горхонского источника характеризуется как гидрокарбонатная, кальциево-магниево-натриевая с содержанием железа 2,16 мг/л, с температурой 8 °С в летний период (табл. 1). Вода щелочная (рН 8,99); минерализация составляла 700,3 мг/л, средняя жесткость — 7,40 °Ж. Перманганатная окисляемость была 5,70 мг О/л.

C использованием высокопроизводительного гена 16S рРНК профилирования установлено таксономическое разнообразие микробного сообщества воды и донных осадков холодного источника Дабан-Горхон (Витимское плоскогорье). В исследуемых сообществах воды DG_water и донных осадков значительная доля принадлежала бактериям филумов Proteobacteria (46 % и 24 %), Bacteroidota (27 % и 10 %), Actinobacteriota (13,7 % и 17,7 %) соответственно (рис. 1).

Таблица 1

Физико-химическая характеристика воды Дабан-Горхонского источника

Показатель, единица измерения Значение показателя

Температура, °С 8,0

Водородный показатель (рН) 8,99

Общая минерализация, мг/л 700,3

Окисляемость перманганатная, мг О/л 5,7

Продолжение табл. 1

Показатель, единица измерения Значение показателя

Жесткость общая, °Ж 7,4

№+, мг/л 27,7

Са2+, мг/л 100,2

Mg2+, мг/л 29,2

Fe3+, мг/л 2,2

НСО3-, мг/л 457,6

СО32-, мг/л 12,0

N0'", мг/л <0,02

N03", мг/л 0,26

S042-, мг/л 25,3

С1", мг/л 10,3

F2, мг/л <0,1

Кремниевая кислота, мг/л 56,8

СО2 связанная, мг/л 165,0

Рис. 1. Состав микробного сообщества на уровне филумов в воде (DG_water) и донных осадках ИЖсефхолодного источника Дсбан-Горхон

Для оценки характеристик разнообразия микробных сообществ воды и донныхосхдоев исдочнока Дабан-Г__хон были рхсечитахыоедексыразнох^азия

Шеннона, Simpson_1-Dи №ао1 (табл. 2). Оценка индексов разнообразия выявила большее разнообразие в микробном сообществе донных осадков.

Таблица 2

OTU и индексы а-разнообразия микробных сообществ холодного источника Дабан-Горхон

Индекс DG_water DG_sed

OTUs 16157 13533

Simpson_1-D 0,9802 4,9879

ShannonH 4,931 5,471

CBao-0 416 Г4С

В результате arnnroa микробногосообществаводы исследуемого источника на уровне семейств/родов установлено преобладание представителей рода Flavobacterium (20 %) семейства Flavobacteriaceae (рис. 2). В сообществе донных осадгов дoляпobкcиaвитeлeйос/avьnбсьоб7zо^у лыла нине (л,9 %-,но таюус влодила счбсле дбминондов (рид.З). Flavobacterium шнрссо распрьотранены в бгзгичдых средах умеренных и полярных регионов и являются одним из наиболее представленных родов в арктических и антарктических морских льдах [Liu et al., 2019].

■ u nclassified_l ntraspora ngiaceae

■ unclassified_Microbacteriaceae

■ unclassified_Micrococcaceae

■ Nocardioidaceae;Nocardioides

■ Chitinophagaceae;Ferruginibacter Flavobactenaceae;Flavobactenum

■ Weeksellaceae;Chryseobacterium

■ Sphingobacteriaceae;Pedobacter

■ unclassified_Bacteroidia

■ Arcobacteraceae;Pseudarcobacter

■ Caulobacteraceae;Brevundimonas

■ Devosiaceae;Devosia

■ unclassified_Rhodobacteraceae

■ Sphmgomonadaceae;Sphmgomonas Sphingomonadaceae;Sphingorhabdus Comamonadaceae;Polaromonas

■ unclassified_Comamonadaceae unclassified_Methylophilaceae Oxalobacteraceae;Massilia unclassified_Burkholderiales Methylomonadaceae;Methylobacter unclassified_Methylomonadaceae Xanthomonadaceae;Arenimonas

Рис. 2. Таксономическое разнообразие микробного сообщества го уровнт семейснеу/род втоосхрлодного ооточниса ДсРан-Годтон

DG water

■ unclassified Jntrasporangiaceae

■ unclassified_Microbacteriaceae unclassified_Micrococcaceae

■ Chitinophagaceae;Ferruginibacter Flavobacteriaceae;Flavobactenum

■ unclassified_Bacteroidia Geobacteraceae;Geobacter

■ unclassified_Geobacteraceae Nitrospiraceae; N itrospi га Comamonadaceae;Paucibacter Comamonadaceae;Polaromonas unclassified_Comamonadaceae unclassified_Burkholderis les Methylomonadaceae;Methylobacter unclassified_Methylomonadaceae Unclassified

Other

Рис. 3. Таксономическое разнообразие микробного сообщества на уровне семейство/род в донных осадкаххолодного источнига Дабан-Горхон

В исследуемых сообществах были выявлены последовательности, установлены ых как предытавстел/[ глмкжртва Comamonadaceae (^Ш %(. вНадди Comamonadaceao было[оа^р^с^д^(5а№ы предаырвиоелидода Polar-monas. Хадск-терно, чтовиды Pиlрrиmиnрs чащ всего связаны схоиодндши и/или бедными питательными веществами местообитаниями, включая ледниковые талые воды и отложения [Gawor et al., 2016]. В исследуемых сообществах также были обна-Пажены меташт/аифы аРНДыВЬеthylnOacter (3 % — DGCwateг, (_ % — DG_sed), баижайшие гомологи которых были выденвхыа оаноаном изаодно-болотных экосистем, характеризующихся низкими температурами и олиготрофностью [Chowdhury et al., 2013].

х оодбществахсоды и доаихсс осадахо иввочникпДабгхеГЬртон быкс аавш-тана аначительнно холя вд савдочааторвь сто), не клахвифицирюганныхна рсвных таксономических уровнях. Высокий процент (1-8 %) был представлен актино-бактериями семейств iHtmsp^aHgiaaeae, М1атаиаадаиди, Miambaateriaaeae. Также высокий процент в сообществах был отнесен к неклассифицированным — BurkhиlOиriдlиs (4 % в обоих сообществах). Однако в результате нашего анализа по базе данных NCBI и Ez Bio Cloud сиквенс, назначенный как «Одоодрт^и-Ьда^пд; unclassified_BurkHolderiales», был отнесен к Bиtдprиtииbдаtиriд; семейство ОдШиниИдаиди. Известно, что семейство ОдШиниИдаиди включает аэробные железоокисляющие бактерии, распространенные в местах выхода в ксилород-ную атмосферу анаэробных грунтовых вод, содержащих двухвалентное железо.

DG sed

8%

В микробном сообществе донных осадков была выявлена значительная доля бактерий рода Geobacter (7,8 %). Бактерии рода Geobacter способны восстанавливать трехвалентное железо [Nevin et al., 2005]. Для сообщества воды характерной особенностью была высокая представленность бактерий рода Brevundimonas семейства Caulobacteraceae (>3 %). Brevundimonas встречается в различных средах обитания, таких как почвы, глубокие подводные отложения, активный ил, черный песок, водные среды. Отмечено, что Brevundimonas активно развиваются и функционируют в олиго-трофных условиях [Epova et al., 2022]

Проведенные исследования выявили в микробных сообществах воды и донных осадков источника Дабан-Горхон высокий процент неклассифицированных последовательностей (8-29 % unclassified), которые не имеют никакого сходства с известными последовательностями прокариот, доступными в базах данных.

Заключение

Источник Дабан-Горхон является постоянно холодным источником. Вода источника характеризуется как гидрокарбонатная, кальциево-магниево-натриевая с содержанием железа 2,18 мг/л.

Проведенные молекулярные исследования таксономического разнообразия микробных сообществ воды и донных осадков источника Дабан-Горхон выявили преобладание протеобактерий. Было установлено, что исследуемые микробные сообщества имеют как сходства, так и различия на уровне семейств.

Результаты исследования таксономического разнообразия микробного сообщества воды и донных осадков холодного источника Дабан-Горхон показали, что основу данных сообществ составляют бактерии, чьи ближайшие гомологи были обнаружены в низкотемпературных пресноводных экосистемах. Широкое распространение в исследуемых сообществах бактерий цикла железа вероятно связано с присутствием железа в воде. Большая доля неклассифицированных последовательностей в исследуемых сообществах предполагает высокий потенциал для выделения новых бактериальных таксонов.

Литература

1. Белькова Н. Л. Модифицированная методика выделения суммарной ДНК из водных проб и грунтовых вытяжек методом ферментативного лизиса. Молекулярно-генетические методы анализа микробных сообществ. Разнообразие микробных сообществ внутренних водоемов России : учебно-методическое пособие. Ярославль : Принтхаус, 2009. С. 53-83. Текст : непосредственный.

2. Унифицированные методы анализа вод I под редакцией Ю. Ю. Лурье. Изд. 2. Москва : Химия, 1973. 378 с. Текст : непосредственный.

3. Camacho A., Rochera C., Silvestre J. José, Vicente E., Hahn M. W. Spatial Dominance and Inorganic Carbon Assimilation by Conspicuous Autotrophic Biofilms in a Physical and Chemical Gradient of a Cold Sulfurous Spring: The Role of Differential Ecological Strategies. Microbial Ecology. 2005; 50: 172-184. doi:10.1007Is00248-004-0158-x

4. Chaudhary A., Haack Sh. K., Duris J. W., MarshT. L. Bacterial and Archaeal Phylogenetic Diversity of a Cold Sulfur-Rich Spring on the Shoreline of Lake Erie, Michigan. Applied and Environmental Microbiology. 2009; 75(15): 5025-5038. doi:10.1128IAEM.00112-09

5. Chowdhury T. R., Dick R. P. Ecology of Aerobic Methanotrophs in Controlling Methane Fluxes from Wetlands. Applied Soil Ecology. 2013; 65: 8-22. https://doi.org/10.1016/j. apsoil.2012.12.014

6. Edgar R. C. Search and Clustering Orders of Magnitude Faster than BLAST. Bioinformatics. 2010; 26: 2460-2461.

7. Edgar R. C. UPARSE: Highly Accurate OTU Sequences from Microbial Amplicon Reads. Nature Methods. 2013; 10: 996-998.

8. Epova E. Y., Shevelev A. B., Akbayev R. M. et al. Heterotrophic Microbiota from the Oligotrophic Waters of Lake Vostok, Antarctica. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(7): 4025. doi:10.3390/ijerph19074025

9. Gawor, J., Grzesiak, J., Sasin-Kurowska, J. et al. Evidence of Adaptation, Niche Separation and Microevolution within the Genus Polaromonas on Arctic and Antarctic Glacial Surfaces. Extremophiles. 2016; 20: 403-413. https://doi.org/10.1007/s00792-016-0831-0

10. Guömundsdottir R., Kreiling A. K., Kristjansson B. K., Marteinsson V. &., Palsson S. Bacterial Diversity in Icelandic Cold Spring Sources and in Relation to the Groundwater Amphipod Crangonyxislandicus. PLoS One. 2019; 14(10): e0222527. doi:10.1371/journal. pone.0222527

11. Hammer 0., Harper D. A. T., Ryan P. D. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica. 2001; 4(1): 1-9. http:// palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01.htm

12. Klindworth A., Pruesse E., Schweer T., Peplies J., Quast C., Horn M., Glöckner F. O. Evaluation of General 16S Ribosomal RNA gene PCR Primers for Classical and Next-Generation Sequencing-Based Diversity Studies. Nucleic Acids Res. 2013; 41(1): e1. doi 10.1093/nar/gks808

13. Li G., Jiang H., Hou W., Wang S., Huang L., Ren H., Deng S., Dong H. Microbial Diversity in Two Cold Springs on the Qinghai-Tibetan Plateau. Geosci. Front. 2012; 3: 317-325. doi:10.1016/j.gsf.2011.12.004.

14. Liu Q., Liu H. C., Zhou Y. G., Xin Y. H. Microevolution and Adaptive Strategy of Psychrophilic Species Flavobacterium bomense sp. nov. Isolated From Glaciers. Frontiers in Microbiology. 2019; 10: 1069. doi: 10.3389/fmicb.2019.01069. PMID: 31178833; PMCID: PMC6538692.

15. Margesin R., Miteva V. Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms. Research in Microbiology. 2011; 162(3): 346-361. https://doi.org/10.1016Zj.resmic.2010.12.004

16. Nevin K. P., Holmes D. E., Woodard T. L., Hinlein E. S., Ostendorf D. W., Lovley D. R. Geobacter bemidjiensis sp. nov. and Geobacter psychrophilus sp. nov., Two Novel Fe(Iii)-Reducing Subsurface Isolates. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2005; 55(Pt 4): 1667-1674. doi: 10.1099/ijs.0.63417-0. PMID: 16014499.

17. Perreault N. N., Andersen D. T., Pollard W. H., Greer C. W., Whyte L. G. Characterization of the Prokaryotic Diversity in Cold Saline Perennial Springs of the Canadian High Arctic. Applied and Environmental Microbiology. 2007;. 73(5). P. 1532-1543. doi.org/10.1128/AEM.01729-06

18. Perreault N. N., Greer C. W., Andersen D. T., Tille S., Lacrampe-Couloume G., Lollar B. Sh., Whyte, L. G. Heterotrophic and Autotrophic Microbial Populations in Cold Perennial Springs of the High Arctic. Applied and Environmental Microbiology. 2008; 74: 68986907. doi:10.1128/AEM.00359-08

19. Rudolph C., Wanner G., Huber R. Natural Communities of Novel Archaea and Bacteria Growing in Cold Sulfurous Springs with a String-of-Pearls-Like Morphology. Applied and Environmental Microbiology. 2001; 67(5): 2336-2344. doi:10.1128/aem.67.5.2336-2344.2001.

20. Siddiqui K. S., Cavicchioli R. Cold-Adapted Enzymes. Annual review of biochemistry. 2008; 75: 403-433. https://doi.org/10.1148/annurev.biochem.75.103004.142723

21. Teixeira L. M., Merquior V L. C. The Family Moraxellaceae. In: Rosenberg E., DeLong E. F., Lory S., Stackebrandt E., Thompson F. (eds). The Prokaryotes. Springer, Berlin, Heidelberg, 2014. https://doi.org/10.1007/978-3-842-38922-1_245

22. Willems A. The Family Comamonadaceae. The Prokaryotes: Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria, 2013, pp. 777-851. 10.1007/978-3-642-30197-1_238.

23. Zhang J., Kobert K., Flouri T., Stamatakis A. PEAR: a Fast and Accurate Illumina Paired-End reAd Merger. Bioinformatics. 2014; 30: 814-820.

Статья поступила в редакцию 27.08.2023; одобрена после рецензирования 05.09.2023; принята к публикации 13.09.2023.

TAXONOMIC DIVERSITY OF THE MICROBIAL COMMUNITY OF THE DABAN-GORKHON COLD CHALYBEATE SPRING (VITIM PLATEAU)

T. G. Banzaraktsayeva, D. D. Barkhutova

Tuyana G. Banzaraktsayeva Cand. Sci. (Biol.) tuyana_banz@mail.ru

Darima D. Barkhutova Cand. Sci. (Biol.) darima_bar@mail.ru

Institute for General and Experimental Biology SB RAS 8 Sakhyanovoy St., Ulan-Ude 870043, Russia

Abstract. The article investigates the ecological conditions of the habitat of microbial communities of water and bottom sediments of the Daban-Gorkhon chalybeate spring (Vitim Plateau). The water of the Daban-Gorkhon spring is characterized as hydrocarbonate calcium-magnesium-sodium with an iron content of 2.18 mg/l, its temperature in summer is 8 °C. We have studied the taxonomic diversity of microbial communities in the water and bottom sediments of the source using molecular genetic methods. Representatives of the phyla Proteobacteria, Bacteroidota, Actinobacteriota dominated in the communities of interest. The results of a study of taxonomic diversity at the genus level showed that prokaryotes from low-temperature freshwater habitats form the basis of the microbial communities of water and bottom sediments of the cold chalybeate spring Daban-Gorkhon. We have established wide spread of iron cycle bacteria in the studied communities, which is facilitated by the presence of iron in water.

Keywords: cold springs, chalybeate spring, microbial communities, taxonomic diversity, psychrophiles, Daban-Gorkhon, microbial ecology, microorganisms.

Acknowledgments. The work was carried out within the framework of the topic of state assignment No. 121030100229-1

For citation

Banzaraktsayeva T. G., Barkhutova D. D. Taxonomic Diversity of the Microbial Community of the Daban-Gorkhon Cold Chalybeate Spring (Vitim Plateau). Nature of Inner Asia. 2023; 3(25): 7-16 (In Russ.). DOI: 10.18101/2542-0623-2023-3-7-16

The article was submitted 27.08.2023; approved after reviewing 05.09.2023; accepted for publication 13.09.2023.