CC BY
4
ФИЗИОЛОГИЯ. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ. ДИАГНОСТИКА ■
Таксономический состав микробиоты
V V > V
толстой кишки при острой обтурационной кишечной непроходимости
Самарцев В.А.1, Пушкарев Б.С.1, Гаврилов В.А.1, Кузнецова М.П.1, Кузнецова М.В.1, 2
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 614990, г. Пермь, Российская Федерация
2 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук», 614081, г. Пермь, Российская Федерация
Резюме
Актуальность. Острая обтурационная кишечная непроходимость (ООКН) является серьезной проблемой современной неотложной хирургии. Количество, видовое разнообразие и метаболическая активность микробиоты кишечника могут различаться при ООКН различной этиологии, локализации и давности заболевания. Однако влияние этих параметров на состав микробиоты кишечника в значительной степени не доказано. Применение эффективных методов детерминации микроорганизмов является крайне актуальной задачей в современной практической медицине. Большой интерес представляет метод газовой хроматографии - масс-спектро-метрии (ГХ-МС), эффективный для детекции как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов. Данный подход отличают удобство, точность и скорость идентификации возбудителей, однако исследований, связанных с оценкой микробного состава при ООКН методом ГХ-МС, найдено не было.
Цель - изучить микробный спектр содержимого толстой кишки у пациентов с ООКН различного генеза с использованием метода ГХ-МС.
Материал и методы. Проведено проспективное исследование микробиоты толстой кишки пациентов (n=50) с ООКН неопухолевого и опухолевого генеза в сравнении с условно здоровыми людьми (n=10) без признаков острой хирургической патологии органов брюшной полости. У всех пациентов изучен количественный и качественный состав микробиоценоза толстой кишки методом ГХ-МС.
Результаты. Показано, что общая численность микроорганизмов статистически значимо снижена в группах пациентов с ООКН по сравнению со здоровыми людьми. Кроме того, у пациентов с ООКН в микробиоте кишечника снижено количество представителей родов Nocardia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Butyrivibrio, Lactobacillus и Bacteroi-des. Между группами пациентов с ООКН неопухолевого и опухолевого генеза, а также группами, различающимися по времени обращения за медицинской помощью (период до 72 vs после 72 ч), статистически значимых различий в микробном спектре выявлено не было. Заключение. Выявленные в ходе исследования особенности расширяют представления о составе бактериальной флоры у пациентов с ООКН различного генеза. Перспективным направлением в лечении и реабилитации больных с ООКН является назначение пробиотиков с целью нормализации таксономического состава микробиоты.
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Кузнецова Марина Павловна -кандидат медицинских наук, ассистент кафедры общей хирургии ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России (Пермь, Российская Федерация) E-mail: marinapk92@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-8403-4926
Ключевые слова:
острая обтурационная кишечная непроходимость; взрослые; микробиота; газовая хроматография -масс-спектрометрия
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Самарцев В.А., Пушкарев Б.С., Гаврилов В.А., Кузнецова М.П., Кузнецова М.В. Таксономический состав микробиоты толстой кишки при острой обтурационной кишечной непроходимости // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2024. Т. 12, № 2. С. 47-56. DOI: Ийрз://^. огд/10.33029/2308-1198-2024-12-2-47-56
Статья поступила в редакцию 13.02.2024. Принята в печать 07.05.2024.
Taxonomic composition of the colon microbiota in acute obstructive intestinal obstruction
OORRESPONDENCE
Marina P. Kuznetsova -MD, Assistant at the Department of General Surgery, Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner, Ministry of Health of the Russian Federation (Perm, Russian Federation) E-mail: marinapk92@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-8403-4926
Keywords:
acute obstructive intestinal obstruction; adults; microbiota; gas chromatography-mass spectrometry
Samartcev V.A.1, Pushkarev B.S.1, Gavrilov V.A.1, Kuznetsova M.P.1, Kuznetsova M.V.1' 2
1 Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner, Ministry of Health of the Russian Federation, 614990, Perm, Russian Federation
2 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences - Branch of the Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Russian Federation
Abstract
Background. Acute obstructive intestinal obstruction is a serious health problem in modern emergency surgery. The quantity, species diversity, and metabolic activity of the intestinal microbiota may differ in acute obstructive intestinal obstruction of different etiologies, localization, and duration of the disease. However, the effect of these parameters on the composition of the gut microbiota is largely unproven. The use of effective methods for the determination of microorganisms is an extremely urgent task in modern practical medicine. Of great interest is the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method, which is effective for the detection of both aerobic and anaerobic microorganisms. This approach is distinguished by convenience, accuracy and speed of identification of pathogens, however, no studies related to the assessment of microbial composition in acute obstructive intestinal obstruction using the GC-MS method were found.
Aim is to study the microbial spectrum of the contents of the large intestine in patients with acute obstructive intestinal obstruction of various origins using the method of gas chromatography-mass spectrometry.
Material and methods. A prospective study of the colon microbiota of patients (n=50) with acute obstructive intestinal obstruction of non-tumor and tumor genesis was carried out in comparison with apparently healthy people (n=10) without signs of acute surgical pathology of the abdominal organs. In all patients, the quantitative and qualitative composition of the microbiocenosis of the large intestine was studied by gas chromatography-mass spectrometry of intestinal microbial markers.
Results. It has been shown that the total number of microorganisms is statistically significantly reduced in groups of patients with acute obstructive intestinal obstruction in comparison with healthy people. In addition, the number of representatives of the genera Nocardia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Butyrivibrio, Lactobacillus and Bacteroides is reduced in the intestinal microbiota in patients with acute obstructive intestinal obstruction. There were no statistically significant differences in the microbial spectrum between the groups of patients with non-tumor and neoplastic acute obstructive intestinal obstruction, as well as groups differing in the time to seek medical help (up to 72 hours vs after 72 hours). Conclusion. The features identified during the study expand understanding of the composition of the bacterial flora in patients with acute obstructive intestinal obstruction of various origins. A promising direction in the treatment and rehabilitation of patients with acute obstructive intestinal obstruction is the administration of probiotics in order to normalize the taxonomic composition of the microbiota.
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For citation: Samartcev V.A., Pushkarev B.S., Gavrilov V.A., Kuznetsova M.P., Kuznetsova M.V. Taxonomic composition of the colon microbiota in acute obstructive intestinal obstruction. Clinical and Experimental Surgery. Petrovsky Journal. 2024; 12 (2): 47-56. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2024-12-2-47-56 (in Russian) Received 13.02.2024. Accepted 07.05.2024.
Острая обтурационная кишечная непроходимость (ООКН) представляет наиболее распространенный тип острой кишечной непроходимости и является серьезной проблемой современной неотложной хирургии [1, 2]. Только в США на ООКН приходится более 300 000 госпитализаций в год, в России этот показатель в среднем составляет порядка 70 000 в год [3]. ООКН может быть вызвана множеством факторов и иметь внекишеч-ное или внутрикишечное происхождение. Спаечный процесс и грыжи передней брюшной стенки являются наиболее частыми причинами тонкокишечной непроходимости, тогда как онкологические заболевания и дивертикулит обусловливают непроходимость толстой кишки [2].
В желудочно-кишечном тракте человека содержится более 100 трлн микробных клеток, которые влияют на пищеварение и, как следствие, на питание и обмен веществ, лежащих в основе всех физиологических функций организма, а также играют важную роль в поддержании «оптимального» иммунного ответа [4-6]. Долгое время считалось, что ООКН, характеризующаяся острой задержкой кишечного содержимого, способствует бактериальной пролиферации и транслокации [1, 7-9]. Размножение бактерий обусловливает развитие местных воспалительных реакций у пациентов с ООКН [8, 10], тогда как бактериальная транслокация является основным патогенетическим фактором системного иммунного ответа. По-видимому, количество, видовое разнообразие и метаболическая активность микробиоты кишечника могут различаться при ООКН различной этиологии, локализации и давности заболевания [11-16]. Однако влияние этих параметров на состав микробиоты кишечника в значительной степени не доказано.
В связи с вышеизложенным применение эффективных методов детерминации микроорганизмов является крайне актуальной задачей в современной практической медицине. В зарубежной литературе имеются данные об изучении микробиоты кишечника при ООКН бактериологическим методом,
а также методом метагеномного секвенирования [17-19]. Большой интерес представляет метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС), основанный на выделении и анализе компонентов клеточной стенки (спиртов, альдегидов, жирных кислот и т.д.), эффективный для детекции как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов [20]. Данный подход отличают удобство, точность и скорость идентификации возбудителей, однако исследований, связанных с оценкой микробного состава при ООКН методом ГХ-МС, найдено не было.
Материал и методы
Было проведено проспективное исследование микробиоты толстой кишки у пациентов (п=50) с ООКН неопухолевого и опухолевого генеза, оперированных на базе хирургического отделения ГАУЗ ПК ГКБ № 4 в период 2019-2021 гг. Группа имела следующие гендерные характеристики: мужчин - 25 (50%), женщин - 25 (50%). Медиана, квартили (Ме; 01-03) возраста составили: 71 (62,2580,50) год.
Пациенты были разделены на группы согласно следующим критериям: по времени обращения за медицинской помощью - до 72 ч (п=22), после 72 ч (п=28); по причине возникновения непроходимости - ООКН неопухолевого генеза (п=25), ООКН опухолевого генеза (п=25). В качестве группы сравнения случайным образом были выбраны 10 условно здоровых людей без признаков острой хирургической патологии органов брюшной полости.
Перечень нозологических форм заболеваний, являющихся причиной развития ООКН, представлен в табл. 1. У пациентов с ООКН неопухолевого генеза во всех случаях была диагностирована спаечная болезнь брюшной полости (СББП), а злокачественные новообразования (ЗНО) толстой кишки составляли основную причину возникновения ООКН опухолевого генеза.
Среди оперативных вмешательств, направленных на устранение ООКН, выполнялись следую-
Таблица 1. Перечень нозологических форм заболеваний, являющихся причиной развития острой обтурационной кишечной непроходимости различного генеза(п=50)
Нозологическая форма заболевания Число случаев, п (%)
СББП 25 (50,0)
ЗНО сигмовидной кишки 10 (20,0)
ЗНО прямой кишки 6 (12,0)
ЗНО восходящего отдела ободочной кишки 3 (6,0)
ЗНО ректосигмоидного отдела 2 (4,0)
ЗНО нисходящего отдела ободочной кишки 2 (4,0)
ЗНО поперечно-ободочной кишки 1 (2,0)
ЗНО слепой кишки 1 (2,0)
ЗНО подвздошной кишки 1 (2,0)
Примечание. СББП - спаечная болезнь брюшной полости; ЗНО - злокачественные новообразования.
Таблица 2. Распределение пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью по времени обращения за медицинской помощью (п=50)
Признак Время обращения Р
до 72 ч после 72 ч
Возраст, годы, Me (Q1-Q3) 68,5 (53,8-78,3) 71,5 (64,0-82,3) 0,61*
Пол, n (%) М 10 (45,5) 15 (53,6) 0,56**
Ж 12 (54,5) 13 (46,4)
Локализация источника, n (%) Тонкая кишка 18 (81,8) 7 (25,0) 0,001**
Толстая кишка 4 (18,2) 21 (75,0) 0,001**
Летальность, n (%) 2 (9,1) 3 (10,7) 0,84**
Примечание. Здесь и в табл. 3: * - критерий Манна-Уитни; ** - хи-квадрат Пирсона или точный критерий Фишера.
щие: висцеролиз - 22 (44,0%) случая, обструктив-ная резекция сигмовидной кишки - 14 (28,0%), передняя резекция прямой кишки - 3 (6,0%), левосторонняя гемиколэктомия - 3 (6,0%), двуствольная сигмостомия - 2 (4,0%), илеостомия -2 (4,0%), илеотрансверзоанастомоз - 2 (4,0%), правосторонняя гемиколэктомия - 1 (2,0%), трансвер-зостомия - 1 (2,0%).
Забор микробиоты производился при помощи оригинальной методики (рационализаторское предложение № 2819 от 18.12.2020). Материал собирали мужским уретральным катетером Нела-тона с концом по Тиманну, введенным в ампулу прямой кишки, путем ее орошения раствором 0,89% NaCL с последующим сбором промывных вод и их микробиологическим анализом методом ГХ-МС.
Реконструирование таксономического состава до рода/вида проводили после химического извлечения высших жирных кислот, альдегидов, сте-ринов и хроматографического разделения пробы методом ГХ-МС, согласно Г.А. Осипову, с использованием системы Agilent 6890/5973N (Agilent, США). Липидные компоненты экстрагировали методом кислого метанолиза в 0,4 мл 1 М NaCL в метаноле в течение 1 ч при температуре 80 °С. Сухой остаток обрабатывали 20 мкл KO-бис (триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин, затем 1-2 мкл полученной смеси разбавляли гексаном 1:1 и использовали для анализа. Хроматограммы снимали в режиме программирования температуры от 130 до 320 °С со скоростью 5 °С в минуту. Для количественных измерений в качестве внутреннего стандарта использовали тридейтеро-тридека-ноат. Результаты анализировали с помощью штатной программы обработки данных и формировали рапорт о реконструированном по биохимическим маркерам составе микробного сообщества.
Для статистической обработки использовалась программа Jamovi версии 2.3.21 на базе языка программирования R. Количественные данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Шапиро-Уилка. Учитывая распределение данных, отличное от нормального (p<0,05), описание количественных данных было проведено
при помощи медианы, 1-го и 3-го квартилей; сравнение количественных данных в трех независимых выборках было проведено при помощи критерия Краскела-Уоллиса, а апостериорный анализ - путем использования парного теста Дуасса-Стилла-Кри-члоу-Флигнера. Описание качественных (номинальных и ранговых) переменных проводилось с указанием абсолютных значений и процентных долей, сравнение - путем построения таблиц сопряженности. В случае когда минимальное ожидаемое явление в любой из ячеек четырехпольной или многопольной таблицы было менее 10, для сравнения данных использовался точный критерий Фишера. При минимальном ожидаемом явлении во всех ячейках таблиц сопряженности более 10 для сравнения данных использовался хи-квадрат Пирсона. Результат считали статистически достоверным при р<0,05. Для сравнения бактериальных сообществ рассчитывали показатели а-разнообразия: вычисляли индексы разнообразия Шеннона и Симпсона [33].
Результаты
Общеклинические данные пациентов
Группы пациентов, обратившихся за медицинской помощью до 72 ч (п=22) и после 72 ч (п=28), были сопоставимы по полу и возрасту (табл. 2). При этом отмечено, что у пациентов, обратившихся до 72 ч, достоверно чаще причина ООКН локализовалась в тонкой кишке (18 против 7 случаев, р=0,001). Напротив, у пациентов, обратившихся в стационар позже этого срока, источник ООКН в большинстве случаев был выявлен в толстой кишке (21 против 4, р=0,001). Следует отметить, что летальность в группе пациентов с обращением за медицинской помощью до 72 ч составила 9,09%, в группе пациентов с обращением позднее 72 ч - 10,71%, что не имело достоверного различия.
При распределении пациентов по причине возникновения ООКН не выявлено статистически значимых различий по полу, возрасту, времени от поступления в хирургический стационар до оперативного вмешательства и исхода (табл. 3).
Количественный и качественный состав микробиоценоза толстого кишечника пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью
Проведена сравнительная оценка количественного и качественного состава микробиоты толстой кишки у здоровых людей (п=10) и пациентов с ООКН различного генеза (п=50). Численность микроорганизмов у пациентов без ООКН в образцах кишечного содержимого составила от 1,26Е+10 до 1,91Е+10 клеток/г на 1 мл, Ме (01-03) составили 1,37Е+10 (1,32Е+10-1,45Е+10) клеток/г на 1 мл. У пациентов с ООКН опухолевого генеза общее количество микроорганизмов варьировало от 7,13Е+ 08 до 1,03 Е+10 клеток/г на 1 мл, Ме (01-03) составили 3,12 Е+09 (1,94Е+09-6,76 Е+09) клеток/г на 1 мл, неопухолевого генеза - от 8,02Е+08 до 9,70Е+09, Ме (01-03) составили 4,32Е+09 (1,74Е+ 09-8,22Е+09) клеток/г на 1 мл. При сравнении общей численности микроорганизмов отмечено статистически значимое снижение в группе пациентов с ООКН как опухолевого (р<0,0001), так и неопухолевого генеза (р<0,0001) по сравнению со здоровыми людьми (рис. 1). При этом общее число микроорганизмов у пациентов с ООКН различного генеза достоверно не отличалось ^=0,79).
При анализе микробного состава кишечного содержимого получены следующие данные. У здоровых людей и пациентов с ООКН различного генеза были детектированы представители четырех крупных филумов - Actinobacteria, Firmicutes, Pюteobacteria и Bacteroidetes. Отмечены достоверные изменения количества микроорганизмов на уровне крупных филумов у пациентов с ООКН опухолевого и неопухолевого генеза по сравнению со здоровыми людьми. Для актинобактерий Me (01-03) численности микроорганизмов у здоровых людей составила 9,28Е+09 (8,94Е+09-9,50Е+09) клеток/г на 1 мл, при ООКН опухолевого генеза - 2,55Е+09 (1,45Е+09-5,92Е+09) ^=0,0001), при ООКН неопухолевого генеза - 3,85Е+09 (1,38Е+09-7,67Е+09) ^<0,0001). Для фирмикутов Me (01-03) численности микроорганизмов у здоровых людей составила 4,42Е+09 (3,78Е+09-4,88Е+09) клеток/г на 1 мл, при ООКН опухолевого генеза - 3,69Е+08 (3,41Е+08-
Количество клеток, х105
150 000 -100 000 -50 000 -0-
Здоровые ООКН ООКН
опухолевая неопухолевая
Группа пациентов
5,38E+08) (p<0,0001), при ООКН неопухолевого генеза - 4,21 E+08 (3,26E+08-5,00E+08) (p<0,0001) (рис. 2). Для протеобактерий и бактероидов статистически значимых различий численности микроорганизмов у здоровых людей и пациентов с ООКН различного генеза получено не было.
Среди представителей Actinobacteria достоверное снижение численности у пациентов с ООКН как опухолевого, так и неопухолевого генеза отмечено для Nocardia asteroides (p=0,004 и p=0,002 соответственно), Propionibacterium spp. (p<0,0001 и p=0,0001 соответственно), в частности Propioni-bacterium acnes (p=0,002 и p=0,0005 соответственно), Bifidobacterium spp. (p=0,0001 и p<0,0001 соответственно). Статистически значимое снижение численности Actinomycetes spp. происходило только у пациентов с ООКН опухолевого генеза (p=0,02). В группе фирмикутов достоверное снижение численности микроорганизмов происходило в обеих группах пациентов с ООКН опухолевого и неопухолевого генеза по сравнению со здоровыми людьми: Eubacterium lentum группы А (p=0,01 и p=0,006), Eubacterium moniliforme (p=0,0007 и p=0,0005), Peptostreptococcus anaerobius (p=0,01 и p=0,0004), Butyrivibrio spp. (p=0,002 и p=0,0005), Ruminicoccus spp. (p=0,03 и p=0,03), Lactobacillus spp. (p<0,0001 и p<0,0001).
Напротив, представительство Clostridium hystolyticum в микробиоме было выше при ООКН. Среди протеобактерий выявлено статистически
Рис. 1. Общая численность микроорганизмов в образцах кишечного содержимого у здоровых людей и пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью (ООКН) различного генеза
Fig. 1. The total number of microorganisms in samples of intestinal contents from healthy people and patients with acute obstructive intestinal obstruction of various origins
Таблица 3. Общеклинические данные пациентов, распределенных по причине возникновения острой обтурационной кишечной непроходимости (ООКН) (п=50)
Признак Причина возникновения ООКН p
ООКН неопухолевого генеза (n=25) ООКН опухолевого генеза (n=25)
Возраст, n (%) До 50 лет 4 (16,0) 2 (8,0) 0,39*
После 50 лет 21 (84,0) 23 (92,0)
Пол, n (%) М 12 (48,0) 13 (52,0) 1,00**
Ж 13 (52,0) 12 (48,0)
Летальность, n (%) 5 (20,0) 3 (12,0) 1,00**
Рис. 2. Суммарный таксономический состав микробиоты толстой кишки здоровых людей и пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью (ООКН) различного генеза
Fig. 2. Total taxonomic composition of the microbiota of the colon of healthy people and patients with acute obstructive intestinal obstruction of various origins
Количество клеток, x105
14 000
12 000
10 000
8000
6000
4000
2000
Здоровые ООКН ООКН
опухолевая неопухолевая
Fungi Микр грибы, ситостерол Fungi Микр грибы, кампестерол Bacteroides Bacteroides hypermegas Bacteroides Porphyromonas spp. Firmicutes Lactobacillus Firmicutes Ruminicoccus spp. Firmicutes Butyrivibrio Firmicutes Enterococcus spp. Firmicutes Clostridium perfringens Firmicutes Clostridium difficile Firmicutes Clostridium ramosum Firmicutes Clostridium propionicum Firmicutes Clostridium histolyticum Firmicutes Peptostreptococcus anaerobius Firmicutes Eubacterium lentum 7741 (группа В) Firmicutes Eubacterium spp. Firmicutes Eubacterium nodatum Firmicutes Eubacterium moniliforme sbsp Firmicutes Eubacterium lentum (группа А) Firmicutes Staphylococcus spp. Firmicutes Streptococcus mutans Firmicutes Streptococcus spp. Actinobacteria Bifidobacterium Actinobacteria Propionibacterium jensenii Actinobacteria Propionibacterium acnes Actinobacteria Propionibacterium spp. Actinobacteria Actinomadura Actinobacteria Corineform CDC-group XX Actinobacteria Rhodococcus Actinobacteria Actinomyces viscosus Actinobacteria Actinomycetes 10Me14 Actinobacteria Actinomycetes spp. Actinobacteria Pseudonocardia spp. Actinobacteria Nocardia asteroids Actinobacteria Nocardia, 14:1d11 Proteobacteria Pseudomonas aeruginosa Proteobacteria Moraxella spp. Proteobacteria Campylobacter mucosalis Proteobacteria Escherichia coli Proteobacteria Helicobacter pylori, h18
Группа пациентов
0
значимое снижение численности Helicobacter pylori (p=0,04) только у пациентов с ООКН неопухолевого генеза по сравнению со здоровыми пациентами. Для Bacteroidetes отмечено лишь статистически значимое уменьшение численности Bacteroides hypermegas у пациентов с ООКН опухолевого генеза (p=0,02) (см. рис. 2). Тем не менее при сравнении общей численности микроорганизмов между пациентами с ООКН различного генеза статистически значимых различий получено не было.
При сравнении численности микроорганизмов здоровых людей и пациентов с ООКН, обратившихся за медицинской помощью в различное время, получены следующие результаты. Количество микроорганизмов в толстой кишке у пациентов с ООКН, обратившихся за медицинской помощью в течение
72 ч, составило от 7,13Е+08 до 9,70Е+09, Me (01-03) составили 4,55Е+09 (1,55Е+09-8,16Е+09) клеток/г на 1 мл, после 72 ч - от 8,02Е+08 до 1,03Е+10, Me (01-03) составили 3,13Е+09 (2,00Е+09-6,92Е+09) клеток/г на 1 мл. При этом снижение численности микроорганизмов было статистически значимо как в период до 72 ч ^<0,0001), так и после 72 ч ^<0,0001) в сравнении со здоровыми людьми, однако между группами различий не выявлено (рис. 3). Статистически значимое уменьшение численности по сравнению со здоровыми людьми лишь в период после 72 ч от начала заболевания до обращения за медицинской помощью отмечено для Actinomycetes Брр. ^=0,01), Eubacterium noda-tum ^=0,02), Ruminicoccus Брр. ^=0,01), Bacteroides hypermegas ^=0,02) (рис. 4).
Для оценки разнообразия биологических сообществ применяют различные индексы - численные показатели, рассчитывающиеся на основе числа таксонов в сообществе и числа особей в разных таксонах. Альфа-разнообразие включает в себя 2 компонента: видовое богатство (количество таксонов) и выровненность (относительное обилие/ пропорциональная численность). Индекс Шеннона характеризует разнообразие и выровненность в структуре сообщества, а индекс Симпсона отражает уровень преобладания конкретных видов в структуре сообщества [21, 22]. Согласно значениям индекса Шеннона, наибольшее разнообразие отмечено в группе ООКН опухолевого генеза и составляет 1,796. В группе пациентов без ООКН данный индекс равен 1,653. Эти значения показывают, что выборки имеют умеренное разнообразие. Индекс
Количество
клеток, х105
25 000
Количество клеток, х105
20 000
15 000
10 000
5000
150 000100 000 -50 000-
Здоровые ООКН ООКН
опухолевая неопухолевая
Группа пациентов
Fungi Микр грибы, ситостерол Fungi Микр грибы, кампестерол Bacteroides Bacteroides hypermegas Bacteroides Porphyromonas spp. Firmicutes Lactobacillus Firmicutes Ruminicoccus spp. Firmicutes Butyrivibrio Firmicutes Enterococcus spp. Firmicutes Clostridium perfringens Firmicutes Clostridium difficile Firmicutes Clostridium ramosum Firmicutes Clostridium propionicum Firmicutes Clostridium histolyticum Firmicutes Peptostreptococcus anaerobius Firmicutes Eubacterium lentum 7741 (группа В) Firmicutes Eubacterium spp. Firmicutes Eubacterium nodatum Firmicutes Eubacterium moniliforme sbsp Firmicutes Eubacterium lentum (группа А) Firmicutes Staphylococcus spp. Firmicutes Streptococcus mutans Firmicutes Streptococcus spp. Actinobacteria Bifidobacterium Actinobacteria Propionibacterium jensenii Actinobacteria Propionibacterium acnes Actinobacteria Propionibacterium spp. Actinobacteria Actinomadura Actinobacteria Corineform CDC-group XX Actinobacteria Rhodococcus Actinobacteria Actinomyces viscosus Actinobacteria Actinomycetes 10Me14 Actinobacteria Actinomycetes spp. Actinobacteria Pseudonocardia spp. Actinobacteria Nocardia asteroids Actinobacteria Nocardia, 14:1d11 Proteobacteria Pseudomonas aeruginosa Proteobacteria Moraxella spp. Proteobacteria Campylobacter mucosalis Proteobacteria Escherichia coli Proteobacteria Helicobacter pylori, h18
Рис. 3. Общая численность микроорганизмов в образцах кишечного содержимого у здоровых людей и пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью (ООКН) различного времени обращения за медицинской помощью
Fig. 3. The total number of microorganisms in samples of intestinal contents from healthy people and patients with acute obstructive intestinal obstruction at different times of seeking medical help
Рис. 4. Суммарный таксономический состав микробиоты толстой кишки у пациентов с острой обтурационной кишечной непроходимостью (ООКН) в зависимости от времени обращения за медицинской помощью
Fig. 4. Total taxonomic composition of the colon microbiota in patients with acute obstructive intestinal obstruction depending on the time of seeking medical help
Здоровые ООКН до 72 ч ООКН после 72 ч Группа пациентов
0
0
Шеннона выборки группы с ООКН неопухолевого генеза составляет 1,299, что свидетельствует о низком микробном разнообразии кишечной микро-биоты. Интересно, что индекс Симпсона, характеризующий доминирующие таксоны в микробиоме кишечника, в этой выборке пациентов, напротив, самый высокий, он составил 0,72. Данный показатель также свидетельствует об умеренном разнообразии видов, однако он близок к 1, а значит, в выборке один или несколько видов доминируют над другими. Индекс Симпсона в выборках без ООКН и в группе с ООКН опухолевого генеза равен 0,49 и 0,6 соответственно, что также характерно для биосистем со средним уровнем биоразнообразия.
Обсуждение
Острая кишечная непроходимость является широко распространенным заболеванием желудочно-кишечного тракта, приводящим к задержке кишечного содержимого в проксимальном сегменте от места окклюзии. Известно, что количественные и качественные изменения микро-биоты кишечника носят компенсаторный характер и направлены на поддержание здоровья человека, однако в патологических случаях, в том числе при обструкции, специфические изменения могут указывать на декомпенсационный характер заболевания и иметь различные негативные последствия [23, 24]. Предполагается, что пролиферация некоторых групп бактерий способствует развитию местных реакций [8] и системного воспалительного ответа у пациентов с ООКН [10]. Однако какие количественные и качественные изменения происходят в составе микробиоты, способствующей патофизиологическим изменениям в кишечнике, в значительной степени не показано. Высокочувствительный и селективный метод ГХ-МС позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале, что делает его эффективным для определения как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов [20]. В настоящем исследовании мы изучили количественный и качественный состав микробиоты кишечного содержимого пациентов с ООКН с использованием метода ГХ-МС. Исследование проведено в сравнительном аспекте с группой пациентов с хирургической патологией без обструкции, а также с учетом времени обращения за медицинской помощью и генеза заболевания.
Долгое время считалось, что при ООКН присутствует феномен бактериальной пролиферации, т.е. избыточный рост микроорганизмов в кишке. По нашим данным, выявлена обратная тенденция -достоверное уменьшение общей численности микроорганизмов. Ранее С.Р. Баймаков и соавт. (2016) также обнаружили подобный эффект [18].
Авторы считают, что снижение количества микроорганизмов в месте обструкции связано с развитием кишечной недостаточности, сопровождающейся транслокацией бактерий из просвета кишечной трубки в брюшную полость. Характерной особенностью этого дисбиоза является достоверное снижение анаэробных микроорганизмов (например, количество лактобактерий уменьшалось на 5 порядков от контрольной группы) на фоне существенного возрастания факультативной флоры (количество эшерихий возрастало на 3 порядка от контрольной группы) [18]. В исследовании по моделированию кишечной непроходимости у крыс in vivo, в котором оценивали внутрипросветное содержимое средней части толстой кишки проксимальнее обструкции методом секвенирования 16s рРНК, избыточный рост микробиоты также не зафиксирован [17]. Однако выявлены существенные изменения в таксономическом составе фекальной микробиоты - значительное снижение удельного веса представителей филума Firmicutes с одновременным увеличением доли протеобактерий и бактероидов по сравнению с контрольной группой.
С этими результатами согласуются данные, полученные в нашем исследовании: отмечено уменьшение доли фирмикутов в общем спектре микробиоты толстой кишки, тогда как представители Proteobacteria и Bacteroides встречались в большем проценте случаев у пациентов с ООКН по сравнению с контрольной группой. В отношении Lactobacillus у пациентов с ООКН выявлено уменьшение как абсолютного числа микроорганизмов - количество бактерий снизилось на 3 порядка, так и доли в общем спектре кишечной микробиоты. При этом S. Hegde и соавт. опровергают ранее существовавший тезис о том, что богатство микробиоты (большее разнообразие) связано со здоровьем кишечника хозяина. Напротив, видовой состав микробиоты животных был более разнообразным при непроходимости толстой кишки, чем в контрольной группе. Аналогично в нашем исследовании наибольшее значение индекса Шеннона, характеризующего разнообразие в биотопе, отмечено в группе ООКН опухолевого генеза, а в целом видовой состав микроорганизмов в обеих опытных группах, согласно индексам, используемым для оценки богатства микробиоты, характеризовался умеренным разнообразием.
Заключение
С помощью метода ГХ-МС изучен количественный и качественный состав микробиоты кишечника при ООКН различного генеза. Исследование проведено в сравнительном аспекте с группой пациентов условно здоровых людей без признаков
острой хирургической патологии органов брюшной полости, а также с учетом времени обращения за медицинской помощью и генеза заболевания. При сравнении общей численности микроорганизмов отмечено статистически значимое снижение в обеих группах пациентов с ООКН как опухолевого, так и неопухолевого генеза по сравнению со здоровыми людьми. Во всех группах были детектированы представители четырех крупных филумов - Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria и Bacteroidetes. Достоверно отмечено, что на уровне филумов у пациентов с ООКН различного генеза наблюдается снижение общего количества фирмикутов и актинобактерий. Для протеобактерий и бактероидов статистически значимых различий численности микроорганизмов в контрольной и экспериментальной группах не было. Кроме того, у пациентов с ООКН в микро-биоте кишечника снижено количество представителей родов Nocardia, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Butyrivibrio, Lactobacillus и Bacteroides. Следует подчеркнуть, что видовое разнообразие сохраняется на уровне контроля. Выявленные изменения,
по-видимому, не связаны с этиологией непроходимости, а также продолжительностью острой фазы заболевания (72 ч), но обусловлены патогенетическими процессами, которые запускаются при обструкции.
Таким образом, выявленные в ходе исследования особенности расширяют наши представления о составе бактериальной флоры у пациентов с ООКН различного генеза. В дальнейшем еще предстоит определить, какие параметры - внутрипросветное давление, рН, осмолярность, целостность слизистой оболочки и моторика кишечника - могут иметь большее влияние на микробиоту при обструкции. Перспективным направлением в лечении и реабилитации больных с ООКН является назначение про-биотиков с целью нормализации таксономического состава микробиоты.
Благодарности. Авторы выражают благодарность кандидату геолого-минералогических наук, руководителю группы физико-химических исследований М.А. Шишкину и инженеру Н.П. Шерсто-битовой за проведение анализа газовой хроматографии - масс-спектрометрии.
Литература
1. Lin Y.M., Li F., Shi X.Z. Mechano-transcription of COX-2 is a common response to lumen dilation of the rat gastrointestinal tract // Neurogastroenterol. Motil. 2012. Vol. 24, N 7. P. 670-677. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2982.2012.01918.x
2. Silen W. In Harrison's Principles of Internal Medicine. New York : McGraw-Hill, 2005. Vol. 2. P. 1803-1805.
3. Ревишвили А.Ш., Оловянный В.Е., Сажин В.П., Кузнецов А.В., Шелина Н.В., Овечкин А.И. Хирургическая помощь в Российской Федерации. Москва, 2022. 200 с.
4. Ramakrishna B.S. Role of the gut microbiota in human nutrition and metabolism // J. Gastroenterol. Hepatol. 2013. Vol. 28, N 4. P. 9-17. DOI: https://doi.org/10.1111/jgh.12294
5. Mazmanian S.K., Liu C.H., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system // Cell. 2005. Vol. 122. P. 107-118. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.05.007
6. Thursby E., Juge N. Introduction to the human gut micro-biota // Biochem. J. 2017. Vol. 474, N 11. P. 1823-1836. DOI: https://doi.org/10.1042/BCJ20160510.
7. Shi X.Z., Lin Y.M., Powell D.W., Sarna S.K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: role of stretch-induced COX-2 // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2011. Vol. 300. P. 99-108. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpgi.00379.2010
8. Stankovic-Bordevic D., Bordevic N., Tasic G., Dinic M., Bogdanovic M. Role of bacteria in Intestinal obstruction pathophysiological processes // Facta Universitatis. 2006. Vol. 13. P. 127-132.
9. Lin Y.M., Li F., Shi X.Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: in vitro, in vivo and ex vivo evidence // PLoS One. 2014. Vol. 9, N 9. Article ID e106242. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0106242
10. Jackson P.G., Raiji M.T. Evaluation and management of intestinal obstruction // Am. Fam. Physician. 2011. Vol. 83. P. 159-165.
11. Rajilic-Stojanovic M., Biagi E., Heilig H.G., Kajander K., Kekkonen R.A., Tims S. et al. Global and deep molecular analysis of microbiota signatures in fecal samples from patients with irritable bowel syndrome // Gastroenterology. 2011. Vol. 141, N 5. P. 1792-1801. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011. 07.043
12. Saulnier D.M., Riehle K., Mistretta T.A., Diaz M.A., Man-dal D., Raza S. et al. Gastrointestinal microbiome signatures of
pediatric patients with irritable bowel syndrome // Gastroen-terology. 2011. Vol. 141, N 5. P. 1782-1791. DOI: https://doi. org/10.1053/j.gastro.2011.06.072
13. Malinen E., Rinttila T., Kajander K., Matto J., Kassi-nen A., Krogius L. et al. Analysis of the fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients and healthy controls with real-time PCR // Am. J. Gastroenterol. 2005. Vol. 100, N 2. P. 373-382. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1572-0241.2005.40312.x
14. Distrutti E., Monaldi L., Ricci P., Fiorucci S. Gut micro-biota role in irritable bowel syndrome: new therapeutic strategies // World J. Gastroenterol. 2016. Vol. 22. P. 2219-2241. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i7.2219
15. Kassinen A., Krogius-Kurikka L., Makivuokko H., Rinttila T., Paulin L., Corander J. et al. The fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients differs significantly from that of healthy subjects // Gastroenterology. 2007. Vol. 133, N 1. P. 24-33. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2007.04.005
16. Ahmed I., Roy B.C., Khan S.A., Septer S., Umar S. Micro-biome, metabolome and inflammatory bowel disease // Microorganisms. 2016. Vol. 4, N 2. P. 20. DOI: https://doi.org/10.3390/ microorganisms4020020
17. Hegde S., Lin Y.M., Golovko G., Khanipov K., Cong Y., Sav-idge T. et al. Microbiota dysbiosis and its pathophysiological significance in bowel obstruction // Sci. Rep. 2018. Vol. 8. P. 1-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-31033-0
18. Баймаков С.P., Хужаева Ш.А., Юнусходжаева Х.Г. Изучение бактериальной транслокации при острой кишечной непроходимости // Современная медицина: актуальные вопросы. 2016. № 8. С. 27-34.
19. Jin Y., Geng R., Liu Y., Liu L., Jin X., Zhao F. et al. Prediction of postoperative ileus in patients with colorectal cancer by preoperative gut microbiota // Front. Oncol. 2020. Vol. 10. Article ID 526009. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2020.526009
20. Осипов Г.А., Зыбина H.H., Родионов Г.Г. Опыт применения масс-спектрометрии микробных маркеров в лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2013. Т. 1, № 3. С. 64-67.
21. Шитиков В.К., ЗинченкоТ.Д., РозенбергГ.С. Макроэкология речных сообществ: концепции, методы, модели. Тольятти : Кассандра, 2011. 255 с.
22. Чернов Т.И., Тхакахова А.К., Кутовая О.В. Оценка различных индексов разнообразия для характеристики почвенного прокариотного сообщества по данным метагеномного ана-
лиза // Почвоведение. 2015. № 4. С. 462-468. DOI: https:// doi.org/10.7868/S0032180X15040036
23. Parkes G.C., Rayment N.B., Hudspith B.N., Petrovska L., Lomer M.C., Brostoff J. et al. Distinct microbial populations exist in the mucosa-associated microbiota of sub-groups of irritable bowel syndrome // Neurogastroenterol. Motil. 2012. Vol. 24,
N 1. P. 31-39. DOI: https://dol.Org/10.1111/j.1365-2982.2011. 01803.x Epub 2011 Nov 9. PMID: 22070725.
24. Carding S., Verbeke K., Vlpond D.T., Corfe B.M., Owen L.J. Dysbiosis of the gut microbiota in disease // Mlcrob. Ecol. Health Dis. 2015. Vol. 26. Article ID 26191. DOI: https://doi. org/10.3402/mehd.v26.26191
References
1. Lin Y.M., Li F., Shi X.Z. Mechano-transcription of COX-2 is a common response to lumen dilation of the rat gastrointestinal tract. Neurogastroenterol Motil. 2012; 24 (7): 670-7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2982.2012.01918.x
2. Silen W. In Harrison's Principles of Internal Medicine. New York: McGraw-Hill, 2005. Vol. 2: 1803-5.
3. Revishvili A.Sh., Olovyanniy V.E., Sazhin V.P., Kuznet-sov A.V., Shelina N.V., Ovechkin A.I. Surgical care in the Russian Federation. Moscow, 2022: 200 p. (in Russian)
4. Ramakrishna B.S. Role of the gut microbiota in human nutrition and metabolism. J Gastroenterol Hepatol. 2013; 28 (4): 9-17. DOI: https://doi.org/10.1111/jgh.12294
5. Mazmanian S.K., Liu C.H., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005; 122: 107-18. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.05.007
6. Thursby E., Juge N. Introduction to the human gut micro-biota. Biochem J. 2017; 474 (11): 1823-36. DOI: https://doi. org/10.1042/BCJ20160510.
7. Shi X.Z., Lin Y.M., Powell D.W., Sarna S.K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: role of stretch-induced COX-2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011; 300: 99-108. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpgi.00379.2010
8. Stankovic-Bordevic D., Bordevic N., Tasic G., Dinic M., Bogdanovic M. Role of bacteria in Intestinal obstruction pathophysiological processes. Facta Universitatis. 2006; 13: 127-32.
9. Lin Y.M., Li F., Shi X.Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: in vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 2014; 9 (9): e106242. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0106242
10. Jackson P.G., Raiji M.T. Evaluation and management of intestinal obstruction. Am Fam Physician. 2011; 83: 159-65.
11. Rajilic-Stojanovic M., Biagi E., Heilig H.G., Kajander K., Kekkonen R.A., Tims S., et al. Global and deep molecular analysis of microbiota signatures in fecal samples from patients with irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 2011; 141 (5): 1792-801. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.043
12. Saulnier D.M., Riehle K., Mistretta T.A., Diaz M.A., Man-dal D., Raza S., et al. Gastrointestinal microbiome signatures of pediatric patients with irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 2011; 141 (5): 1782-91. DOI: https://doi.org/10.1053/ j.gastro.2011.06.072
13. Malinen E., Rinttila T., Kajander K., Matto J., Kassinen A., Krogius L., et al. Analysis of the fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients and healthy controls with real-time PCR. Am J Gastroenterol. 2005; 100 (2): 373-82. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1572-0241.2005.40312.x
14. Distrutti E., Monaldi L., Ricci P., Fiorucci S. Gut microbiota role in irritable bowel syndrome: new therapeutic strategies. World J Gastroenterol. 2016; 22: 2219-41. DOI: https://doi. org/10.3748/wjg.v22.i7.2219
15. Kassinen A., Krogius-Kurikka L., Makivuokko H., Rinttila T., Paulin L., Corander J., et al. The fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients differs significantly from that of healthy subjects. Gastroenterology. 2007; 133 (1): 24-33. DOI: https:// doi.org/10.1053/j.gastro.2007.04.005
16. Ahmed I., Roy B.C., Khan S.A., Septer S., Umar S. Mi-crobiome, metabolome and inflammatory bowel disease. Microorganisms. 2016; 4 (2): 20. DOI: https://doi.org/10.3390/micro-organisms4020020
17. Hegde S., Lin Y.M., Golovko G., Khanipov K., Cong Y., Savidge T., et al. Microbiota dysbiosis and its pathophysiological significance in bowel obstruction. Sci Rep. 2018; 8: 1-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-31033-0
18. Baymakov S.R., Khuzhaeva Sh.A., Yunuskhodzhaeva Kh.G. Investigation of bacterial translocation in acute intestinal obstruction. Sovremennaya meditsina: aktual'nye voprosy [Modern Medicine: an Actual Problems]. 2016; (8): 27-34. (in Russian)
19. Jin Y., Geng R., Liu Y., Liu L., Jin X., Zhao F., et al. Prediction of postoperative ileus in patients with colorectal cancer by preoperative gut microbiota. Front Oncol. 2020; 10: 526009. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2020.526009
20. Osipov G.A., Zybina N.N., Rodionov G.G. Experience of using mass spectrometry of microbe markers in laboratory diagnostics. Meditsinskiy alfavit [Medical Alphabet]. 2013; 1 (3): 64-7. (in Russian)
21. Shitikov V.K., Zinchenko T.D., Rozenberg G.S. Macroecol-ogy of river communities: concepts, methods, models. Tolyatti: Kassandra, 2011: 255 p. (in Russian)
22. Chernov T.I., Tkhakakhova A.K., Kutovaya O.V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil pro-karyotic community by metagenomic analysis. Pochvovedenie [Soil Science]. 2015; (4): 462-8. DOI: https://doi.org/10.7868/ S0032180X15040036 (in Russian)
23. Parkes G.C., Rayment N.B., Hudspith B.N., Petrovska L., Lomer M.C., Brostoff J., et al. Distinct microbial populations exist in the mucosa-associated microbiota of sub-groups of irritable bowel syndrome. Neurogastroenterol Motil. 2012; 24 (1): 31-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2982.2011.01803.x Epub 2011 Nov 9. PMID: 22070725.
24. Carding S., Verbeke K., Vipond D.T., Corfe B.M., Owen L.J. Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microb Ecol Health Dis. 2015; 26: 26191. DOI: https://doi.org/10.3402/ mehd.v26.26191
