Связывание цитостатиков с элементами плазмы лимфы больных раком легкого Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Уменьшение продукции гонадотропных гормонов гипофиза у данного контингента больных выражено в меньшей степени, чем у предыдущего. Оно отмечено лишь со стороны ФСГ (Р < 0,5), содержание ЛГ в среднем не отличалось от нормального уровня (табл. 2). В этой группе следует отметить широкий диапазон изучаемых величин концентрации ФСГ и ЛГ. Он отразился на количественном распределении больных с пониженным, повышенным и нормальным содержанием гонадотропных гормонов в крови. Увеличенное количество ФСГ выявлено у 20 % больных. В среднем содержание ФСГ у этих больных было почти вдвое выше нормы. Нормальное количество ФСГ отмечено лишь у 10 % пациенток. У 70 % больных 2-й группы концентрация ФСГ в крови была ниже, чем у здоровых лиц. Высокое содержание ЛГ (27,0 ± 5,0) отмечено у 16 % больных 2-й группы, у 43 % женщин количество ЛГ составило всего лишь 3,7 ± 0,40.

Таким образом, у женщин с сохранённой репродуктивной функцией, несмотря на снижение абсолютного уровня эстрогенов, нельзя полностью отрицать состояние эстрогенизации организма. Явление относительной эстрогенизации у них проявляется благодаря наиболее выраженному, в сравнении со всеми стероидами, снижению уровня андрогенных гормонов, сдвигу андрогенно-эстрагенного равновесия в сторону эстрадиола, а также в нарушении эстрогенно-прогестинового баланса.

Литература

1. Dapunt O, Daxenlichter G. // Hoim. Metabol. Res. 1999. Vol. 19. № 5. P. 230-233.

2. Дильман В.М. Эндокринологическая онкология. М., 1983 .

3. Geffrey A., Nisker Z. // Am. J. Ginaecol. 1997. № 5. P. 546-550.

Ростовский научно-исследовательский

онкологический институт МЗ РФ 9 февраля 2005 г.

УДК 616-006.6

СВЯЗЫВАНИЕ ЦИТОСТАТИКОВ С ЭЛЕМЕНТАМИ ПЛАЗМЫ ЛИМФЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО

© 2005 г. Ю. С. Сидоренко, Г.З. Сергостьянц, Е.М. Франциянц, К. С. Карапетян

The main target for binding chemotherapeutic agents in plasma of lymph is albumin. But the character of albumin binding with various cytostatics is different. Less amount of doxorubicin and platinum not resulting in lipid fragmentation binds with globulin fraction of plasma of lymph than with albumin. Sulphhydryl groups of molecules are used. No signs of cyclo-phosphane binding with globulin fraction of plasma of lymph have been revealed.

При изучении лечебного действия химиопрепаратов, преинкубирован-ных с аутоэритротромболейкомассой, у больных с лимфогранулематозом

было показано связывание после экспозиции циклофосфана и доксоруби-цина с мембранами эритроцитов. При этом было отмечено, что под действием мембранных оксиредуктаз циклофосфан подвергался процессу метаболической активации и превращению его в высокореактивные алкилиро-ваннные производные. Доксорубицин не претерпевал никаких превращений, однако длительно депонировался на эритроцитах. Такое взаимодействие химиопрепаратов с форменными элементами крови приводило к более выраженному лечебному эффекту, чем при традиционном способе их введения [1]. Аналогичный эффект по сравнению с системной химиотерапией был получен при лечении больных раком молочной железы хи-миопрепаратами, преинкубированными с аутоплазмой. При этом было установлено, что преобладающее их количество связывалось с альбумином, что способствовало приобретению комплексом альбумин-химио-препарат новых свойств и повышению тропности к быстропролифери-рующим тканям органов, в том числе и опухолевой [2]. Мы получили выраженный клинический эффект при лечении больных раком легкого хи-миопрепаратами, преинкубированными с составляющими лимфы. В этой связи интерес представляло исследование особенностей связывания хи-миопрепаратов с белками плазмы лимфы.

Материалы и методы

Лимфу получали путем дренирования грудного протока 15 больных распространенным раком легкого в стандартный флакон, содержащий глюгицир.

После инкубации плазмы лимфы больных раком легкого с платидиа-мом и смесью доксорубицина и циклофосфана в основных белковых фракциях - альбумин, глобулины, изучали алкилирующую активность циклофосфана и интенсивность флуоресценции доксорубицина, а также количество платины для выяснения приоритетных структур связывания.

Фракцию альбумина и глобулинов из плазмы лимфы больных до и после ее преинкубации с цисплатином или смесью доксорубицин+цик-лофосфан в течение 30 мин выделяли методом ионообменной хроматографии [3]. Плазму лимфы фракционировали с использованием анионо-обменной смолы ДЭАЭ-целлюлозы DE-32 («Whatman», США). Разделение проводили в колонках фирмы «Serva» (Германия) диаметром 5 см и длиной 50 см. Профиль фракционирования компонентов сыворотки фиксировали путем определения оптической плотности поглощения при 280 нм и регистрировали на Увикорде-1 (Швеция). Перед фракционированием плазму лимфы диализировали против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,2 в течение 16-18 ч. Затем наносили на колонку ДЭАЭ-целлюлозой и промывали 200 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,2 со скоростью 1,5 мл в мин. Последующее фракционирование проводили ступенчатым градиентом концентрации NaCl от 0,05 до 0,5 М в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2. Идентификацию фракций осуществляли методом электрофореза на аце-

татной пленке в веронал-мединаловом буфере, рН 8,4 при и = 100 В, I = 5 мА. После электрофореза ацетатную пленку окрашивали 1%-м раствором амидо черного в 7 %-й уксусной кислоте в течение 30 мин с последующим отмыванием в 7 %-й уксусной кислоте.

Во фракциях плазмы лимфы были изучены:

- количество сульфгидрильных групп [4];

- концентрация молекул средней массы и коэффициент ароматичности, который расчитывали как отношение показателей экстинции при 238/280 нм [5];

- количество свободных аминогрупп, о котором судили по приросту ТХУ-растворимых фоллин-положительных продуктов.

Результаты исследования

Было установлено, что после 60-минутной инкубации плазмы лимфы со смесью доксорубицина и циклофосфана (150 мкг и 5 мг в 1 мл соответственно) выявлялись две мишени для связывания доксорубицина - альбумин и глобулиновая фракция. С альбумином плазмы лимфы связывалось 56 ± 1,9 % и с глобулиновой фракцией - 15 ± 2,6 % доксорубицина.

Увеличение уровня алкилированных производных циклофосфана не было обнаружено ни в одном из исследованных образцов, т.е. если допустить, что этот цитостатик связывается с форменными элементами плазмы лимфы, то он остается в неизмененном виде, не проходя стадию метаболической активации.

После инкубации плазмы лимфы с препаратами платины в дозе 0,5 мг/мл 65 ± 3,1 % ее содержания обнаруживалось в альбуминовой фракции и 20 ± 2,5 % - во фракции глобулинов.

Итак, удалось выяснить, что после инкубации химиопрепаратов с плазмой лимфы для доксорубицина выявлялись две преимущественные мишени связывания, причем в качестве более предпочтительной выступала альбуминовая фракция плазмы лимфы. Вместе с тем, интересен факт и связывания некоторого количество доксорубицина с глобулиновой фракцией плазмы лимфы. При инкубации этого химиопрепарата с плазмой крови и с цельной кровью связывания его с глобулинами обнаружено не было [2].

Мы не встретили в литературе данных о взаимодействии лекарственных веществ с составляющими лимфы. Однако, если учесть, что белковый состав плазмы лимфы и крови идентичен и отличается лишь количественно, то полученные нами результаты согласуются с данными литературы о возможности взаимодействия лекарственных веществ с альбумином сыворотки крови. Изучение количества белка в альбуминовой фракции плазмы лимфы до и после инкубации ее со смесью циклофосфан+доксо-рубицин и платиной показало, что содержание альбумина снижалось на 40 и 70 % соответственно. При этом уровень белка после инкубации смеси доксорубицин+циклофосфан с глобулиновой фракцией снижался на

20 %, а после инкубации с платиной повышался на 60. Это свидетельствовало о том, что смесь циклофосфан+доксорубицин частично разрушает альбумин и глобулярные белки, тогда как цисплатин не разрушают их, а способствуют глобулинизации альбумина, увеличивая тем самым количество определяемых глобулярных белков. Эффект глобулинизации альбумина сыворотки крови под действием циклофосфана известен [6]. По-видимому, препараты платины связываются с альбумином по аналогичным механизмам.

После инкубации альбумина со смесью циклофосфан+доксорубицин снижение уровня сульфгидрильных групп составило 25 ± 3,2 %, а после инкубации с платиной - 33 ± 2,9. Преинкубация плазмы лимфы с чистым циклофосфаном не влияла на содержание сульфгидрильных групп в альбумине. Это свидетельствовало о том, что доксорубицин и платина связываются с альбумином, используя практически треть свободных сульфгид-рильных групп (табл. 1). После инкубации глобулиновой фракции со смесью циклофосфан+доксорубицин снижение содержания сульфгидрильных групп составило 10 ± 1,2, а с препаратами платины - 23 ± 2,2 %. Не обнаружено изменения показателя после инкубации глобулиновой фракции только с циклофосфаном.

Таблица 1

Изменение некоторых показателей состояния альбумина после инкубации плазмы лимфы с химиопрепаратами

Исследуемый показатель Альбумин Альбумин+ +циклофосфан+доксорубицин Альбумин+ +платина

Индекс ароматичности, К238/28 22,6 ± 1,2 14,4 ± 1,21 21,5 ± 3,2

Молекулы средней массы, (усл.ед. 0,04 ± 0,01 0,07 ± 0,011 0,045 ± 0,1

КН2-группы, мкМтиро-зина/г альбумина 15,7 ± 2,2 23,2 ± 2,11 17,3 ± 4,3

8Н-группы, мкМ/г альбумина 399,6 ± 27,6 286,9 ± 22,81 265,3 ± 25,1

Количество белка, г/л 20,6 ± 1,8 15,3 ± 1,21 7,1 ± 1,01

Примечание. 1 - достоверно по отношению к фоновым значениям.

Исследование показателей, характеризующих уровень фрагментации белков, молекул средней массы, а также содержание свободных КН2-групп, выявило увеличение этих показателей после инкубации альбумина со смесью циклофосфан+доксорубицин на 35 ± 2,5 и 50 ± 3,4 % соответственно (табл. 1).

Индекс ароматичности молекулы альбумина снижался после инкубации со смесью циклофосфан+доксорубицин на 36,4 %, а после инкубации с глобулиновой фракцией плазмы лимфы индекс ароматичности не изменялся. Не изменялся индекс ароматичности в альбумине и глобулиновой

фракции и после инкубации плазмы лимфы только с доксорубицином. Эти результаты согласуются с данными, полученными Л.Ю. Владимировой [2] после инкубации плазмы крови с различными химиопрепаратами, и свидетельствуют о том, что доксорубицин связывается с молекулой альбумина в цистеинсодержащей зоне, или так называемом лекарствосвязы-вающем участке 1, а циклофосфан имеет отличное место связывания - так называемый индолсвязывающий участок, или лекарствосвязывающий участок 2.

После инкубации плазмы лимфы с препаратами платины индекс ароматичности снижался в глобулиновой фракции в 2,5 раза, тогда как в альбуминовой фракции показатель не менялся (табл. 1, 2).

Таблица 2

Изменение некоторых показателей состояния глобулиновой фракции после инкубации плазмы лимфы с химиопрепаратами

Исследуемый показатель Глобулиновая фракция Глобулиновая фракция+ +циклофосфан +доксорубицин Глобулиновая фракция +платина

Индекс ароматичности, К238/280 21,8 ± 1,2 20,0 ± 1,5 8,7 ± 0,91

Молекулы средней массы, усл.ед. 0,05 ± 0,01 0,06 ± 0,02 0,045 ± 0,1

КН2-группы, мкМ тирозина/г альбумина 14,7 ± 1,8 15,3 ± 1,3 16,1 ± 1,5

8Н-группы, мкМ/г альбумина 412,9 ± 21,3 361,6 ± 22,81 321,9 ± 25,11

Количество белка, г/л 14,6 ± 1,3 11,8 ± 1,01 23,4 ± 2,1

Примечание. 1 - достоверно по отношению к фоновым значениям.

Вопрос о связывании платины с белками плазмы лимфы мало освещен в литературе. Близкие к нашим результаты были получены Ю.Ю. Козель

[7], косвенными методами показавшей связывание препаратов платины с белками лимфы после их совместной инкубации. Известны данные о том, что препараты платины связываются с белками сыворотки крови - альбумином, трансферином, гамма-глобулинами. Известно, что именно несвязанная с белками часть препаратов платины определяет их токсичность

[8]. Полученные нами результаты показывают, что препараты платины после инкубации связываются с альбумином и глобулиновой фракцией плазмы лимфы с участием сульфгидрильных групп. Такое связывание ионов тяжелых металлов сывороточным альбумином известно и лежит в основе дезинтаксикационной функции последнего [9]. Вместе с тем уменьшение уровня индекса ароматичности белков указывает на связывание препарата и в индолсвязывающем участке, т.е. платина, по механизму связывания с альбумином, проявляет свойства, присущие как циклофос-фану, так и доксорубицину. Это не удивительно, так как известно, что сывороточный альбумин связывает и переносит многие лекарственные

вещества [10]. При этом, являясь самым эффективным по способности связывать различные лекарственные вещества, альбумин содержит несколько связывающих участков, с которыми лиганды взаимодействуют специфично или стереоспецифично [11].

Инкубация смеси циклофосфан+доксорубицин с лимфой приводила к фрагментации альбумина плазмы, о чем свидетельствует нарастание количества молекул средней массы и уровня свободных аминогрупп (табл. 1). Такого эффекта не происходило после инкубации плазмы лимфы с платиной.

Таким образом, основной мишенью для связывания химиопрепаратов в плазме лимфы является альбумин. При этом характер связывания альбумина с различными цитостатиками отличен. С глобулиновой фракцией плазмы лимфы связывается меньшее, чем с альбумином, количество док-сорубицина и платины, не приводящее к фрагментации белков. При этом используются сульфгидрильные группы молекул. Не обнаружено признаков связывания циклофосфана с глобулиновой фракцией плазмы лимфы (табл. 2).

Молекула альбумина является одним из важнейших компонентов биологических жидкостей организма, участвующих в связывании и транспорте лекарственных препаратов, в том числе и цитостатиков. Вместе с тем, связываясь с разнообразными лекарственными веществами, альбумин может влиять на их метаболизм и перенос через клеточные мембраны.

После инкубации плазмы лимфы с платиной альбумин плазмы лимфы подвергается глобулинизации. В таком виде альбумин может сам не проникать через мембрану, а выполнять роль посредника, ускоряя переход химиопрепарата в клетку и усиливая его метаболизм. Учитывая тот факт, что токсичность платины определяется несвязанной с белками частью препарата, можно предположить, что инкубация препаратов платины с плазмой лимфы способствует фиксации большего их количества на альбумине, что приводит к снижению общетоксических проявлений цитоста-тика. В случае связывания альбумина плазмы лимфы с доксорубицином происходит фрагментация молекулы. Образовавшиеся среднемолекуляр-ные продукты способны проникать через биологические мембраны и способствовать ускорению метаболизма химиопрепарата.

Следует отметить, что катионизированный, связанный с химиопрепара-тами альбумин удерживается тканью опухоли в течение более длительного периода, чем нативный белок [12]. Фрагменты альбумина с присоединившимися к ним химиопрепаратами легко могут проникать через гистогема-тические барьеры непосредственно к органам-мишеням, создавая тем самым в них повышенную концентрацию цитостатиков, так как известно, что прочно связывающиеся с белками плазмы лекарственные средства так же прочно связываются и с клетками тканей органов. В таком случае время полунахождения их в тканях увеличивается вплоть до нескольких дней,

несмотря на то, что скорость метаболизма или активной экскреции веществ лимитируется, главным образом, скоростью кровотока [11].

Литература

1. Попова И.Л. Нетрадиционный способ введения химиопрепаратов в лечении лимфогранулематоза: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1999.

2. Владимирова Л.Ю. Неоадъювантная химиотерапия на естественных средах организма с применением пептида эпифиза эпиталамина в комплексном лечении местнораспространенного рака молочной железы: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 2000.

3. КочетовГ.А. Практическое руководство по энзимологии. М., 1980.

4. ФоломеевВ.Ф. // Лаб. дело. 1981. № 1. С. 33-35.

5. Ковалевский А.Н., Нифантьев О.Е. // Лаб. дело. 1989. № 10. С. 35-39.

6. Проценко Л.Д., Булкина З.П. Химия и фармакология синтетических противоопухолевых препаратов. Киев, 1985.

7. Козель Ю.Ю. Лимфохимиотерапия в комплексном лечении местнораспространенного рака органов полости рта и ротоглотки: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 2001.

8. Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний. 1984. С. 95-100.

9. Джафаров А.М., Алиев Л.А. Структура и конформационные особенности сывороточного альбумина. Баку, 1990.

10. Марри Р. и др. Биохимия человека. В 2 т. Т. 2. М., 1993.

11. Сергеев П.В., Галенко-Ярошевский П.А., Шимановский Н.Л. Очерки биохимической фармакологии. М., 1996.

12. ДееваВ.С. и др. // Вопр. биол., мед. и фармац. химии. 1999. № 1. С. 23-26.

Ростовский научно-исследовательский

онкологический институт МЗ РФ 2 марта 2005 г.