CC BY
48
СВЯЗЬ ПРОМОТОРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА -308G>A ГЕНА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ С ТЯЖЕСТЬЮ ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА У РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЖИТЕЛЕЙ КУРСКОЙ ОБЛАСТИ
Самгина Т. А., Бушуева О. Ю., Иванов В. П., Солодилова М. А., Назаренко П. М., Полоников А. В. Курский государственный медицинский университет
THE ASSOCIATION STUDY OF THE PROMOTER POLYMORPHISM -308G>A OF TUMOR NECROSIS FACTOR GENE WITH THE DEVELOPMENT AND SEVERITY OF ACUTE PANCREATITIS IN RUSSIAN POPULATION OF KURSK REGION
Samgina T. A, Ivanov V. P., Solodilova M. A., Nazarenko P. M., Polonikov A. V.
Kursk State Medical University
Самгина Татьяна Александровна Samgina Tatiana A. E-mail: tass@list.ru
университет
Полоников А. В. — профессор кафедры биологии и медицинской генетики, Курский государственный медицинский университет
Samgina T. A. — ass. Professor of the department of surgical diseases № 2, Kursk State Medical University
Bushuyeva O. Y. — ass. Professor of the department of biology and medical genetics, Kursk State Medical University
Ivanov V. P. — Professor, Head of the department of biology and medical genetics, Kursk State Medical University
Solodilova M. A. — Professor of the department of biology and medical genetics, Kursk State Medical University
Nazarenko P. M. — Professor, Head of the department of surgical diseases № 2, Kursk State Medical University
Polonikov A. V. — Professor of the department of biology and medical genetics, Kursk State Medical University
Самгина Т. А. — доцент кафедры хирургических болезней №2, Курский государственный медицинский университет Бушуева О. Ю. — доцент кафедры биологии и медицинской генетики, Курский государственный медицинский университет Иванов В. П. — профессор, заведующий кафедрой биологии и медицинской генетики, Курский государственный медицинский университет
Солодилова М. А. — профессор кафедры биологии и медицинской генетики, Курский государственный медицинский университет
Назаренко П. М. — профессор, заведующий кафедрой хирургических болезней №2, Курский государственный медицинский
Резюме
Целью исследования было изучение связи полиморфизма -308G / A гена TNF с развитием и тяжестью течения острого панкреатита у жителей Курской области. Для генотипирования полиморфизмов с помощью молеку-лярно-генетического анализа использовались образцы ДНК 190 больных острым панкреатитом и 217 здоровых неродственных индивидов популяции Центрально-Черноземного региона России. В результате исследования различий в частотах аллелей и генотипов между группами была обнаружена ассоциация полиморфизма -308G>A гена TNF с риском развития нетяжелой формы острого небилиарного панкреатита (OR 1.81 (95% CI 1.02-3.23 p=0.04).
Ключевые слова: острый панкреатит, фактор некроза опухоли, генетический полиморфизм. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 109 (9): 17-20
Summary
The aim of this study was to investigate the relationship between the polymorphism -308G>A of tumor necrosis factor (TNF) gene and the risk and severity of acute pancreatitis (AP) in unrelated Russians from Kursk region. DNA samples were obtained from 190 AP patients and 217 healthy controls for genotyping the polymorphism through a TaqMan allelic discrimination assay. Although -308G>A genotypes did not show a significant association with disease risk, the genotype -308GA was found to be associated only with non-severe type of acute alcohol-related pancreatitis (odds ratio 1.81 (95% CI 1.02-3.23 p=0.04).
Keywords: acute pancreatitis, tumour necrosis factor, genetic polymorphism. Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 109 (9):17-20
Введение
Острый панкреатит (ОП) и, особенно, его тяжелая форма проявления — панкреонекроз (ПН) является одной из наиболее актуальных проблем современной гастроэнтерологии и абдоминальной хирургии, связанных со значительной распространенностью, высокой заболеваемостью и смертностью, которая при инфицированной форме патологии достигает 85% [1]. Согласно современным представлениям, острый панкреатит представляет собой многофакторное заболевание, развитие которого определяется сложным взаимодействием множества генов и различных факторов внешней среды [2]. Вопросы, касающиеся наследственной предрасположенности к развитию острого панкреатита и его осложнений, изучены не достаточно [3].
Важнейшую роль в патогенезе ОП и ПН играет активация цитокинового каскада, обуславливающая выброс различных медиаторов воспаления и способствующая деструктивно-воспалительным изменениям поджелудочной железы [4]. Одним из наиболее мощных провоспалительных цитоки-нов является фактор некроза опухоли (TNF), который модулирует экспрессию генов транскрипционных и ростовых факторов, рецепторов клеточной
Материалы и методы.
Материалом для исследования послужили образцы ДНК 190 больных ОП (53 женщины и 137 мужчин) и 217 здоровых индивидов (72 женщины и 145 мужчин), находившихся на стационарном лечении в хирургических отделениях города Курска в период с 2012 по 2013 год. В исследуемую группу были включены российские пациенты. Средний возраст больных составил 48,9+13,1, здоровых лиц — 47,8+12,1. Мы придерживаемся международной классификации острого панкреатита, принятой в 1992 г. в Атланте. Верификация диагноза осуществлялась с использованием общеклинических, лабораторных (общий и биохимический анализ крови) и инструментальных (УЗИ, МРТ, ЭФГДС с осмотром большого дуоденального сосочка) методов исследования. У 155 пациентов был диагностирован небилиарный панкреатит, среди которых преобладали мужчины (129 человек). У 35 пациентов панкреатит развился на фоне желчнокаменной болезни. Из 190 больных с острым панкреатитом у 89 (47%) диагностирована тяжелая форма болезни, тогда как у 101 пациента
Результаты.
Частоты аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A гена TNF представлены в таблице 1. Генотипы исследуемого полиморфизма находились в соответствии с распределением Харди-Вайнберга (p > 0,05). Как видно из таблицы 1, частоты аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A гена TNF, были сопоставимы с таковыми, изученными ранее в Курской популяции [16], и не отличались в группах здоровых лиц и больных острым панкреатитом. Также не было установлено статистически значимых различий в частотах аллелей и генотипов TNF между группами больных небилиарным ОП и здоровыми лицами.
поверхности и острофазных белков и играет важную роль в противоинфекционном и противоопухолевом иммунитете [5]. Известно, что TNF стимулирует выработку провоспалительных интерлейкинов 1 и 6 — основного индуктора генерализованной воспалительной реакции в различных органах и тканях, в том числе, и в поджелудочной железе [6,7].
В связи с тем, что ген TNF содержит множество ДНК-полиморфизмов, он стал предметом интенсивных генетических исследований по поиску его ассоциаций с риском развития острого панкреатита и панкреонекроза. Отдельными исследованиями установлена ассоциация функционально значимого полиморфизма -308G>A в промоторе гена TNF с тяжелой формой острого панкреатита [8], а также развитием на его фоне шокового состояния [9]. Однако в других работах [10,11,12,13], связь полиморфизма -308G>A гена TNF не подтвердилась, что может свидетельствовать о межпопуляционных различиях генетической предрасположенности к болезни.
Целью настоящего исследования было изучение связи полиморфизма -308G>A гена TNF с риском развития и характером течения острого панкреатита у русских жителей Курской области.
(53%) имел место нетяжелый ОП. У 64 пациентов (34%) выявлен тотально-субтотальный панкреонекроз, который у 37 пациентов (19.5%) был инфицированным.
Выделение геномной ДНК из периферической крови проводилось стандартным методом феноль-но-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизма -308G>A гена TNF проводилось методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием синтезированных аллель-специфических TaqMan-зондов (компания Синтол, Москва) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) согласно методике, описанной в литературе [15]. Для оценки ассоциаций аллелей и генотипов гена TNF с риском развития и течения ОП использовали критерий c2 и отношение шансов (OR) с 95%-ми доверительными интервалами (CI). Уровень статистической значимости принимали при p < 0,05. Статистический анализ осуществлялся с использованием программы Statistica 6.0 ("StatSoft", США).
С целью определения связи изучаемого ДНК-полиморфизма с тяжестью течения ОП нами был проведен анализ ассоциации раздельно в группах с больных тяжелой и нетяжелой формами заболевания, результаты которого представлены в таблице 2.
Было установлено, что гетерозиготный генотип -308G/A ассоциировался с риском нетяжелой формы ОП OR=1,81 (95% CI 1,02 - 3,23 p=0.04). Однако данный генотип не оказывал влияния на риск развития тяжелого ОП (p > 0.05). Частоты аллелей и генотипов TNF в группах здоровых и больных с билиарным ОП, протекавшим на фоне желчнокаменной болезни,
- 308G
Генотипы/ Больные ПН Здоровые лица OR (95%CI)
аллели n % n % С2 (p)
Сравнение групп больных ПН (n=190) и здоровых лиц (n=217)
- 308G/G 141 74,2 175 80,6 2,42 (0,12) 1,45 (0,91 - 2,31)
- 308G/A 47 24,7 40 18,4 2,40 (0,12) 1,45 (0,90 - 2,34)
- 308A/A 2 1,1 2 0,9 0,02 (0,89) 1,14 (0,16 - 8,20)
- 308G 0,866 0,899 1,37 (0,89 - 2,11)
- 308A 0,134 0,101
Сравнение групп больных небилиарным ПН (n=155) и здоровых лиц (n=217)
- 308G/G 115 74,2 175 80,6 2,19 (0,14) 1,45 (0,89 - 2,37)
- 308G/A 38 24,5 40 18,4 2,02 (0,16) 1,44 (0,87 - 2,37)
- 308A/A 2 1,3 2 0,9 0,12 (0,73) 1,41 (0,20 - 10,1)
0,865
0,899
- 308A
0,135
0,101
2,06 (0,15)
1,39 (0,89 - 2,18)
Таблица 1
Частоты аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A гена TNF в группах больных панкреонекрозом и здоровых лиц
Генотипы/ Больные ПН Здоровые лица c2 (p) OR (95%CI)
аллели n % n %
Сравнение групп больных тяжелой формой ПН (n=69) и здоровых лиц (n=217)
- 308G/G 54 78,3 175 80,6 0,19 (0,67) 1,16 (CI 0,60 - 2,25)
- 308G/A 13 18,8 40 18,4 0,01 (0,94) 1,03 (CI 0,51 - 2,06)
- 308A/A 2 2,9 2 0,9 1,48 (0,22) 3,21 (CI 0,44 - 23,2)
- 308G 0,877 0,899 0,52 (0,47) 1,25
- 308A 0,123 0,101 (0,69 - 2,26)
Сравнение групп больных нетяжелой формой ПН (n=86) и здоровых лиц (n=217)
- 308G/G 61 70,9 175 80,6 3,38 (0,07) 1,71 (CI 0,96 - 3,03)
- 308G/A 25 29,1 40 18,4 4,14 (0,04) * 1,81 (CI 1,02 - 3,23)
- 308A/A 0 0,0 2 0,9 0,80 (0,37) 0,5 (CI 0,02 - 10,5)
- 308G 0,855 0,899 ■ 2,36 (0,124) 1,51 (0,89 - 2,55)
— 308A 0,145 0,101
Таблица 2
Частоты аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A гена TNF в группах больных тяжелой и нетяжелой формами панкреонекроза и здоровых лиц
в том числе с учетом тяжести течения и наличия осложнений, не отличались (данные не представлены).
Обсуждение. Изучение полиморфизма генов цитокинов и, в частности, фактора некроза опухоли — одно из активно разрабатываемых направлений исследований в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения острого панкреатита [2]. Известно, что при развитии острого панкреатита цитокины относят к факторам агрессии третьего порядка после активации ферментов поджелудочной железы и калликреин-кининовой системы [14]. Под влиянием цитокинов, в том числе и TNF, в начале развития заболевания увеличивается концентрация всех медиаторов воспаления в поджелудочной железе, печени, лёгких, селезёнке и системной циркуляции, что отражает формирование полиорганной и системной воспалительной реакции. В связи тем, что TNF обладает цитотоксическим, иммуномоду-лирующим и провоспалительным свойствами, он может способствовать воспалению как прямым, стимулируя хемотаксис нейтрофилов в очаг воспаления, так и косвенным способом — за счет индукции синтеза других провоспалительных медиаторов [6]. Таким образом, патогенеческая значимость гена TNF в отношении острого панкреатита очевидна.
TNF представляет собой негликозированный белок, синтезирующийся активированными макрофагами. Описано более 30 полиморфных вариантов этого гена. Однако наиболее хорошо изученной является нуклеотидная замена гуанина на аденин в позиции -308 промотора гена, обусловливающая появление редкого аллеля, который ассоциирован
с увеличенной продукцией белка [18]. В рамках настоящего исследования нами обнаружена ассоциация полиморфизма -308G>A гена TNF с риском развития нетяжелой формы острого небилиарного панкреатита, тогда как полиморфизм не показал связи с развитием тяжелой формы болезни. В целом выявленная закономерность согласуется с результатами отдельных исследований, в которых установлена связь полиморфизма -308G>A гена TNF с некоторыми клиническими проявлениями острого панкреатита и другими патологическими состояниями. В частности, как уже было отмечено выше, обнаружена связь данного полиморфизма TNF с развитием тяжелой формы острого панкреатита [8] и формированием осложнений болезни — развитием шокового состояния [9]. Кроме того известно, что полиморфизм -308G>A гена TNF является маркером неблагоприятного прогноза у больных, перенесших сепсис, цирроз печени и менингококковую инфекцию [17]. Несмотря на то, что во многих проведенных исследованиях (в том числе и в нашей работе) прямого влияния полиморфизма на риск острого панкреатита обнаружено не было, известна его связь с развитием таких осложнений ОП, как сепсис и полиорганная недостаточность [8,9]. Представленные примеры демонстрируют плейотропное (множественное) и неспецифичное провоспалительное действие фактора некроза опухоли на различные органы и ткани. Результаты нашего исследования можно объяснить тем, что, по-видимому, полиморфизм -308G>A гена TNF не вносит существенного вклада в формирование деструктивных изменений
в поджелудочной железе, обнаруживаемых при тяжелой форме болезни — панкреонекрозе. Кроме того, неоднозначность результатов, полученных в различных популяциях мира относительно роли гена TNF в детерминации наследственной предрасположенности к ОП и его клиническому течению, может быть свидетельством того, что данный ген не играет самостоятельной роли в этиологии болезни. По всей видимости, ген TNF выступает в роли так называемого гена-модификатора, фенотипиче-ский эффект которого в отношении патогенеза ОП выражен незначительно.
Таким образом, выявленная нами ассоциация гетерозиготного генотипа TNF -308G/A с риском развития нетяжелой формы острого панкреатита OR=1,81 (95% CI 1,02 - 3,23 p=0.04), при отсутствии влияния на риск развития его тяжелой формы
Список литературы
1. Горский В. А., КовальчукЛ. В., Агапов М. А. и др. Анти-медиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита// Хирургия. — 2010. — № 3. — С. 54 - 61
2. LaRusch J, Whitcomb DC. Genetics of pancreatitis// Curr Opin Gastroenterol. — 2011.-№ 27. — С. 467 - 74
3. Багненко С. Ф., Гольцов В. Р. Острый панкреатит современное состояние проблемы и нерешённые вопросы // Альманах института Хирургии им. А. В. Вишневского. — 2008. — Т. 3, № 3. — С. 104 - 112
4. Салиенко С. В., Маркелова Е. В., Сотниченко Б. А. Иммунологические аспекты патогенеза острого деструктивного панкреатита и коррекция нарушений рекомбинантным IL-2. // Цитокины и воспаление. — 2006. —Т. 5, № 4. — С. 46 - 50
5. Царегородцева Т. М., Серова Т. И. Цитокины в гастроэнтерологии.-М.: Анахарсис, 2003
6. Первова О. В. Острый панкреатит: клинико-генети-ческие параллели, профилактика и лечение осложнений: эксперим.-клинич. исслед.:автореф. дисс... .д-ра мед. наук: 14.00.27/ [Краснояр. гоС. мед. акад.].-Красноярск, 2006.-59с.
7. Matsuda N, Hattori Y. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS): molecular Pathophysiology and gene therapy// J. Pharmacol. Sci. — 2006. — vol. 1, № 3.— С. 189 - 198
8. Balog A, Gyulai Z, Boros LG, et al. Polymorphism of the TNF-alpha, HSP70-2, and CD14 genes increases susceptibility to severe acute pancreatitis// Pancreas. — 2005. — vol. 30, № 2.-Р. 46 - 50
9. Zhang D, Li J, Jiang ZW, et al. Association of two polymorphisms of tumor necrosis factor gene with acute severe pancreatitis// J. Surg. Res. -2003. — vol. 112, № 2. —Р. 138 - 43
10. Tukiainen E, Kylanpaa ML, Puolakkainen P, et al. Polymorphisms of theTNF, CD14, and HSPA1B genes
(p > 0.05) предполагает в дальнейшем проведение исследований по анализу взаимодействия нескольких генов, продукты которых контролируют общие метаболические пути. В сочетании с другими полиморфными генами (вследствие их аддитивного взаимодействия) влияние гена TNF на формирование ОП может быть более существенным.
С практической точки зрения, основываясь на анализе генетических факторов, таких как полиморфные гены цитокинов, уже сейчас можно осуществлять прогнозирование вероятности развития острого панкреатита и особенностей его клинического течения, что имеет важное значение в хирургии и гастроэнтерологии и открывает возможности ранней (доклинической) диагностики болезни и проведения необходимых профилактических мероприятий по ее предупреждению.
in patients with acute alcohol-induced pancreatitis// Pancreas. — 2008. — vol. 37,№ 1. — Р. 56 - 61
11. Chang YT, Chang MC, Su TC, et al. Association of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mutation/variant/haplotype and tumor necrosis factor (TNF) promoter polymorphism in hyperlipidemic pancreatitis// Clin. Chem. — 2008. — vol. 54,№ 1. — Р. 131 - 38
12. Powell JJ, Fearon KC, Siriwardena AK, et al. Evidence against a role for polymorphisms at tumor necrosis factor, interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist gene loci in the regulation of disease severity in acute pancreatitis// Surgery. — 2001. — vol. 129, № 5. — Р. 633 - 640
13. Sargen K, Demaine AG, Kingsnorth AN. Cytokine gene polymorphisms in acute pancreatitis. J. Pancreas. — 2000. — vol. 1, № 2. — Р. 24 - 35
14. Медицинская библиотека: www.medbibl.ru
15. Hulkkonen J. Inflammatory cytokines and cytokine gene polymorphisms in chronic lymphocytic leukaemia, in primary Sjogren's syndrome and in healthy subjects. — Tampere University Press, 2002.
16. Полоников А. В., Иванов В. П., Солодилова М. А. и др. Влияние трех точковых мутаций в промоторе гена TNF-a на клинические проявления и осложнения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2009. — № 1. — С. 8 -11.
17. Азимова С. Б. Генетический полиморфзм TNF-альфа и заболевания печени // Медицинский вестник: российская врачебная газета. — 2013. — № 12 (26 апреля). — С. 14
18. Malleo G., Mazzon E., Siriwardena A. K. et al. Role of tumor necrosis factor- [alpha] in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence //Shock. — 2007. — vol. 28, № 2. — P. 130 -140.
