CC BY
13Связь морфологического параметра с основными характеристиками роста популяции микроорганизмов
Арзамасцев А.А. (arz sci@mail.ru) (1), Слетков Д.В. (1), Исаева И.В. (1) (1) Тамбовский государственный университет, Тамбов, ул. Интернациональная, 33
Зарождение фрактальной геометрии связано с трудами Пуанкаре, Фату, Жюлиа, Кантора, Хаусдорфа и Мандельброта [1]. В настоящее время ее использование позволило сделать существенные шаги, связанные с компьютерным представлением форм, структур поверхностей, анимацией и др. [1,2,4]. Фрактальная геометрия используется для объяснения формообразования различных объектов в биологии, минералогии, физике твердого тела [3].
При работе с биологическими объектами часто требуется поставить в соответствие изображению такого объекта некоторое числовое значение. Подобная проблема имеет место, например, при управлении процессом культивирования микроорганизмов, когда по изображению популяции в поле микроскопа необходимо сделать выводы о ее морфологическом и физиологическом состояниях или при наблюдении за ростом и изменением формы у макрообъектов, таких как мхи, кустарники, кроны деревьев и т.д. Удобным математическим аппаратом для решения данной проблемы является подсчет фрактальной размерности изображений. Однако результат таких вычислений не во всех случаях совпадает с фрактальной размерностью реального объекта, поэтому в данной работе мы будем использовать название «морфологический параметр». На возможность использования подобного подхода при наблюдении за микроорганизмами указано в статьях [5,6].
Целью данной работы явилось определение зависимости между морфологическим параметром изображений популяции дрожжей Saccharomyces cere-visiae и основными показателями, наблюдаемыми в процессе их роста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования выбраны дрожжи Saccharomyces cerevisiae. По культуральным и морфологическим признакам используемые микроорганизмы относятся к семейству Endomycetaceae.
В качестве питательной среды для роста микроорганизмов выбрано ме-лассное сусло, которое готовили следующим образом. Мелассу разводили в воде до концентрации сухих веществ 16-17%, добавляли по 5 мл Н3РО4 и HCl до рН = 4.8 на 10 л среды. Хорошо перемешивали, разливали в колбы объемом 5 л, стерилизовали в автоклаве 20 мин при 2 атм. Такая среда часто используется в микробиологической промышленности для производства дрожжей из отходов этанола. Засев дрожжей производили при температуре 30 °С.
В ходе эксперимента наблюдение вели за следующими показателями процесса: концентрациями клеток микроорганизмов, сухих веществ питательной среды, этанола и объемом двуокиси углерода, выделяемой культурой за некоторый промежуток времени («10 мин). По ним рассчитывали физиологические показатели: скорости роста биомассы, потребления субстратов, выделения метаболитов и дыхания.
Концентрацию клеток оценивали с помощью подсчета количества клеток в камере Горяева (глубина 0,1 мм; площади малой и большой ячейки 1/400 и 1/25 мм соответственно) [7]. Число клеток рассчитывали по формуле: N = a-5-10-b-1000 , где N - количество клеток в 1 мл; a - количество клеток, подсчитанных в 5-16 = 80 малых квадратах; 5 - коэффициент пересчета на 1 мм ; 10 -
3
коэффициент пересчета на 1 мм (при глубине камеры в 0,1 мм); b - число, выражающее, во сколько раз разведена проба (обычно использовали разведение в 10 раз); 1000 - коэффициент перевода в см или в мл.
Определение содержания сухих веществ по плотности проводили ареометром при температуре 20 °С. Содержание спирта в бражке определяли методом перегонки, с измерением концентрации спирта спиртометром при температуре 20 °С. Объем выделившегося углекислого газа в результате брожения определяли методом вытеснения. Измерения производили через часовые интервалы в течение 10 часов. Скорость продукции углекислого газа вычисляли по формуле: Q = Vg / (Vs • t) , где Q - скорость продукции углекислого газа; Vg -объем выделившегося газа; Vs - объем мелассно - дрожжевого сусла; t - время измерения.
Технология получения и обработки изображений заключалась в следующем. Фотографирование объекта производили через оптический микроскоп (увеличение 140-150) с дополнительным набором фотографических колец один раз в час.
Полученные цветные фотографии сначала преобразовывали в монохромный формат, устраняли дефекты освещенности, контрастировали и выделяли контур. Для обработки использовали программу Adobe Photoshop.
Расчет морфологического параметра размерности изображений (D) проводили по точечному методу [8, 9] с минимальным размером покрытия (LMin) равным 3 и максимальным размером покрытия (LMax) равным 51. Алгоритм реализован в виде программы, которая позволяет производить расчет D для монохромных изображений (формат *.BMP) [10]. Программа работает с изображениями любого разрешения. Время расчета морфологического параметра зависит от размера холста, сложности изображения, производительности компьютера и занимает обычно 5-10 с. Данный параметр коррелирует с морфологическими характеристиками биологических объектов, что дает право использовать его в дальнейшем анализе подобных систем [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показано типичное изображение популяции дрожжей Saccharo-myces cerevisiae полученное непосредственно с микроскопа (рис. 1, a) и после
его обработки в программе Adobe Photoshop (рис. 1, b). Видно, что изображение, полученное с микроскопа, нуждается в коррекции освещенности, удалении дефектов съемки и контрастировании. Эти операции в той или иной степени должны быть применены ко всем снимкам, полученным в ходе экспериментов. Методика обработки изображений была адаптирована с помощью настройки различных фильтров таким образом, что это обеспечивало наименьшее искажение морфологических характеристик объекта.
Рис. 1. Популяция дрожжей: (а) - первичное изображение; (Ь)- изображение, полученное в результате обработки. Увеличение х 150.
a) b) c)
Рис. 2. Внешний вид популяции дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращиваемых на мелассном сусле: (a) - через час после начала эксперимента, (b) - через 8 часов, (с) - через 12 часов после начала эксперимента. Увеличение х 140.
Поскольку в работе использовали монохромное представление изображений, окончательная обработка каждого снимка заключалась в выделении контура (рис. 1, Ь). Из рис. 1 видно, что в процессе обработки морфологические характеристики (количество, взаимное расположение клеток, их размеры) остаются практически неизменными, что позволило использовать технологию для определения морфологического параметра в дальнейших экспериментах.
N х 10', кл/мл
10 1 ч
Э, % масс.
Р, % масс.
гсо^,мл/(мл-мин)
0,28 -0,23 -0,18 -0,13 -0,08 -0,03
е)
о
\о
\
о
0
10 1, Ч
Рис. 3. Изменение основных показателей в процессе роста дрожжей: a) - концентрация клеток; Ь) - морфологический параметр изображений; с) - концентрация сухих веществ питательной среды; d) - концентрация этанола; е) - скорость продукции С02.
Предварительное тестирование методики определения морфологического параметра проводили с использованием микроорганизмов и техники съемки, описанной выше.
На рис. 2 показано изменение плотности популяции и ее морфологических характеристик в процессе культивирования. Видно, что в начальных стадиях популяция в основном состоит из одиночных и двойных почкующихся клеток (рис. 2, a), в дальнейшем наблюдается увеличение количества клеток и образование больших клеточных блоков (рис. 2, Ь,с).
Рис. 4. Изменение основных физиологических показателей в процессе роста дрожжей. a) - скорость роста биомассы (кл/(мл-ч)); Ь) - скорость потребления субстратов (% масс/ч); с) - скорость выделения метаболитов (% масс/ч).
В ходе эксперимента наблюдение вели за следующими показателями процесса: концентрациями клеток микроорганизмов, сухих веществ питательной среды, этанола и объемом двуокиси углерода, выделяемой культурой за промежуток времени (10 мин) (рис. 3). По ним рассчитывали физиологические показатели: скорости роста биомассы, потребления субстратов, выделения метаболитов и дыхания. На рис. 4 приведены графики временных зависимостей
этих показателей, которые хорошо коррелируют с морфологическим параметром изображений (рис. 3. Ь; рис. 4). Коэффициент корреляции во всех случаях более 0,8.
Рис. 5. Графики зависимостей морфологического параметра изображений от основных показателей, наблюдаемых в процессе роста дрожжей: a) - от концентрации клеток; Ь) - скорости выделения С02; с) - концентрации сухих веществ питательной среды; d) - концентрации этанола.
На рис. 5 показаны графики зависимостей морфологического параметра от основных показателей, наблюдаемых в процессе культивирования дрожжей. Значения коэффициентов корреляции с морфологическим параметром изображений в этом случае составляет от 0,7 до 0,9.
Существование подобных зависимостей имеет значительную практическую ценность, так как некоторые физиологические характеристики популяции (концентрация клеток и связанные с ней скорости роста биомассы, потребления субстратов, дыхания и выделения метаболитов; распределение клеток по раз-
мерам и связанный с этим показателем средний биологический возраст культуры) можно вычислить из анализа их изображений.
Поскольку подсчет морфологического параметра размерности цифрового изображения занимает незначительное время, такой способ позволяет использовать указанную технологию для управления процессами культивирования микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mandelbrot B.B. The Fractal Geometry of Nature. San Francisco: Freeman, 1982.
2. Пайтген Х.-О., Рихтер П.Х. Красота фракталов. Образы комплексных динамических систем: Пер. с англ. М.: Мир, 1993.
3. Фракталы и прикладная синергетика / Тез. докл. Первого междисциплинарного семинара. М: 1999.
4. Федер Е. Фракталы. М.: Мир, 1991.
5. Гудакова Г.З., Божокин С.В. Диагностика состояния дрожжей по измерению фрактальной симметрии структур газоразрядного свечения воздуха, образующихся при воздействии высокого напряжения на жидкофазный биологический объект. // Биофизика. - 1991, Вып. 2. - С. 298-303.
6. Божокин С.В. Математическая модель морфологического строения грибов. // Биофизика. - 1996, Вып. 6. - С. 1298-1300.
7. Инструкция по технологическому контролю спиртового производства. М.: Пищевая промышленность, 1967.
8. Voss R.F. Random Fractals: Characterization and Measurement, Scaling Phenomena in Disordered Systems. New York: Plenum Press. 1985.
9. Кроновер Р.М. Фракталы и хаос в динамических системах. Основы теории. М.: Постмаркет, 2000.
10. Слетков Д.В., Арзамасцев А. А. Сравнение различных алгоритмов вычисления фрактальной размерности. // Вестник Тамбовского Университета. Сер. Естественные и технические науки. - 2003, Т| 8, Вып. 2. - С. 282-285.
