CC BY
9
УДК 547.565+543.632.585+544.777
Е. В. Гусева, А. Р. Кутлахметова, Т. В. Сахно
СВОЙСТВА Р-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ КАЛИКС[4]РЕЗОРЦИНОВ. ЧАСТЬ 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ Р-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ КАЛИКС[4]РЕЗОРЦИНОВ НА ПРОЦЕСС БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ КУЛЬТУРОЙ
DESULFOBACTER
Ключевые слова: биодеградация, Desulfobacter, бактерицидные свойства, точка ККМ (критическая концентрация мицелло-
образования).
Изучены процессы деградации нефти сульфатвосстанавливающими бактериями Desulfobacter, выделенными из Ромашкинского месторождения Республики Татарстан в присутствии Р-функционализированных ка-ликс[4]резорцинов. Показано влияние структурных особенностей каликс[4]резорцинов на процессы биодеградации нефти и роста микроорганизмов при варьировании концентраций этих веществ от 0,01г/л до 0,3 г/л. Выявлено, что Р-функционализированные каликс[4]резорцины до точки ККМ проявляют ингибирующие свойства на процессы роста микроорганизмов и биодеградации нефти; после точки ККМ эти вещества интенсифицируют данные процессы.
Keywords: biodegradation, Desulfobacter, bactericidal properties, CCM point (critical concentration of micelle formation).
Oil degradation by sulfate reducing bacteria isolated from Romashkinskii oil deposit of Tatarstan Republic in the presence of P-functionalized calix[4]resorcines has been studied. An influence of structural features of calix[4]resorcines on the process of oil biodegradation and on the growth of microorganisms at concentration from 0,01g/l to 0,3 g/l has been shown. It was revealed that P-functionalized calix[4]resorcines inhibit oil biodegradation and microorganisms growth up to CCM point (critical concentration of micelle formation), while after CCM point those substances seem to intensify both oil biodegradation and the growth of microorganisms.
Введение
Рост добычи нефти, объемов ее переработки и транспортировки сопровождается увеличением объемов нефтезагрязнений. Общее число образуемого ежегодно нефтешлама на предприятиях нефтяной отрасли России составляет около 500 тыс. тонн; ресурсы этих отходов, находящихся в земляных амбарах, оцениваются в 4,5 млн. тонн. Проблема утилизации или ликвидации нефтесодержащих отходов является сложной технической задачей. Однако технические средства не способны в полной мере обеспечить очистку загрязненных объектов. Наиболее перспективными на настоящий момент являются биотехнологические методы, основанные на способности микроорганизмов использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника энергии. Однако естественная скорость микробиологического разрушения нефти в воде и почве достаточно низкая и поэтому процесс требует большого времени. С целью уменьшения влияния лимитирующих факторов на рост и продуктивность микроорганизмов применяют различные стимулирующие вещества [1]. Перспективными в этом отношении могут быть фосфорсодержащие ка-ликс[4]резорцины, поскольку вещества данного класса обладают рядом ценных свойств, в частности, свойствами ПАВ, что может способствовать их широкому использованию [2, 3].
Исследования по изучению агрегационных свойств каликс[4]резорцинов (1), (2) [4]:
1 2
приведенные в первой части данной статьи, показали их способность проявлять свойства ПАВ в специально подобранных модельных системах следующего состава: «20% изооктан - 30% ДМСО -50% воды» и «водонефтяная эмульсия + культура БезиНЪЬаСег». Первая система была подобрана, чтобы смоделировать аналог углеводородов, которые в большем количестве находятся в нефти.
С целью исследования влияния концентраций и структурных особенностей Р-функционализированных каликс[4]резорцинов
(1), (2) на процессы деградации нефти культурой БеБи^оЬайег изучена кинетика роста микроорганизмов и кинетика потребления нефти микроорганизмами в присутствии и отсутствии добавок веществ. Также выявлены области концентрационных добавок соединений (1), (2), в которых они ведут себя как ингибиторы или инициаторы биоразложения нефти.
Экспериментальная часть
Объектами исследования являлись Р-функционализированные каликс[4]резорцины (1)
(2). Образцы Р-функционализированных ка-ликс[4]резорцинов синтезированы и предоставлены для исследований д.х.н. проф. Е.Л. Гавриловой и к.х.н. А.А. Наумовой.
Для изучения кинетики биодеградации нефти брали отстоявшуюся водонефтяную эмульсию в количестве 250 мл, отобранную из Ромашкинского месторождения Республики Татарстан. После отстаивания водонефтяная эмульсия разделилась на 125 мл нефти в верхнем слое и 125 мл воды в нижнем слое (процент обводненности нефти составил ~ 50%). В процессах изучения биодеградации нефти использовались сульфатвосстанавливающие бактерии рода БезиНоЬайег, выделенные из Ромашкин-ского месторождения РТ.
Водонефтяная эмульсия содержала 7 г/л №С!, 1 г/л МдС12*6Н20, 4 г/л Рв2+. Оптимальный диапазон роста культуры: рН 6,5 - 7,4, температура 20-330С.
Для каждого из соединений (1), (2) изучалась серия концентраций в области с = 0,01 г/л - 0,3 г/л. В каждый опыт вносили культуральную среду БезиНоЬайег в объёме 10% от объёма водонефтяной эмульсии. В контрольном опыте в питательную среду вносилили 10% культуральной среды с СВБ ВеБиЦоЬайег. В следующих опытах в питательную среду с 10% культуральной средой с СВБ ВеБиЦоЬайег вносили соединения (1) и (2) в концентрациях от 0,01 г/л до 0,3 г/л. Наблюдения вели в течение 12 месяцев. Для оценки влияния данных соединений на рост культуры БезиНЬЬайег определяли концентрацию биомассы в среде по оптической плотности с пересчетом на вес абсолютно сухой биомассы (АСБ) по калибровочному графику [5]
О деструктивной способности микроорганизмов судили по остаточному объему нефти в среде.
Результаты и обсуждения
Увеличение концентрации соединения (1) в интервалах от 0,01 г/л до 0,06 г/л (до точки ККМ) приводит к ингибированию скорости роста микроорганизмов от 20% до 51% (рис. 1), что в свою очередь продлевает лаг-фазу культуры Ве8иНоЪас1ег, например, при с-|=0,06 г/л от 3-х до 4,5 месяцев. Лог-фаза роста культуры (рис. 1) в присутствии соединения (1) при с-|= 0,01 г/л - 0,06 г/л до точки ККМ наступает позже и протекает быстрее по сравнению с контрольным опытом. В частности, при с = 0,06 г/л лог-фаза приходится на 7,5 месяца, в контрольном опыте на 6,5 месяц. В контрольном опыте стационарная фаза приходится на 12-ый месяц и концентрация биомассы при этом достигает 25 г/л. В присутствии соединения (1) с увеличением концентрации до точки ККМ от 0,01 г/л до 0,06 г/л микроорганизмы выходят на стационарную фазу роста, начиная с 12-го месяца. Достигается максимум роста биомассы при этом от 20,25 г/л до 12,25 г/л соответственно.
Увеличение концентрации соединения (2) в интервалах от 0,01 г/л до 0,06 г/л (до точки ККМ) приводит к более интенсивному ингибированию скорости роста микроорганизмов от 50% до 95% (рис. 2), пролонгируя лаг-фазу культуры БезиНоЬайег (в частности при ^=0,06 г/л лаг фаза увеличивается от 3-х до 6,5 месяцев). Лог-фаза роста культуры в присутствии соединения (2) при с2= 0,01
г/л - 0,2 г/л до точки ККМ наступает позже и протекает быстрее по сравнению с опытами, содержащими соединение (1) и с контрольным опытом. В частности, при с2 = 0,06 г/л лог-фаза приходится на 8,8 месяца, в контрольном опыте на 6,5 месяца, а в опыте с соединением (1) на 7,5 месяца. Рост биомассы в присутствии соединения (2) достигает максимума через 12 месяцев и составляет с увеличением концентрации соединения (2) от 0,01 г/л до 0,2 г/л -12,5 г/л до 1,25 г/л соответственно. В частности при концентрации соединения (2) с2 = 0,06 г/л прирост культуры Ве8иНоЪас1ег достигает 2,5 г/л, что в 10 раз меньше по сравнению с контролем и в 4,9 раз меньше по сравнению с опытом, содержащим соединение (1).
Интенсификация процесса роста микроорганизмов по сравнению с контролем наблюдается при увеличении концентрации соединений (1) и (2) и после точки ККМ. Так, в частности соединение (2) интенсифицирует рост клеток при с2=0,3 г/л, а соединение (1) с увеличением концентрации от 0,1 г/л до 0,3/л.
*КОНТрО ЛЬ
0,3 г/л
• 0,23 г/л
-0,2 г/л
■0,17 г/л
0,14 г/л
-0,12 г/л
0,1 г/л
■0,08 г/л
-0,06 г/л
0,043 г/л
0,02 г/л
Рис. 1 - Кривые роста культуры Ве8иН"оЬас1ег в присутствии соединения (1) при варьировании концентраций от 0,01 г/л до 0,3 г/л по сравнению с контролем
Рис. 2 - Кривые роста культуры Ве«иН"оЬас1ег в присутствии соединения (2) при варьировании концентраций от 0,01 г/л до 0,3 г/л по сравнению с контролем
Введение соединений (1) и (2) в концентрации 0,3 г/л увеличивают скорость роста и сокращают лаг фазу роста культуры Desulfobacter. Так, в частности, присутствие соединения (1) с с-|=0,3 г/л интенсифицирует рост клеток с первого месяца; соединение (2) при с2=0,3 г/л интенсифицирует рост с 2,8 месяца. В контрольном опыте экспоненциальная фаза начинается лишь через 3 месяца и длится 2 месяца.
Лог-фаза роста культуры с увеличением концентрации соединений (1) и (2) после точки ККМ наступает быстрее и длится дольше по сравнению с контрольным опытом. В частности, при с| = 0,3 г/л лог-фаза приходится на 4,8 месяца, в контрольном опыте на 6,5 месяц, при с2=0,3 г/л на 6 месяц. В контрольном опыте стационарная фаза приходится на 12 месяц, и концентрация биомассы достигает 25 г/л.
Микроорганизмы в присутствии соединения (1) с увеличением его концентрации после точки ККМ от 0,1 г/л до 0,3 г/л выходят на стационар раньше, начиная с 9 месяца. Через 10 месяцев достигается максимум роста биомассы от 29,5 г/л до 43,25 г/л. Это по сравнению с контрольным опытом выше на 18% и 72% соответственно.
Соединение (2) при концентрации 0,3 г/л после точки ККМ сокращает выход роста на стационарную фазу по сравнению с контролем на 0,5 месяца, достигая максимума роста культуры 27,75 г/л на 11,5 месяц, что на 11% выше по сравнению с контролем.
Найдено, что для соединения (1) точка ККМ наблюдается при его концентрации 0,08 г/л, для соединения (2) - 0,25 г/л. В этих точках кривые кинетики роста культуры (рис. 1, 2) показывают, что увеличение концентраций соединений (1) и (2) до точки ККМ ингибирует рост культуры Desulfobacter. С увеличением концентрации соединений (1) и (2) после точек ККМ наблюдается интенсификация роста микробных клеток.
Так, соединение (1) при концентрации 0,3 г/л увеличивает скорость роста микроорганизмов в 1,73 раза, а соединение (2) при этой концентрации в 1,11 раза. Наибольшими интенсифицирующими свойствами обладает соединение (1) при Ci=0,3 г/л, где рост клеток интенсивнее по сравнению с контрольным опытом на 72%.
Соединение (2) по сравнению с соединением (1) при с2=0,2 г/л проявляет сильное ингиби-рующие влияние и подавляет рост микроорганизмов на 95% по сравнению с контролем.
Биодеградацию нефти в присутствии соединений (1) и (2) определяли по потреблению нефти культурой СВБ Desulfobacter в водонефтяной эмульсии. Потребление нефти определяли по остаточной концентрации нефти в среде. По убыли количества нефти судили о деструктивной способности микроорганизмов (рис. 3, 4).
Исследования показали, что соединения (1) и (2) с увеличением концентрации до точки ККМ ингибируют процессы биоразложения нефти культурой Desulfobacter, а после точки ККМ интенсифицируют процесс биодеградации нефти.
Так при концентрации 0,045 г/л у соединения (1) ингибирующие свойства в 4,75 раз ниже, чем у соединения (2). Наибольшая интенсификация наблюдается при введении соединения (1) с концентрацией 0,3 г/л, потребление нефти культурой Desulfobacter за год составило 63,6 мл из 125 мл возможных, что по сравнению с контролем на 72% больше. Наибольшие ингибирующие свойства проявляет соединение (2) с концентрацией 0,2 г/л в зоне до точки ККМ, потребление за год составило лишь 1,8 мл, что на 95% меньше по сравнению с контролем.
» кситгрсшь
0,3 г/л •0,25 г/л • 0,2 г/л
0,17 г/л 0,14 г/л '0,12 г/л 0,1 г/л 0,0S г/л »0,06 г/л 0,045 г/л 0,02 г/л 0,01 г/л
Бр
6 8 10 12 емя, месяц
Рис. 3 - Кривые потребления нефти культурой Desulfobacter с увеличение концентрации соединения (1) от 0,01 г/л до 0,3 г/л по сравнению с контролем
Рис. 4 - Кривые потребления нефти культурой Desulfobacter с увеличение концентрации соединения (2) от 0,01 г/л до 0,3 г/л по сравнению с контролем
Ингибирующие и интенсифицирующие свойства соединений (1), (2) можно объяснить структурными и химическими особенностями Р-функционализированных каликс[4]резорцинов: наличием гидрофобной каликсрезорциновой матрицы и гидрофильными фосфорсодержащими функциональными группировками на нижнем ободе.
OH
иго
CH
Более сильное ингибирующие влияние на рост микроорганизмов оказывает группировка соединения (2), которая за счет локализации положительного заряда на атоме фосфора превращает соединение (2) в катион-активное ПАВ, связывающее отрицательный заряд микроорганизмов [6] и тем самым оказывая ингибирующие влияние на рост этих клеток:
0С2Н5 0С2Н5
дающую роль играет поверхностный фактор контакта нефти, питательной среды и микроорганизмов.
Поэтому после точки ККМ с увеличением концентрации в присутствии соединения (1) количество эмульсий увеличивается гораздо больше, чем у соединения (2), что приводит к увеличению эффективности биодеградации нефти у соединения (1) при с| =0,3 г/л до 72 %, в то время как у соединения (2) только до 11%.
Наибольший эффект торможения биодеградации нефти с увеличением концентраций от 0,01 г/л до 0,2 г/л достигает соединение (2), которое составляет от 50% до 95%.
Для соединения (|) точка ККМ находится в зоне более низких концентраций (ККМ=0,08 г/л=0.052*10-3 моль/л), чем у соединения (2) (ККМ=0,25 г/л=0,184*10-3 моль/л). При концентрации 0,045 г/л эффект торможения у соединения (1) гораздо меньше (48 %), чем у соединения (2) - 89%.
Заключение
Таким образом, перечисленные выше свойства Р- функционализированных ка-ликс[4]резорцинов (1) и (2) дают возможность использовать соединение (23 в зоне низких концентраций до 0,25 г/л (0,184*10- моль/л) в широких пределах как ингибитор биодеградации нефти. Соединение (1) в зоне низких концентраций (от 0,08 г/л = 0,052*10-3 моль/л) можно использовать для интенсификации процесса биоразложения нефти. Подобные свойства делают эти вещества перспективными для применения в микробиологических процессах как очистки от нефтезагрязнений, так и предотвращения микробиологического разложения нефти при добыче, транспортировке и переработки нефти.
Ингибирующие свойства соединения (1) намного уменьшены по сравнению с соединением (2) за счет сопряжения неподеленной электронной пары (НЭП) атома фосфора с п- связями арильных группировок фенольной центральной части молекулы, что в свою очередь уменьшает ингибирующие свойства на рост микроорганизмов группировки -P(Ph)2
^^ Ph+
Таким образом, в зоне до точки ККМ у соединения (1) ингибирующие свойства слабо выражены, а у соединения (2) сильно. Другим фактором подобных свойств в зоне до точки ККМ является также и то, что увеличение ингибирующих свойств веществ с увеличением концентрации усиливается за счет увеличения количества фосфорсодержащих антиоксидантных группировок.
После точки ККМ с увеличением концентрации вещества будут усиливаться процессы агрегирования молекул. В соединение (2) этот процесс усиливается за счет образования водородных связей групп P=O...H, что в свою очередь усиливает процесс образования мицелл. В результате увеличивается поверхность контакта нефти, питательной среды и клеток микроорганизмов, что приводит к биодеградации нефти.
Немаловажное значение имеет и конформа-ционные особенности строения соединений (1) и (2). Соединение (2) находится в конформации «конус», при которой идет четкое разделение верхней гидрофобной части и нижней гидрофильной. За счет такой конфигурации соединения (2) мицеллообразо-вание происходит в зоне высоких концентраций. Поэтому данное соединение обладает более ингиби-рующими свойствами, чем соединение (1).
Соединение (1) находится в конформации «кресло», которое слабо влияет на образование мицелл и эмульсий. У данного соединения преобла-
© Е. В. Гусева - канд. хим. наук, доцент каф. неорганической химии, КНИТУ, [email protected]; А. Р. Кутлахметова - аспирант каф. неорганической химии, КНИТУ, [email protected]; Т. В. Сахно - директор, «Экологический консорциум», [email protected].
© E. V. Guseva - PhD (Chemistry), Associate Professor at the Department of Inorganic Chemistry, KNRTU, [email protected]; A. R. Kutlahmetova - PhD Student at the Department of Inorganic Chemistry, KNRTU, [email protected]; T. V. Sachno - Director, "Environmental Consortium», [email protected].
Литература
1. T.V Sakhno. I International Conference on Remediation of Soil, Sediment and Groundwater: Biological, Chemical and Physical Treatments (RSSG-1), (San Diego, California, USA, September 22-25. 2008). Abstacts. San Diego, California, 2008. P. 18
2. Е.В. Гусева, А.В. Потапова, А.М. Сайфутдинов, Е.И. Гришин, Вестник Казан. технол. ун-та, 2011, 14, 6, 1623.
3. Е.В. Гусева, А.В. Потапова, А.М. Сайфутдинов, Е.И. Гришин, Вестник Казан. технол. ун-та, 2011, 14, 6, 290-296.
4. E.L. Gavrilova, A.A. Naumova, N.I. Shatalova, A.R. Burilov, M.A. Pudovik, E.A. Krasilnikova, A.I. Konovalov, Phosphorus, Sulfur, Silicon, Relat. Elem, 2008, 183, 561-565.
5. А.М. Мухаметшина. Дисс. канд. хим. наук, Каз. гос. технол. ун-т, Казань, 2008. 150 с.
