CC BY
103
УДК 57.085.2
СВОЙСТВА ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК НЕРВНОЙ ТКАНИ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫС В КУЛЬТУРЕ
1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины,
Харьков
2Харьковский национальный педагогический университет им. Г. С. Сковороды, Украина
E-mail: an_sukach@yahoo.co.uk
Получено 10.10.2012
Показано, что изолированные клетки мозга новорожденных крыс являются гетерогенной суспензией, в состав которой наряду с окончательно дифференцированными входят стволовые и прогени-торные клетки, способные пролиферировать и дифференцироваться в условиях культивирования in vitro. В процессе культивирования в присутствии сыворотки крови нервные клетки новорожденных крыс формируют агрегаты, в которых воссоздается утерянное при их выделении клеточное микроокружение и происходит восстановление клеток. После прикрепления к подложке клетки агрегатов мигрируют и распластываются, формируя монослой астроглии, на котором образуются нейробласты и колонии стволовых/прогениторных клеток. Полученные данные указывают на то, что культуру нервных клеток новорожденных крыс можно использовать в качестве модели постнатальной нервной ткани для исследования влияния клеточного окружения на процессы развития и восстановления дифференцированных нервных клеток, а также на пролиферацию и дифференциацию стволовых/прогениторных клеток.
Ключевые слова: дифференцированные нервные клетки, нервные стволовые/прогениторные
клетки, новорожденные крысы, жизнеспособность, выживание, культивирование, многоклеточные агрегаты.
А. Н. Сукач1, 2 Т. Д. Ляшенко2 М. В. Шевченко2
Исследование нервных стволовых/ про-гениторных клеток человека и животных имеет большое значение для выяснения особенностей развития нервной системы и возникновения нейродегенеративных заболеваний, а также разработки новых терапевтических подходов для их лечения. В настоящее время развитие нервной системы человека и животных в процессе эмбриогенеза достаточно хорошо изучено. При этом поведение нервных предшественников в процессе нейро- и глиогенеза в постнатальном и взрослом мозге во многом остается не изученным. Не вполне объяснимо также влияние клеточного микроокружения на пролиферацию и дифференциацию нервных стволовых/прогениторных клеток в постна-тальном мозге. В качестве модели для изучения постнатального нейрогенеза, глиогенеза и их взаимосвязи, развития апоптоза клеток, возможного нейрогенного репарационного ответа клеток мозга при различных повреждениях мозга, механизмов нервного дифференцирования, экспрессии генов, а также влияния сигналов микроокруже-
ния, регулирующих фенотипическую специализацию в нервных тканях млекопитающих, могут быть использованы культуры клеток, изолированных из нервных тканей новорожденных лабораторных животных. В связи с этим актуальной является разработка способов получения нервных клеток новорожденных крыс, их характеристика и выяснение особенностей поведения в культуре in vitro.
Материалы и методы
Нервные клетки (НК) выделяли из тканей головного мозга новорожденных крыс. Для этого ткань, предварительно измельченную ножницами, инкубировали 5 мин в 0,5% -м растворе трипсина при 37 °С, затем механически дезагрегировали на единичные клетки с использованием вибрации [1]. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр, после чего отмывали от трипсина центрифугированием при 1500 об/мин. Жизнеспособность клеток оценивали по окрашиванию витальным красителем
трипановым синим (0,4%; Sigma, США) и выражали в процентах [2]. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева, размер НК определяли при помощи программы Axio Vision.
Клетки культивировали в 24-луночных планшетах (Corning, США) в среде DMEM/F12 (Sigma), обогащенной 0,6% глюкозы, 2 mM глутамина, 3 мМ бикарбоната натрия. В среду добавляли 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при 37 °С в атмосфере 5% CO2, 95% воздуха. Половину объема среды культивирования заменяли на свежую порцию каждые 4-5 суток.
Иммуноцитохимические исследования клеточных культур осуществляли после их предварительной фиксации в растворе 4% -го параформальдегида. Фиксированные клетки пермеабилизировали абсолютным спиртом, блокировали 5%-й сывороткой козы (Sigma) и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при +4 °С. Затем клетки промывали и культивировали с вторичными антителами 40 мин. В качестве первичных антител были использованы P-Tubulin III (mouse, Sigma), GFAP (mouse, Abcam, Великобритания), Nestin (mouse, Abcam), Vimentin (rabbit, Abcam). Вторичными антителами служили IgG, конъюгированный с FITC (Sigma, США), Chromeo 546 (Abcam) и Chromeo 488 (Abcam). Ядра клеток окрашивали красителем Hoechst 33342 (Sigma).
Микрофотосъемку культур клеток производили на микроскопе Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).
Результаты обрабатывали статистически по методу Стьюдента с использованием программы MS Excel.
Эксперименты были проведены в соответствии с «Общими принципами экспериментов на животных», одобренными III конгрессом по биоэтике (Киев, 20.09.07) и согласованными с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1985).
Результаты и обсуждение
Жизнеспособность свежевыделенных клеток мозга новорожденных крыс, определенная по окрашиванию витальным красителем трипановым синим, составляла в среднем 20-70%.
Полученные клетки были округлой формы с четко очерченной мембраной. Размер их колебался от 6 до 16 мкм (рис. 1, А).
Свежевыделенные НК высевали в концентрации 1, 2, 4, 6 и 8 млн/мл в 24-луноч-ные планшеты и культивировали в среде DMEM/F12 в присутствии и при отсутствии 10% -й сыворотки крови крыс. В присутствии сыворотки уже в первые часы культивирования наблюдалось формирование плавающих многоклеточных агрегатов (рис. 1, Б), количество, структура и размеры которых зависели от концентрации и жизнеспособности высеянных клеток. В случае культивирования НК в концентрации 1 млн/мл формировалось небольшое количество мелких агрегатов. Культивирование клеток в концентрациях 6 и 8 млн/мл сопровождалось образованием агрегатов большого размера, которые активно сливались друг с другом. При этом плотность суспензии агрегатов была очень высокой, что затрудняло наблюдение за ними. Происходило также быстрое закисление среды культивирования. При культивировании НК в концентрации 2 и 4 млн/мл наблюдалось образование агрегатов, размер которых составлял в среднем 100 мкм (рис. 1, Б). Как правило, сформированные агрегаты имели неправильную форму и рыхлую структуру — клетки в них были упакованы неплотно (рис. 1, Б). При культивировании плавающих агрегатов, образованных клетками с жизнеспособностью выше 20% на протяжении 1-2 сут, упаковка клеток в них становилась более плотной, и они превращались в сфероиды (рис. 1, Б). Количество образовавшихся сфероидов зависело прямо
Рис. 1. Фазово-контрастная микроскопия культуры свежевыделенных НК, высеянных в концентрации 2 млн/мл:
А — НК через 10 мин после посева; Б — формирование плавающих многоклеточных агрегатов; В — образование сфероидов; Г — единичные распластанные клетки с морфологией фибро-бластов (стрелки). Масштаб 50 мкм
пропорционально от исходной жизнеспособности высеянных клеток. Если жизнеспособность НК была ниже 10%, формировалось небольшое количество мелких, рыхлых агрегатов, которые в процессе дальнейшего культивирования не формировали сфероидов и не прикреплялись к подложке. При этом единичные плавающие клетки, не объединившиеся в агрегаты, также не прикреплялись к подложке и при дальнейшем культивировании погибали.
В процессе культивирования НК в присутствии сыворотки наблюдалось большое количество единичных клеток, которые не формировали агрегатов. Некоторые из этих клеток прикреплялись к подложке и распластывались (рис. 1, Г). Морфологически они были похожи на астроциты.
При отсутствии в среде культивирования сыворотки крови НК, как правило, не формировали агрегатов, не прикреплялись к подложке и, в конечном итоге, погибали.
Для изучения влияния формируемых агрегатов на жизнеспособность НК и их поведение в культуре использовали клетки с исходной жизнеспособностью 56,2±4,2% (п = 5), которые высевали в концентрации 4 млн/мл. В процессе культивирования около 80% высеянных клеток формировали агрегаты. Через сутки культивирования жизнеспособность клеток в составе агрегатов увеличивалась в 1,5 раза и составляла 87 ±5,4% (п = 5). Часть агрегатов НК уже в первые сутки культивирования прикреплялась к подложке. При этом прикрепление агрегатов значительно активизировалось в случае замены 2/3 части среды или после их пересева. Сразу после прикрепления клетки агрегатов формировали большое количество длинных Р-^Ь^ш Ш-положительных отростков (рис. 2, А). Этими отростками агрегаты соединялись друг с другом и по ним мигрировали недифференцированные клетки (рис. 2, Б).
сГ>'
Рис. 2. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами на р-тубулин III клеток прикрепленного агрегата (А), по отросткам которых мигрируют недифференцированные клетки (Б): масштаб: А — 100 мкм, Б — 50 мкм
Мигрирующие от агрегатов клетки распластывались и образовывали участки монослоя. На 4-6-е сут культивирования на поверхности лунки формировались обширные участки монослоя клеток (рис. 3, А), на которых наблюдалось большое количество Р-тубулин Ш-положительных клеток с морфологией нейронов (рис. 3, Б). Как правило, Р-тубулин III-положительные клетки локализовались в местах прикрепления агрегатов к поверхности лунки (рис 3, Б).
Рис. 3. Формирование клетками прикрепленных агрегатов монослоя (А) и Р-тубулин Ш-положительных клеток с морфологией нейронов (Б):
масштаб 50 мкм
В процессе культивирования количество клеток с морфологией нейронов уменьшалось, с глиальной морфологией — увеличивалось. На 7-9-е сут культивирования Р-тубулин III-положительные клетки с морфологией нейронов практически исчезали, но в то же время на поверхности GFAP-положительного глиального монослоя (рис. 4) появлялись Р-тубулин Ш-положительные клетки, морфологически похожие на нейробласты (рис. 5).
Количество нейробластоподобных клеток в процессе дальнейшего культивирования увеличивалось. На 15-е сут культивирования на монослое клеток глии появлялись колонии недифференцированных Р-тубулин III-положительных клеток (рис. 5), большинство из которых были нестин- и виментин-положительными (рис. 6).
Рис. 4. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток монослоя (А), сформированного НК прикрепленных агрегатов, на маркер астроцитов GFAP (glial fibrillary acidic protein) (Б):
масштаб 50 мкм
Б:
Рис. 5. Образование на монослое глии колоний и единичных нейробластоподобных Р-тубулин Ш-положительных клеток:
А — фазовый контраст; Б — флуоресценция Р-тубулин III. Масштаб 100 мкм
Рис. 6. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры свежевыделенных НК новорожденных крыс после 15 сут культивирования (А) на маркер нервных стволовых клеток нестин (Б) и прогениторных — виментин (В): ядра клеток окрашены красителем Hoechst (Г).
Масштаб 100 мкм
Нейробластоподобные клетки были способны формировать отростки, которые увеличивались в размерах и формировали клеточную сеть (рис. 7, А). Как следует из рис. 7, А, особенно активно процесс образования отростков нейробластоподобными клетками происходил на «голом» пластике. Колонии в процессе культивирования увеличивались в размерах и также формировали между собой контакты с помощью длинных отростков (рис. 7, Б).
Рис. 7. Формирование нейробластоподобными клетками сети (А) и образование контактов между растущими колониями нервных стволовых/прогениторных клеток (Б):
масштаб 50 мкм
Полученные результаты указывают на то, что изолированные из ткани мозга новорожденных крыс клетки представляют собой гетерогенную суспензию, состоящую из нейрональных и глиальных предшественников, а также окончательно дифференцированных и стволовых/прогениторных нервных клеток.
Проведенные исследования показали, что важным свойством свежеизолированных НК новорожденных крыс является формирование ими в процессе культивирования в присутствии сыворотки крови многоклеточных агрегатов.
Почему образуются агрегаты и какова их роль? В процессе выделения у клеток, с одной стороны, могут возникать микроповреждения, а с другой — может происходить потеря молекул адгезии (интегринов и е-кадгерина), что не позволяет клеткам эффективно прикрепляться к подложке при культивировании. Оставшихся молекул адгезии, вероятно, достаточно для образования межклеточных связей, и клетки, стремясь воссоздать утерянное при их выделении клеточное микроокружение, формируют агрегаты. При культивировании в агрегатах может формироваться внеклеточный матрикс, который необходим для обеспечения сигналов выживания изолированных клеток и предотвращает их апоптоз [3-6]. Наряду с этим в процессе культивирования агрегатов, с одной стороны, происходит репарация микроповреждений клеток, на что указывает увеличение их жизнеспособности, а с другой — в НК подобно гепатосфе-рам [7] может происходить накопление е-кадгерина, что является главной причиной морфологического перехода от рыхлого клеточного агрегата к компактному сфероиду.
Таким образом, в процессе культивирования агрегатов происходит репарация микроповреждений клеток и, возможно, восстанавливаются утерянные молекулы адгезии, что позволяет агрегатам прикрепляться к подложке, а их составляющим клеткам мигрировать и распластываться.
Очевидно, в агрегатах создаются условия для поддержания жизнеспособности нейронов, клеток глии, а также стволовых/проге-ниторных клеток, что требует присутствия различных известных или неизвестных, растворимых либо мембранно-связанных факторов роста [8]. На это указывают результаты краткосрочного культивирования агрегатов, в процессе которого вначале наблюдается образование нейронов и клеток астроглии, а затем на монослое, сформированном астроцитами, появляются нейробла-
сты и стволовые/прогениторные клетки. При этом нейробласты и колонии стоволо-вых/прогениторных клеток, как правило, образуются на подложке, сформированной клетками астроглии. Это свидетельствует о том, что клетки глии играют роль фидерного слоя для нервных стволовых/прогенитор-ных клеток, обеспечивая их интактным и функциональным внеклеточным матриксом и связанными с матриксом факторами, а также секретируют регуляторные протеиновые факторы, необходимые для выживания и экспансии. В связи с этим можно предположить, что в данной ситуации клетки глии выполняют функцию ниши для нервных стволовых/прогениторных клеток. Это предположение подтверждается тем, что клетки нейросфер или индуцированных в нейрональном направлении эмбриоидных тел [9, 10] после прикрепления также вначале формируют подложку из нейромезенхи-мальных клеток, на которых позднее появляются нейробласты и нейроны.
Следует также отметить схожесть поведения клеток агрегатов и нейросфер. Как и нейросферы [11], большинство клеток поверхностного слоя агрегатов являются Р-тубулин III-положительными. При этом после прикрепления агрегатов миграция этих клеток предшествует миграции глиальных клеток, что отдаленно напоминает ситуацию в эмбриональном мозге, где нейрогенез предшествует глиогенезу [12]. По отросткам, которые образуют Р-тубулин III-положительные клетки, подобно отросткам клеток радиальной глии, происходит активная миграция недифференцированных клеток. Все это свидетельствует о существовании подобных механизмов функционирования гетерогенных нервных клеток, объединенных в агрегаты с нейросферами, образованными стволовыми клетками.
Проведенные исследования показали, что в процессе культивирования Р-тубулин III-положительные клетки с морфологией нейронов, которые мигрировали от прикрепленных агрегатов сразу после их прикрепления к подложке, исчезали. Возмож-
ЛИТЕРАТУРА
1. Petrenko A. Yu., Sukach A. N. Isolation of intact mitochondria and hepatocytes using vibration // Anal. Biochem. — 1991. — V. 194,N 2.— P. 326-329.
2. Seglen P. O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell Biol. — 1976. V. 13. — P. 29-83.
но, из-за отсутствия соответствующего микроокружения в процессе первых суток культивирования они погибали.
Из представленных данных также следует, что не во всех случаях НК способны восстанавливать свои повреждения. Суспензии НК с низкой жизнеспособностью, очевидно, помимо значительных повреждений плазматической мембраны характеризуются низким количеством молекул адгезии. Поэтому эти клетки формируют агрегаты небольшого размера с очень рыхлой структурой упаковки. К подложке такие агрегаты не прикрепляются и в процессе дальнейшего культивирования деградируют.
Таким образом, НК, изолированные из ткани головного мозга новорожденных крыс представляют собой гетерогенную суспензию, в состав которой входят окончательно дифференцированные и стволовые/прогени-торные клетки, способные пролиферировать и дифференцироваться в нейроны и клетки глии в условиях культивирования in vitro.
В процессе культивирования в присутствии сыворотки крови НК новорожденных крыс формируют агрегаты, структура которых зависит от жизнеспособности, а размер — от жизнеспособности и концентрации посеянных клеток.
Агрегаты выполняют роль микротканей, в которых происходит восстановление повреждений нервных клеток, а также создаются условия для их выживания и функционирования.
Агрегаты НК новорожденных крыс можно использовать в качестве 3-мерной модели постнатальной нервной ткани для исследования влияния клеточного окружения и сигналов микроокружения на процессы развития и восстановления дифференцированных нервных клеток, а также на пролиферацию и дифференциацию нервных стволовых / прогениторных клеток.
Авторы выражают благодарность к. б. н. Коваленко И. Ф. и к. б. н. Холодному И. С. за помощь в проведении микрофотосъемки.
3. Frisch S. M, Ruoslahti E. Integrins and anoikis // Curr. Opin. Cell Biol. — 1997. — V. 9, N 5. — P. 701-706.
4. Frisch S. M, Screaton R. A. Anoikis mechanisms // Ibid. — 2001. — V. 13, N 5. — P. 555-562.
5. Hanahan D, Weinberg R. A. The hallmarks of cancer // Cell. — 2000. — V. 100, N 2. — P. 57-70.
6. Grossmann J. Molecular mechanisms of «detachment-induced apoptosis-anoikis» // Apoptosis. — 2002. — V. 7, N 3. — P. 247-260.
7. Lin R. Z, Chou L. F, Chien C. C., Chang H. Y. Dynamic analysis of hepatoma spheroid formation: roles of E-cadherin and p1-integrin // Cell Tissue Res. — 2006. — V. 324, N 3. — P. 411-422.
8. Zaheer A., Zhong W, Ue E. Y. et al. Expression of mRNAs of multiple growth factors and receptors by astrocytes and glioma cells: detection with reverse transcription-poly-merase chain reaction / / Cell. Mol. Neurobiol. — 1995. — V. 15, N 2. — P. 221-237.
9. Caldwell M. A., He X., Wilkie N. et al. Growth factors regulate the survival and fate of cells
ВЛАСТИВОСТІ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ НОВОНАРОДЖЕНИХ ЩУРІВ У КУЛЬТУРІ
О. М. Сукач1' 2 Т. Д. Ляшенко2 М. В. Шевченко2
1Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків 2Харківський національний педагогічний університет ім. Г. С. Сковороди, Україна
E-mail:an_sukach@yahoo.co.uk
Показано, що ізольовані клітини мозку новонароджених щурів є гетерогенною суспензією, до складу якої крім остаточно диференційованих входять стовбурові та прогеніторні клітини, здатні проліферувати та диференціюватися в умовах культивування in vitro. У процесі культивування в присутності сироватки крові нервові клітини новонароджених щурів формують агрегати, в яких відтворюється втрачене в процесі їх виділення клітинне мікрооточення і відбувається відновлення клітин. Після прикріплення до підкладки клітини агрегатів мігрують і розпластуються, формуючи моношар астроглії, на якому утворюються нейробласти та колонії стовбурових/прогеніторних клітин. Одержані дані вказують на те, що культуру нервових клітин новонароджених щурів можна використовувати як модель постнатальної нервової тканини для дослідження впливу клітинного оточення на процеси розвитку й відновлення диференційованих нервових клітин, а також на проліферацію
і диференціацію стовбурових/прогеніторних клітин.
Ключові слова: диференційовані нервові клітини, нервові стовбурові/прогеніторні клітини, новонароджені щури, життєздатність, виживання, культивування, багатоклітинні агрегати.
derived from human neurospheres // Nat. Bio-technol. — 2001. — V. 19, N 5. — P. 475-480.
10. Bain G., Kitchens D., Yao M. et. al. ECS express neuronal properties in vitro // Dev. Biol. — 1995. — V. 168, N 2. — P. 342-357.
11. Suslov O. N, Kukekov V. G., Ignatova T. N, Steindler D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. — V. 99, N 22. — P. 14506-14511.
12. Qian X., Shen Q., Goderie S. K. et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells // Neuron. — 2000. — V. 28, N 1. — P. 69-80.
PROPERTIES OF ISOLATED NEURAL CELLS FROM NEWBORN RAT IN TISSUE in vitro
A. N. Sukach1, 2 T. D. Liashenko2 M. V. Shevchenko2
institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv
2Skovoroda National Pedagogical University, Kharkiv, Ukraine
E-mail:an_sukach@yahoo.co.uk
It is shown that isolated brain cells of newborn rats are heterogeneous suspension consisted of differentiated cells, stem and progenitor cells, which can proliferate and differentiate in conditions of in vitro cultivation. During cultivation in presence of serum the neural cells of the newborn rats form aggregates, where reconstitution of cellular microenvironment lost in isolation takes place followed by cell reparation. After attachment to a substrate the aggregate cells migrate and spread, form a monolayer of astroglia, which the neuroblasts and colonies of stem/progenitor cells are formed on. The findings show feasible application of newborn rat neural cells as model of postnatal neural tissue for studying the influence of cellular environment on process of development and recovery of differentiated neural cells, as well as proliferation and differentiation of stem/progenitor cells.
Key words: differentiated nervous cells, nervous stem/progenitor cells, new-born rats, viability, survival, cultivation, multicellular aggregates.
