Свойства и филогенетическое положение бактерии Acinetobacter sp. Иб ДТ-5. 1/1 Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.841

СВОЙСТВА И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ БАКТЕРИИ ЛСШЕТОВЛСТЕЯ 8Р. ИБ ДТ-5.1/1

©2013 Т.Ю. Коршунова, С.Р. Мухаматдьярова, О.Н. Логинов

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа Поступила 10.06.2013

Изучены культурально-морфологические, физиолого-биохимические свойства и филогенетическое положение нового штамма АстеТоЬасТег ер. ИБ ДТ-5.1/1, выделенного из серой лесной почвы, загрязненной дизельным топливом. Показана способность бактерии к утилизации нефти, нефтяных углеводородов и других органических веществ различной природы.

Ключевые слоеа\ штамм АЫпеюЬскЛег йр. ПБ ДТ-5.1/1, культуральные и физиолого-биохимические свойства, филогенетическое древо.

В настоящее время нефть и ее производные признаны главными загрязнителями окружающей среды. Это связано с тем, что нефть стала самым используемым источником энергии. Она относительно легко добывается, транспортируется и перерабатывается в широкую гамму продуктов различного назначения. Все технологические процессы в нефтяной промышленности (разведка, бурение, добыча, сбор, транспорт, хранение и переработка) нарушают естественную экологическую обстановку. Сама нефть, ее компоненты, нефтяной и буровой шламы, сточные воды, содержащие различные химические соединения, попадая в почву, вызывают глубокие и часто необратимые изменения физических, морфологических, физико-химических, микробиологических свойств, а иногда и существенную перестройку почвенного профиля, что приводит к потере плодородия и отторжению загрязненных территорий из сельскохозяйственного оборота. Углеводороды нефти способны образовывать в процессе трансформации токсичные соединения, обладающие канцерогенными свойствами и способностью переходить в растения, что значительно снижает качество возделываемых культур и создает определенную угрозу для здоровья человека [1-4]. Нефтепродукты обнаруживаются даже в местах, свободных от хозяйственной деятельности человека (заповедниках, труднодоступных территориях), т.к. транспортируются воздушными и водными потоками [5]. Естественное самоочищение и восстановление почв от нефтяного загрязнения является длительным процессом, продолжающимся от нескольких лет до нескольких десятилетий в зависимости от уровня загрязнения, состава нефти, свойств почвы и т.д. [6]. В связи с этим проблема рекультивации нефтезагрязненных почв стоит весьма остро. Среди всего спектра методов устранения последствий углеводородных загрязнений, биологические справедливо признаны наиболее безвредны-

Коршунова Татьяна Юрьевна, к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail: korshunovaty(S>mail.ru; Мухаматдьярова Светлана Ринатовна, аспирант, e-mail: svetrm(S)gmail.com; Логинов Олег Николаевич, д.б.н., проф., зав. лабораторией, e-mail: biolab316(S)yandex.ru

ными для окружающей среды и экономически целесообразными. Особенно перспективным является метод биоремедиации, основанный на использовании высокоэффективных штаммов нефтеокисляю-щих микроорганизмов, выделенных из загрязненных природных объектов. К его преимуществам кроме экологической и гигиенической безопасности относят низкую себестоимость, возможность целенаправленного применения в нужном месте в нужное время, высокую скорость усвоения и переработки микроорганизмами загрязнителей на безвредные для окружающей среды продукты жизнедеятельности бактерий. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, частично переходит в биомассу клеток, и частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве.

В связи с этим особый интерес представляют исследования, направленные на выделение и отбор наиболее активных углеводородокисляющих микроорганизмов, способных перерабатывать и утилизировать нефть и ее составляющие [7-9]. При кажущейся простоте решения данной задачи возникает ряд трудностей. Во-первых, необходимо выделить технологичные, т.е. пригодные для промышленного использования и безопасные для людей микроорганизмы; во-вторых, подобрать условия их культивирования; в-третьих, правильно выбрать время, метод и дозу внесения биодеструкторов в почву. Кроме того, необходим контроль за интегральной токсичностью почвы для гарантии безопасности продуктов разложения поллютантов и достаточной степени очистки почвы. В настоящее время в России и за рубежом разработано несколько десятков эффективных биопрепаратов-нефтедеструкторов [10-17], действие которых основано на использовании уникальных возможностей углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в их состав. Однако проблема создания новых биопрепаратов продолжает оставаться актуальной. Это связано с невозможностью унифицировать (стандартизировать) биопрепараты для различных объектов окружающей среды, видов нефтяных загрязнений, климатических условий, состава почвы и пр.

1645

Целью работы являлся поиск, выделение из техногенной среды и описание физиолого-биохимических и фенотипических свойств штамма микроорганизмов, его предварительная идентификация и исследование способности к утилизации нефти, нефтяных углеводородов и других классов органических соединений для оценки перспективности использования в качестве основы биопрепа-рата-нефтедеструктора.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Из образцов серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом, методом накопительных культур выделили микроорганизмы, способные использовать дизельное топливо в качестве единственного источника углерода и энергии. Для этого 1 г почвы помещали в колбы (объем 250 мл) со 100 мл жидкой минеральной среды Раймонда [18], куда вносили дизельное топливо в количестве 0,5-1% (по объему). Инкубирование проводили в лабораторном термостатируемом встряхивателе П-5.10-Э5960 при температуре 26-28°С и 160 об/мин в течение 10-14 сут при микроскопическом контроле роста микробного сообщества. Чистые культуры выделяли на агаризованной среде Раймонда, на поверхность которой наносили углеводородный субстрат - 100 мкл стерильного дизельного топлива. Культивирование микроорганизмов на чашках Петри осуществляли при температуре 30°С. Дифференциацию получившихся колоний производили по культурально-морфологическим признакам.

Чистоту выделенных культур проверяли общепринятыми методами - микроскопическим контролем и высевом на агаризованную среду МПА.

Идентифицировали чистые культуры микроорганизмов по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам, используя общепринятые руководства [19-21]. Определение антибиоти-кочувствительности проводили методом серийных разведений в агаре [22].

Выделение тотальной ДНК из колоний бактерий, выросших на твердой среде МПА выполняли с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб» торговой марки «АмплиСенс» (Россия) согласно рекомендациям производителя.

Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК производили с использованием бактериальных прайме-ров: прямого

27F (5'-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3') и обратного

1492R(5' -ACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3').

Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК осуществляли с применением набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Ananlyzer 3500 xl (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирования очищали с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК предварительно анализировали используя пакет программ EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/index.jsp). Далее сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с таковыми типовых штаммов близкородственных видов выполняли с помощью программы CLUS TAL W [23].

Последовательности генов 16S рРНК выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью SINA alignment service (http://www.arb-silva.de/aligner/) [24], согласно рекомендациям [25].

Дендрограммы выстраивали в программе MEGA версии 5 методом «присоединения ближайших соседей» (Neighbor-Joining method) [26] с использованием 2-х параметрической модели Ки-мура [27].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из загрязненной дизельным топливом серой лесной почвы выделено 48 изолятов микроорганизмов. В одном из них штамм ИБ ДТ-5.1/1 по совокупности культурально-морфологических и фи-зиолого-биохимических свойств был идентифицирован как Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1.

Клетки штамма представляют собой неподвижные толстые, короткие палочки, часто встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные формы, иногда в скоплениях, размеры 0,7-1,5 х 0,7-1,0 мкм. Размножаются делением (перетяжка и перегородка).

На плотных питательных средах колонии белые, круглые, плоские, гладкие, блестящие, с ровными краями, профиль равномерно возвышающийся, диаметр 2,0-2,5 мм.

Грамотрицательные, неподвижные, аэробные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, неспорообразующие бактерии. Не подвергают гидролизу казеин, крахмал, желатину. Не образуют сероводорода, индола и 3-кетолактозы при окислении лактозы. Потребляют цитрат и малонат. Не обладают липазной и лецитиназной активностью. Образуют кислоту из углеводов, при этом выделение газа не обнаружено. Разлагают мочевину и твин 20. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Способны переносить концентрацию NaCl не более 3% и pH среды в пределах 4,6-8,6. Максимальный рост наблюдается при pH 6,8-7,2. Растет при 10-42°С, оптимум температуры - 26-28°С.

Обладают устойчивостью к левомицетину, тетрациклину, фузидину, ванкомицину, ампициллину, бензилпенициллину. Чувствительны к ципрофлок-сацину, стрептомицину, канамицину, неомицину.

В качестве единственного источника углерода и энергии используют углеводы (сахарозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-глюкозу, D-лактозу, L-рамнозу, D-рафинозу, D-галактозу, D-мальтозу, D-ксилозу и L-арабинозу), спирты (сорбит, маннит, глицерин), аминокислоты (D-аланин, D-

1646

фенилаланин, ЭЬ-ссрин. ЭЬ-мстионин. Б-тирозин, БЬ-триптофан, Э-валин. Б-лейцин).

Утилизируют разнообразные органические вещества: нефть, углеводороды алканового ряда (декан, ундекан, тридекан), циклогексан, хлорпроиз-водные углеводородов (изобутил хлористый, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты), ароматические соединения (бензол, толуол, о-ксилол), спирты (диэтиленгликоль, изопропиловый спирт, глицерин), кислоты (масляная, изовалериановая, капроновая). Широкий спектр деструктируемых соединений создает предпосылки для использования штамма Ас1пе1оЬас1ег ер. ИБ ДТ-5.1/1 для очистки окружающей среды от различных загрязнителей.

Для более точной идентификации бактерии проведено секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16Б рРНК с известными структурами из СепВапк

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), согласно которому с высокой долей вероятности (99,93%) можно утверждать, что изучаемый микроорганизм относится к роду Ас1пс1оЬас1с1\

Для уточнения филогенетического положения нового штамма был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК видов, относящихся к роду Асте(оЬас(ег и построена дендрограмма (рис.). На рисунке видно, что бактерия Асте(оЬас(ег ер. ИБ ДТ-5.1/1, возможно, принадлежит к виду Асте1оЪас1ег са!соасе-исш.

В дальнейшем планируется изучение хемотак-сономических характеристик и уточнение видовой принадлежности штамма, а также проверка способности бактерий Асте(оЬас(ег ер. ИБ ДТ-5.1/1 к очистке нефтезагрязненной почвы в лабораторных и полевых условиях.

I-АапеЬЬа&егЬау1у1 В2Т/АР509820

1-Аапе^ЬаЫегзоН В1Т/Е11290155

-Ас'теШа^егШпеп 110/АР509823

-Лс/'леГойасГеплсЛ'сцз А648Т/Н М047743

-АстеШа^еггасНоге^епв йБМ 6976Т/АЮг01000095

-АапеЬЬа^егдегпеп 9А01Т/АР509829

I-Аапе(оЬас(егЬаитаппИ АТСС 19606Т/АСС!В01000091

1-Астек>ЬаЫефпН ИУЮ 998Т/АМ410704

-АстеЬЬаЫеггисИв С30Т/ЕР204258

-АстеЬЬаЫегуепеИапив РАС-1Т/АКЮ01000085

^^ АстеЬЬаЫегЬегештае ИУЮ 1003Т/А1ЕЮ1000248 ээ^— Аапе^ЬаЫегдиШошае АТСС 11171Т/Х81659

-Астек>ЬаЫегигвтдН ОЭМ 16037Т/А1ЕА01000080

-АапеЬЬаЫеграп/иэ йБМ 16617Т/А1ЕВ01000124

-Ас'теЬЬасЛегЦегпЬегд'те 71416/АР509825

-Аапе(оЬас(ег(апс1оИ 4МЗТ/АР509830

- Аапе(оЬаЫегЬеуеппскИ 58аТ1АЛ6267'\ 2 АапеЬЬа^егЬавто/уйсиБ йБМ 6962Т/Х81662

- АапеЬЬа^егдуНепЬегдИ 1271 Т/Аи293694

- Лс/леГойасГефЛлзол// йБМ 6963Т/Х81663

-АапеЬЬаЫегЬоиуеШ 4В02Т/АР509827

-АстеЬЬаЫегзсЫпсИеп 1.111458321^278311

70

- АапеЬЬаЫегЬгЬоиН 5УЫ5-8Т/ОС!832256

— АстеШа^егповосот'мЦв ИУЮ 10619Т/Н0180192 АстеШаЫегрШ ИУЮ 1035Т/Н0180184 ¡Асте^Ьа^ег ер. ИБ ДТ-5.1/1

\Acinetobactercalcoaceticus РЭМ 30006Т/А1ЕС01000170

- АЫпеЬЬааегШШ'! ЫСТС 5866Т/А1ЕЮ1000120

-РзусЬгоЬа^ег ¡ттоЬИЬ АТСС 43116/1139399

Рис. Филогенетическое положение штамма Асте1оЬас1ег ер. ИБ ДТ-5.1/1 согласно анализу нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "Ьоо1:81:гар"-анализа (показаны величины показателя "Ьоо1:81:гар"-анализа выше 70%). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 168 рРНК Ряус}1гоЬас1ег ттюЫИя АТСС 43116/Ш9399

1647

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гурова Т.Ф., Назаренко Л.В. Основы экологии и рационального природопользования: Учеб. пособие. М.: ОНИКС, 2005. 224 с.

2. Сулейманов Р.Р., Габбасова II.M., Сит дикое Р.Н. Изменение свойств нефтезагрязнённой серой лесной почвы в процессе биологической рекультивации // Изв. РАН. Сер. биол. 2005. № 1. С. 109-115.

3. Шорина Т.С., Русанов А.М., Сулейманова А.М. Влияние нефти на физические свойства чернозема обыкновенного степной зоны Урала // Вестник ОГУ. 2010. № 6. С. 137-139.

4. Stroud J.L., Paton G.I., Semple K.T. Microbe-aliphatic hydrocarbon interactions in soil: implications for biodégradation and bioremediation II J. Appl. Microbiol. 2007. V. 102. N5. P. 1239-1253.

5. Давыдова С.Л., Тагасов В.II. Нефть и нефтепродукты в окружающей среде: Учеб. пособие. М.: Изд-во РУДН, 2004. 163 с.

6. Сулетшнов Р.Р. Изменение свойств нефтезагрязненных серых лесных почв при биологической рекультивации: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. Уфа, 1999. 24 с.

7. Куликова П.Ю., Дзержинская II.C. Микробиологические способы ликвидации последствий аварийных разливов в море // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. № 5. С. 24-29.

8. Singer А.С., van der Gast C.J., Thompson I.P. Perspectives and vision for strain selection in bioaugmentation. TRENDS in Biotechnol. 2005. V. 23. N2. P. 74-77.

9. Thompson I.P., van der Gast C.J., Ciric L., Singer A.C. Bioaugmentation for bioremediation: the challenge of strain selection Il Env. Microbiol. 2005. V. 7. N 7. P. 909-915.

10. Кисин Д. В., Колесов A. II Препараты серии «Биодеструктор» - эффективные средства для ликвидации нефтяных загрязнений // Нефтяное хозяйство. 1995. № 5-6. С. 83-85.

11. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности: Учеб. пособие. Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001. 214 с.

12. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф. и др. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для био-ремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2004. №1. С. 77-82.

13. Маркарова М.Ю. Опыт применения биопрепарата «Универсал» для рекультивации нефтезагрязненных земель // Вестник Института биологии Коми НЦ УрО РАН. 2004. № 10(84). URL: http://www.ib.komisc.ni/t/ru/ic/vt/04-84/06.html/.

14. Булатов A.II, Волощенко Е.Ю., Кусов Г.В., Савенок О.В. Экология при строительстве и эксплуатации нефтяных и газовых скважин. Краснодар: Просвещение-Юг, 2010.

15. Рогозина Е.А., Андреева O.A., Жаркова СЛ., Мартынов Д.А., Орлова H.A. Сравнительная характеристика отечественных биопрепаратов, предлагаемых для очистки почв и грунтов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами // нефтегазовая геология. Теория и практика. 2010. Т. 5. N 3. URL: http://www.ngtp.rn/rnb/7/37_2010.pdf.

16. Чертков А. Микроорганизмы-уборщики // Эксперт. 2011. №12. С. 78.

17. Mmygina К, Markarova AI, Kalyuzhnyi S. Application preparation «Rlioder» for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environment International.'2005. V. 31. N2. P. 163-166.

18. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffmic hydrocarbons //Develop. Industr. Microbiol. 1961. V. 2. N 1. P. 23-32.

19. Методы общей бактериологии. Т. 3 / Под ред. Ф. Гер-хардга. М.: Мир, 1984. 264 с.

20. Добровольская Т.Г., Скворцова H.H., Лысак Л.В. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий. М.: Изд-во МГУ, 1990. 76 с.

21. Определитель бактерий Берджи. Т. 1, 2 / Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997.

22. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. М., 2004. 91 с.

23. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. N22. P. 4673-4680.

24. Pruesse E., Peplies J., Glöckner F.O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes // Bioinformatics. 2012. V. 28. N 14. P. 1823-1829.

25. Tindall В J., Rossellö-Möra R, Busse HJ. et al. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes // hit. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. N 1. P. 249-266.

26. Saitou N.. Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol, and Evol. 1987. V. 4. N4. P. 406425.

27. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. V. 16. N 2. P. 111-120.

PROPERTIES AND PHYLOGENETIC PROVISION OF THE BACTERIUM ACINETOBACTER SP. HE ^T S.l/l

©2013 T.Yu. Korshunova, S.R. Mukhamatdyarova, O.N. Loginov

Institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa

From grey forest soil with diesel fuel strain Acinetobacter sp. HE /JT-5.1/1 was allocated. Cultural, phenotipical, biochemical and phylogenetic features of a strain are studied. Abilities of a bacterium to utilization of oil, hydrocarbons and other organic substances of the various nature are shown.

Key words strain Acinetobacter sp. HE ffT-5.1/1, cultural, physiological, biochemical features, phylogenetic tree.

Tatyana Korshunova, Candidate of Biology, senior researcher, e-mail: korshunovaty(S)niail.ru; Svetlana Mukhamatdyarova, post-graduate student, e-mail: svetarm(S)gmail.com; Oleg Loginov, Doctor of Biology, professor, head of laboratory, e-mail: biolab316(S)yandex.ru

1648