CC BY
41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Ф.К. Шарипов, Г.В. Киреев
Республиканский онкологический научный центр МЗ РУз,
Республика Узбекистан, г. Ташкент
В целях изучения закономерностей свободнорадикального окисления сыворотки крови больных с опухолями головного мозга методом хемилюминесценции обследовано 47 пациентов. Из них 16 - здоровые лица (контрольная группа), 26 со злокачественными опухолями головного мозга и 5 больных с аденомой гипофиза. Показано, что у больных с доброкачественными опухолями мозга снижены параметры хемилюминесценции по сравнению с таковыми у здоровых лиц в 1,5 раза. У больных со злокачественными опухолями параметры спонтанной и индуцированной хемилюминесценции находятся на значительно более низком уровне. При этом концентрация малонового диальдегида снизилась в 6 и более раз. Обнаруженные изменения указывают на то, что степень катаплазии оказывает существенное влияние на параметры свечения сыворотки крови. yv обследованных больных со злокачественными новообразованиями антирадикальная активность хлороформ-метанольных экстрактов сыворотки крови повышена в 1,5-2 раза по сравнению с контролем.
47 patients were examine by chemiluminescence method with the aim of investigation of some regularities of free-radical oxydationofblood serum at sicks with tumour of brain. From these patients 16 were healthy people (control group), 26 - with malignant rumors of brain and 5 sicks had the hypophyse. It was shown that parameters of chemiluminescence of sicks with tumors of brain were lowering in 1,5 time comparison with healthy people. The parameters of spontaneous and induced chemiluminescence were on very low level at sicks with malignant tumors. The concentration of malonic dialdehyde decreased in 6 and more times. The revealed changes indicate on the fact that degree of the kataplasy has an essential influence on the parameters of luminescence of blood serm. The antiradical activity of chloroform-methanol extracts of the blood serum increased in 1,5-2 time at examined sicks with malignant neoplasms in comparison with control.
Индуцированная хемилюминесценция сыворотки крови и её форменных элементов оказалась весьма чувствительным методом при использовании ее в качестве диагностического и прогностического теста. Квантовый выход хемилюминесценции характеризует скорость цепного свободнорадикального окисления ли-попротеидных комплексов. Свободнорадикальное окисление липидов сопровождается образованием перекисей. Скорость перекисного окисления, как известно, возрастает по мере увеличения содержания ненасыщенных жирных кислот в составе липидов [1, 2, 4]. Регулятором скорости их протекания являются природные антиоксиданты. К настоящему времени накоплены многочисленные данные об изменении уровня сверхслабого свечения при развитии злокачественных новообразований в эксперименте и клинике [3, 5]. Однако почти отсутству-
ют данные по хемилюминесценции сыворотки крови при злокачественном росте в ЦНС.
Ранее нами была изучена хемилюминесценция сыворотки крови при бластомогенезе в ЦНС, где отмечены фазные изменения перекисного окисления липидов на этапах бластомогенеза [6]. Значительное снижение по параметру сверхслабого свечения отмечали к периоду формирования глиобластом.
В настоящей работе представлены результаты исследования свободнорадикального окисления липидов сыворотки крови больных со злокачественными новообразованиями головного мозга, катализируемого ионами двухвалентного железа, с определением конечного продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида (МДА). Определяли также антирадикальную активность липорастворимых соединений сыворотки крови.
Исследования проведены у 47 пациентов, в том числе у 1 б здоровых лиц (контрольная группа), 26 больных со злокачественными опухолями мозга (медуллобластома) и у 5 больных с аденомой гипофиза. Диагноз у 17 больных установлен на основании гистологического исследования послеоперационного материала.
Регистрацию хемилюминесценции (спонтанной и индуцированной) проводили при температуре 37 °С на установке, состоящей из детектора излучения ФЭУ-38, источника питания ВС-22, высокоомного вольтметра ЛПУ-01 и потенциометра КСП-4. Сыворотку крови получали из цельной крови.
Исследуемую сыворотку крови в количестве 1 мл помещали в термостатированную кювету. Фосфатным буфером объем доводили до 10 мл (рН~7,4). После перемешивания инкубационного раствора и выравнивания температуры до 37 °С открывали шторку светонепроницаемой камеры и регистрировали спонтанное свечение, затем вводили 1 мл раствора Fe2A (концентрация 50 мМ). Одновременно с записью свечения производили отбор проб для накопления конечного продукта перекисного окисления МДЛ и расхода Fe2+ из инкубационной среды. Исследуемый раствор в количестве 2 мл смешивали с 2 мл 17% трихлоруксусной кислоты, центрифугировали при 9000 об/мин в течение 30 мин.
Для определения МДА к 1 мл надосадочной жидкости добавляли 2 мл 0,5% раствора тиобар-битуровой кислоты и инкубировали 45 мин на водяной бане при 60 °С. Спектр поглощения снимали на спектрофотометре СФ-4А. При расчете количества МДА при 535 нм молярный коэффициент поглощения продукта принимали равным 156000.
Количество Fe2+ в надосадочной жидкости определяли с помощью О-фенантролина. К готовому 0,75% О-фенантролину (0,5 мл) добавля-' ли 1 мл исследуемого раствора в 2,5 мл НгО. Количество двухвалентного железа определяли по калибровочной кривой, построенной при 510 нм.
Антирадикальную активность измеряли в липорастворимых . соединениях сыворотки крови пациентов. Электрохемилюминесценция имела место при пропускании постоянного тока напряжением 6 В по платиновым электродам: игольчатый катод и цилиндрический анод. В окислительной ячейке использовали систему - ненасыщенный раствор нитрата натрия в метаноле (9 мл). При этом возникало стационарное свечение.
Растворяли 5 мг хлороформ-метанольного экстракта сыворотки крови в 1 мл абсолютного метанола и добавляли в окислительную ячейку (чувствительность метода 0,02 мг). По тушению стационарного свечения элсктрохемилюминес-ценции судили об антирадикальной активности липорастворимых фракций сыворотки крови. Расчет производили по формуле:
где J0 — стационарное свечение системы; J — свечение в присутствии ингибитора. Результаты исследований были статистически обработаны.
При инкубации разведенной сыворотки крови с солями двухвалентного железа наблюдается типичная для липосодержащих систем картина развития свечения: быстрая вспышка, угнетение свечения, медленная вспышка, переходящая в стационарное свечение. На каждой из этих стадий имеет место параллелизм между интенсивностью свечения и скоростью накопления продуктов перекисного окисления липидов — малонового диальдегада и концентрацией двухвалентного железа. Полученные данные свидетельствуют о том, что хемилюмипесценция сыворотки крови в присутствии Fe2+ обусловлена перекисным окислением липидов сыворотки, и согласуются с литературными сведениями [4].
Для оценки интенсивности свободнорадикальных процессов замеряли амплитуду спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, а также амплитуду быстрой вспышки и светосумму после добавления двухвалентного железа в интервале 10 мин. Концентрацию малонового диальдегида устанавливали в начале и конце медленной вспышки свечения с определением убыли двухвалентного железа из инкубационной смеси. На основании анализа полученных данных выявлено, что уровень спонтанной хемилюминесценции в сыворотке крови здоровых лиц составлял около 12 отн. ед. (таблица). Прибавление, к сыворотке крови двухвалентного железа в интервале 10 мин увеличивало амплитуду хемилюминесценции в 4 раза. Светосумма хемилюминесценции за период выхода на стационарный режим окисления составила в среднем 278,4 отн. ед. Расход двухвалентного железа был равен 23,5 мкМ, а накопление МДА в начале и конце медленной вспышки - соответственно 19,б3 и 43,53 мкМ.
У больных с доброкачественными опухолями гипофиза отмечено статистически достоверное снижение параметров хемилюминесценции по
Свободнорадикальное окисление сыворотки крови больных с опухолями головного мозга
Уровень хемилюминесцениии в сравниваемых группах
Группа больных Амплитуда спонтанной Хемилюминссцсноия, индуцированная 1'е2*, отн. ед. Убыль Ре2*, Накопление МДА*, мкМ
хемилюминесценции, ото. ед. Амплитуда быстрой вспышки Амплитуда медленной вспышки Светосумма (за 10 мин) . 1° ПО
Больные 3,6 ± 0,49 20,25 ± 0,99 10,16 ± 0,56 63,15 ± 4,93 4,1 ± 2,1 2,68 ± 0,81 6,0 ± 0,9
ЗНГМ р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,01 - р<0,001
Больные с 8,0 ± 0,54 25,6 ± 4,8 19,0 ± 3,24 122,5 ± 14,9 20,5 ± 2,1 16,9810,97 35,7 ± 3,0
аденомой гипофиза р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,01 — р<0,05
Контрольная группа 12,0 ± 1,5 70,0 ± 2,9 48,0 ± 1,7 278,4 ± 1,7 23,5 ± 1,5 19,63 ± 0,6 43,53 ± 2,1
* Момент отбора проб в начале (Iя) и в конце (11°) медленной вспышки свечения.
сравнению с таковыми у здоровых лиц (р<0,001). При злокачественных новообразованиях головного мозга (ЗНГМ) параметры спонтанной и индуцированной хемилюминесценции также находятся на дизком уровне (р<0,001). Обнаруженные изменения хемилюминесценции говорят в пользу того, что степень катаплазии оказывает существенное влияние на параметры свечения.
Обращает на себя внимание наличие значительных отличий стимулированной индуцированной хемилюминесценции по отношению к спонтанной у здоровых лиц и лиц со злокачественными новообразованиями.
У больных со злокачественными мозговыми новообразованиями угнетаются свободнорадикальные процессы в липидах, снижается концентрация ненасыщенных жирных кислот. При изучении ингибиторной активности липорастворимых соединений сыворотки крови здоровых лиц и больных со злокачественными мозговыми новообразованиями установлено значительное повышение активности ингибиторов, влияющих на константу К7 в реакции разветвления:
1пН + Я02° — КЗ— ► 1п0 + ЯООН,
У больных ингибиторная активность составила 52,2% при норме 36,5%. На снижение интенсивности хемилюминесценции, видимо, большое влияние оказывает транспортная функция природных антиоксидантов сыворотки крови, связанных с белком, который накапливается в растущей опухоли. Аналогичное явление наблюдается в проведенных нами опытах для селена и других микроэлементов при течении бластомоге-незавЦНС[6].
В этой связи представленный тест может служить дополнительным диагностическим методом
контроля послеоперационного периода, а также для распознавания опухоли глии.
Таким образом, индуцированная хемилюми-несценция стала новым источником информации в исследованиях состояния клеточных липидов опухолевого роста. Особый интерес представляют опухоли головного мозга, где 85% сухой массы составляют фосфолипиды. В опухолевых тканях головного мозга и в сыворотке крови опухо-леносителя происходит повышение концентрации трудноокисляемых фракций, таких как фос-фотидилхолин, а пролиферативная активность тканей напрямую связана с увеличением в них антиоксидантных компонентов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гамалей И.А. О регуляторной роли активных форм кислорода в клетке // Материалы Междунар. конф. «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармаколо гические и клинические аспекты». СПб., 1999. С. 767.
2. Гусев ВТ., Панченко Л.Ф. Свободнорадикальная теория старения в парадигме геронтологии // Материалы Междунар. конф. «Свободнорадикальные процессы: эко логические, фармакологические и клинические аспекты». СПб., 1999. С. 784.
3. Либе М.Л., Брусованик В.К, Леешина И.П. и др. Адаптация мембран мозга к хроническому стрессу: струк турные и функциональные изменения // Бюл. экспер. биол. 1994. №2. С. 212.
4. Франциянц ЕМ., Сидоренко Ю.С., Розенко Л.Я. Перекисное окисление липидов в патогенезе опухолевой болезни. Ростов н/Д: Изд-во Ростов, ун-та, 1995. 176 с.
5. Франциянц ЕМ., Шихлярова А.И., Кучерова Т.Н. Роль антиоксидантных систем мозга в механизме анти канцерогенного влияния сверхнизкочастотных магнитных полей //Вопр. онкол. 2002. Т. 48, №2. С. 216-222.
6. Шарипов Ф.К., Киреев Г.В. Антиокислительная ак тивность на этапах трансплацентарного бластомогенеза в ЦНС^// Проблемы онкологии. Ташкент, 2002. С. 35-39.
Поступила 22.05.03
