CC BY
112
УДК 575:630.17 Т.В. Вострикова
СУТОЧНАЯ РИТМИКА МИТОТИЧЕСКОЙ И ЯДРЫШКОВОЙ АКТИВНОСТИ У БЕРЕЗЫ ПОВИСЛОЙ
В статье приведены результаты изучения суточной ритмики митотической активности в клетках корневой меристемы проростков семян деревьев березы повислой (Betula pendula Roth), произрастающих на экологически безопасной территории. Выявлены два пика активности, максимумы и минимумы количества клеток с остаточными ядрышками. Отмечены повышение митотического индекса за счет увеличения доли клеток в стадии профазы при делении и задержка клеток в стадии профазы в связи с влиянием стрессовых факторов на исходные деревья и их семенное потомство.
Ключевые слова: суточная митотическая активность, митотический индекс, семенное потомство, остаточное ядрышко.
T.V. Vostrikova
DAYLY RHYTHM OF THE DROOPING BIRCH MITOTIC AND NUCLEOLAR ACTIVITY
The results of studying the mitotic activity daily rhythm in the root meiistem sells of the seed sprouts of the drooping birch (Betula pendula Roth) trees, growing on the ecologically safe territory are given in the article. Two activity peaks, maxima and minima in the sell number with the residual nucleoli are revealed. Mitotic index increase because of sell share increase in the prophase stage at sell division and delay in the prophase stage as a result of the stressful factors influence on the initial trees and their seed posterity are noted.
Key words: daily mitotic activity, mitotic index, seed prosterity, residual nucleolus.
Введение. Изучение ритмов митотической активности в меристемах высших растений и, в частности, суточной митотической активности (МА) продолжительности митотического цикла, проводится более 100 лет. Современные исследования говорят о важности продолжительности стадии профазы в процессе деления и образования суточного ритма у древесных растений. Суточная динамика митотической активности исследована не у всех растений и, в частности, у березы повислой. Исследование суточной МА у березы повислой и анализ ритмики других цитогенетических характеристик начаты относительно недавно [4]. На структуру и продолжительность клеточного цикла в целом, а особенно на сам процесс митотического деления, оказывают влияние внешние стрессоры и внутренние факторы растительного организма, обусловливающие возникновение экзо- и эндогенных ритмов. Было показано, что на первых этапах прорастания ритмы деления полностью эндогенны и не зависят от световых ритмов. На этих стадиях характер ритмов определяется продолжительностью клеточного цикла и динамикой изменения его фаз [5]. Регуляторные ритмы фазовых индексов (доля клеток в соответствующих фазах цикла) образуются за счет двух процессов регуляторного (периодическое торможение) и компенсаторного (быстрое изменение распределения клеток по фазам цикла) [6].
В литературе не часто встречается информация о характере распределения клеток по фазам в цикле, хотя количество, или доля клеток на определенных стадиях клеточного цикла, является важным диагностическим признаком, особенно при мониторинговых исследованиях. Указывают на зависимость ритмов пролиферации от продолжительности регуляторной (наиболее чувствительной) фазы цикла G2 [6]. Фаза G2, которую считают регуляторной, является пограничным пунктом или переходом от интерфазы к собственно делению. Однако в наших исследованиях в качестве регуляторной фазы митоза выступает профаза, которая часто определяет динамику изменения митотитического индекса (МИ).
В работах по цитогенетическому мониторингу особое внимание уделяется изменчивости других показателей: числу аномально делящихся клеток, или патологии митоза (ПМ), ядрышковой активности, в частности, количеству клеток с остаточными ядрышками (ОЯ), поскольку ученые еще не пришли к единому мнению об этом явлении. Открытым остается вопрос о том, считать ли ОЯ компенсаторным механизмом на клеточном уровне или цитогенетическим нарушением (ЦН). Под термином «цитогенетическое нарушение» мы подразумеваем структуры клетки, отсутствующие в норме (например, ОЯ не встречаются при нормальном делении клетки).
Целью исследований являлось изучение суточной ритмики цитогенетических характеристик - митотической активности (МА) и количества клеток с остаточными ядрышками (ОЯ) - семенного потомства Betula pendula Roth, собранного на экологически безопасной территории, а также выявление возможных пиков в проявлении данных признаков.
Объекты и методы исследований. Наиболее полную информацию о состоянии клеток и процесса деления дает изучение суточной Ма. В таких работах применяют метод группового отбора деревьев (5-10), собирая с них семена для исследований. Объектами служили деревья березы повислой из Усманского бора (район биостанции ВГУ «Веневитиново»), который находится вдали от промышленных предприятий города и
где, по данным Н.А. Щетинкиной с соавторами (1992), уровень загрязнения химическими и физическими поллютантами не превышает ПДК. Фиксацию материала - проростков семян березы повислой от свободного опыления - проводили в 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 ч (по зимнему времени). Приготовление постоянно давленых препаратов осуществляли по ранее описанной методике [4].
Результаты исследований и их обсуждение. Нами проводилось изучение суточной динамики митотической активности (МА), уровня патологии митоза (ПМ), в частности, количества клеток с остаточными ядрышками (ОЯ), и выявление возможных пиков в проявлении тех или иных признаков.
Препараты (по 7 для каждого срока фиксации) изучали с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Zeiss, Jena). При исследовании препаратов учитывали общее количество просмотренных клеток на каждом препарате, митотический индекс (МИ), количество делящихся клеток, находящихся в той или иной фазе митоза, количество патологий митоза (ПМ), количество клеток с остаточными ядрышками (ОЯ), то есть ядрышками, присутствующими на стадиях метафазы, анафазы и ранней телофазы, количество клеток с вакуолизирован-ной цитоплазмой в интерфазе.
ПМ классифицировали по И.А. Алову [1]. На стадии профазы трудно уловить какие-либо нарушения деления. Поэтому наиболее объективную информацию о патологиях митоза можно получить, не учитывая эту стадию. Таким образом, мы определяли количество ПМ без учета профазы. Статистическую обработку результатов проводили на ПЭВМ типа IBM PC/AT с использованием статистического пакета программ "Stadia”.
Большое значение имеет процентное соотношение клеток на некоторых стадиях митоза, по которому как раз можно определить стимулирующий или ингибирующий эффект, который производят стрессоры. Поэтому для более точной характеристики МА рассчитывают МИ с учетом и без учета профазы. Особую роль здесь играет доля клеток в стадии профазы - отношение числа клеток, находящихся на этой стадии, к количеству делящихся клеток. При анализе суточной МА просматривается два пика активности: утренний - в 9 ч; вечерний - в 21 ч (рис. 1).
Показателем стимулирующего эффекта является увеличение числа клеток в стадиях метафазы, анафазы, телофазы, обусловливающее повышение МИ, что в наших исследованиях отмечалось в 9 ч в 1997-2002 гг. В остальные часы фиксация МИ (без учета профазы) остается приблизительно на одном уровне, а вечерний пик в 21 ч обусловлена увеличением доли профаз. Повышение МИ за счет их числа отмечено во все часы фиксации в 2002 г. по сравнению с 2000 г., за исключением времени пика МА (9 ч), когда он (без учета профазы) был наиболее высок и составлял 5 ± 0,5%. Это свидетельствует о большем числе клеток в стадиях мета -, анна -, и тело-фазы и высокой активности процесса деления (рис. 1). В 24 ч МИ (без учета профазы) в 2002 г. был 1,2 ± 0,2, что достоверно ниже, чем в 2000 г. (2,2 ± 0,3), а в остальные часы фиксации практически не различается.
Рис. 1. Суточная митотическая активность у семенного потомства из района “Веневитиново”
Регулярность колебаний МИ не является следствием регулярности изменения факторов внешней среды [6], т.е. в природе суточные ритмы МА не зависят от периодических колебаний (освещения и т.д.), но техногенный фактор оказывает влияние на длительность митотического цикла, величину МИ и распределение клеток по фазам. Под воздействием стресса часто отмечается растяжение цикла, увеличение доли клеток в профазе и за счет этого некоторое увеличение МИ, но фактически задержка и угнетение деления. В наших исследованиях не было отмечено растяжения цикла, однако увеличение доли профаз в корневой меристеме проростков 2002 г. по сравнению с
2000 г. свидетельствует о более сильном действии стресса, которому подверглись материнские деревья и их семенное потомство. Не происходило сдвигов пиков МА, поэтому можно говорить о том, что насаждения не испытывают большой техногенной нагрузки. Подтверждением этому служит число ПМ, которое в 2000-2002 гг. остается в пределах нормы, составляя в среднем в 2000 г. - 2%, а в 2002 г. - 2,3%, что не превышает уровня спонтанного мутагенеза (3% по литературным данным).
Отмечена вариабельность в числе и расположении максимумов МИ не только у различных, но и у одного и того же растения в сходных условиях выращивания [5]. Наши исследования показывают постоянство максимумов МИ (в 9 и 21 ч), однако известен высокий полиморфизм березы по многим признакам. Видимо этим можно объяснить изменчивость динамики числа клеток с ОЯ под действием стресса. Ядрышковая активность тесно связана с метаболическими процессами. Число клеток с ОЯ является более чувствительной характеристикой, чем МИ [2], а МИ и ПМ - наиболее устойчивыми из цитогенетических критериев, поэтому по ним можно судить о степени загрязнения района произрастания исходного материала. В целом береза повислая не устойчива к стрессу и, в частности, к антропогенному, в связи с высокой интенсивностью фотосинтеза [9].
Работа генома постоянно нарушается продуктами собственного метаболизма клетки [11]. Процессы возникновения нарушений и их репарация находятся в определенном динамическом равновесии, причем уровень повреждений тем выше, чем интенсивнее скорость обмена веществ [10]. Вот почему при увеличении каталитической активности Zn-зависимых ферментов и повышении скорости связанных с их функцией биохимических реакций может возрастать число образующихся в единицу времени первичных повреждений ДНК. Активизация пролиферации сокращает время на репарацию повреждений [8]. Этот факт находит отражение и в наших исследованиях, подтверждаясь увеличением числа ПМ, числа клеток с ОЯ наряду со стимуляцией митотической активности. Таковы последствия адаптивной реакции на стресс по типу стимуляции пролиферативной и ядрышковой активности. Напротив, при изучении популяций одуванчика, подвергающихся техногенному стрессу, было обнаружено снижение выхода нарушений у проростков семян от особей, характеризующихся замедленным типом развития, что обусловливает их высокую выживаемость за счет увеличения времени на репарацию повреждений [7]. Мы предполагаем, что задержку клеток на стадии профазы, о которой свидетельствует увеличение доли клеток на этой стадии, можно расценивать как элемент замедленного типа развития. В связи с этим при слабом загрязнении отмечается невысокое число ПМ, несмотря на повышенное общее количество ЦН, которое обеспечивается увеличением числа клеток с ОЯ, т.е. идет активизация адаптационных процессов.
В 2000 г. число клеток с ОЯ было достаточно высоко в 3 ч, затем уменьшилось до минимума в 9-12 ч, повышаясь постепенно до максимума в 15 ч и немного снижалось к 21 ч. В 2002 г. наблюдалась другая тенденция: резкий подъем с 3 до 9 ч и постепенный спад с 9 до 24 ч (данный показатель в 21 ч довольно низкий, а в 24 ч - минимален), что свидетельствует о низкой активности метаболических процессов в ночные часы. Жизненные процессы у всего растения и, в частности, в клетке наиболее интенсивны утром, что отражается на ядрышковой активности, показателем которой является число клеток с ОЯ, имеющее в 2000 г. высокие значения в 3 и 6 ч, а в 2002 г. максимум в 9 ч (рис. 2).
Рис. 2. Суточная ритмика числа клеток с остаточными ядрышками (ОЯ) у потомства B.pendula,
произрастающей в районе “Веневитиново”
Увеличение ядрышковой активности считается показателем увеличения метаболической активности под воздействием стресса на семенное потомство [2]. Ее частным случаем можно назвать наличие ОЯ при делении клеток. Феномен появления ядрышкоподобных структур, соединенных с хромосомами в метафазе, анафазе и ранней телофазе митоза, когда ядерная оболочка отсутствует и хромосомы еще значительно сокращены и ядрышко, как правило, не наблюдается, описан у многих видов растений. Такие структуры получили название "persistent nucleoli” - остаточные ядрышки. Наблюдая их у злаков, было предложено использовать этот признак в диагностических целях. Но наиболее часто подобное явление отмечалось при экстремальных воздействиях на организмы химическими веществами, радиацией при вирусной инфекции и при развитии раковых опухолей. Повышенная частота встречаемости ОЯ (до 40% от общего числа клеток на стадиях метафазы анафазы и ранней телофазы) была отмечена А.К. Буториной и Ю.Н. Исаковым у сеянцев дуба черешчатого, выращенных из семян, сформировавшихся в 1986 г. в зоне Чернобыльской аварии [3]. Это позволило предположить, что появление Оя во всех случаях связано с воздействием экстремальных условий (это, например, резкие колебания погодных условий в период вегетации). Возможно частота встречаемости ОЯ будет пропорциональна силе воздействия экстремального фактора в начальном периоде его действия, затем соотношение может измениться, поскольку это достаточно лабильная органелла. Появление ОЯ можно рассматривать как компенсаторный механизм, обеспечивающий клетке синтез необходимого количества белков в условиях подавления действия многих уникальных генов экстремальными факторами.
Заключение. Таким образом, прослеживается четкая связь между цитогенетическими показателями -митотической активностью, количеством патологий и клеток с ОЯ. Поэтому при оценке качества семенного потомства нужно анализировать все перечисленные характеристики. Учитывая полученные данные, можно сделать вывод, что изучаемый район «Веневитиново» следует рассматривать только как условно чистый, назвав его экологически безопасным, так как в настоящее время невозможно обнаружить абсолютно чистой территории. Но поскольку в последние годы огромное влияние на развитие растений оказывают резко меняющиеся погодные условия, это приводит к колебаниям значений многих признаков, в том числе и цитогенетических показателей, что вызывает изменения гомеостаза, нестабильность генома. В связи с этим мы предлагаем использовать данные характеристики в качестве маркеров в мониторинговых исследованиях.
Литература
1. Алов И.А. Патология митоза // Вестн. АМН СССР. - 1965. - № 11. - С. 58-66.
2. Буторина А.К., Калаев В.Н. Анализ чувствительности различных критериев цитогенетического мониторинга // Экология. - 2000. - № 3. - С. 206-210.
3. Буторина А.К., Исаков Ю.Н. Пуфинг хромосом в метафазе - телофазе митотического цикла у дуба черешчатого // Докл. АН СССР. - 1989. - Т. 308. - № 4. - С. 987-988.
4. Вострикова Т.В., Буторина А.К. Изучение суточной митотической активности у березы повислой // Цитология. - 2004. - Т. 46. - № 6. - С. 520-524.
5. Гриф В.Г., Мачс Э.М. Ритмы митотической активности и клеточные циклы в меристемах растений // Цитология. - 1994. - Т. 36. - № 11. - С. 1069-1080.
6. Гриф В.Г., Мачс Э.М. Влияние ритма освещения на митотический цикл в корневой меристеме растений // Цитология. - 1996. - Т. 38. - № 7. - С. 718-732.
7. Использование природных популяций Taracsacum officinale Wigg. для оценки состояния техногенно нарушенных территорий / Т.И. Евсеева, С.А. Гераськин, Н.П. Фролова [и др.] // Экология. - 2002. -№ 5. - С. 393-396.
8. Комплексное изучение радиоактивного и химического загрязнения водоемов в районе расположения хранилища отходов радиевого промысла / Т.И. Евсеева, С.А. Гераськин, И.И. Шуктомова [и др.] // Экология. - 2003. - № 3. - С. 176-183.
9. Николаевский В.С. Экологическая оценка загрязнения среды и состояния наземных экосистем методами фитоиндикации. - М.: Изд-во МГУ, 1998. - 191 с.
10. Adelman R., Saul R.L., Ames B.N. Oxidative damage to DNA: relation tospescies metabolic rate and life span roots // Proc. Net. Acad Sci. USA. - 1988. - Vol. 85. - P. 2706-2708.
11. Britt A. DNA repair mechanism in vegetable cell // Radiat. Res. - 1996. - Vol. 146. - № 5. - P. 1158-1172.
12. Kocik H., Wojciechowska В., Liguzinska А. Investigation on the cytotoxic influences of zinc on Allium cepa roots// Acta Soc. Bot. Pol. - 1982. - Vol. 51. - № 1. - P. 3-9.
