CC BY
3М.И. Азаркович, Л.В. Назаренко
Существуют ли алейроновые зерна в рекальцитрантных семенах Дуба черешчатого1?
Методами одномерного диск-электрофореза и световой микроскопии были изучены белки рекальцитрантных семян Дуба черешчатого ^жкш юЬш Ь). В ходе электрофоретического исследования в белковом комплексе семян не найдено сверхмажорных полипептидов, которые могли бы претендовать на роль запасных белков. Световая микроскопия не выявила в вакуолях ни сформированных алейроновых зерен, ни заметных белковых включений. В материале анализируется связь найденных особенностей белкового состава и клеточной структуры с рекаль-цитрантным характером исследуемых семян.
Ключевые слова: Quercus юЬш Ь.; рекальцитрантные семена; белки семян; клеточные структуры; алейроновые зерна.
За последние три десятилетия в восточно-европейской части России значительно сократились площади дубовых лесов, причем процесс их деградации продолжается. Вследствие воздействия антропогенных и техногенных факторов и увеличения доли старовозрастных насаждений снизились показатели роста, продуктивность и жизнеустойчивость дубовых лесов [7-10]. В настоящее время в связи с массовым усыханием дубовых насаждений особую актуальность приобретает вопрос восстановления дубрав и сохранения их биологического и генетического разнообразия. Одним из важных моментов является создание лесосеменной базы Дуба черешчатого, которая бы позволила обеспечить не только потребности лесного хозяйства в семенном материале, но и являлась основой для сохранения и воспроизводства генетических ресурсов данной породы. Создание семенной базы дуба невозможно без знания особенностей физиологии семян.
Семена Дуба черешчатого ^пвтет robur Ь.) неустойчивы к высыханию, т. е. относятся к рекальцитрантному типу. После опадения зрелые семена сохраняют высокую влажность и требуют для успешного прорастания длительного периода холодной влажной стратификации. При падении влажности ниже 50 % семена теряют свою жизнеспособность.
1 Работа выполнена при частичной поддержке Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.
Одним из подходов к пониманию совокупности и последовательности молекулярных событий, обеспечивающих прорастание семян, является изучение свойств и метаболизма белков осевых органов в зависимости от физиологического состояния зародыша. До настоящего времени метаболизм белков в созревающих и прорастающих семенах рекальцитрантного типа был исследован очень мало. Почти нет данных о природе и картине белкового синтеза при созревании, покое и прорастании рекальцитрантных семян. Вместе с тем специфика этих семян, сохраняющих при завершении созревания и в период покоя высокую оводненность и неспособных противостоять дегидратации, может накладывать отпечаток на природу и метаболизм белков, на картину запасания и мобилизации белковых отложений. Имеются данные о том, что созревание рекальцитрантных семян Podocarpus hencelii [15] и Camelia sinenis [16] сопровождается накоплением запасных белков, в то время как в семенах Avicennia marina никакие специфические запасные белки не синтезируются, белковые тела не образуются, и картина белкового синтеза качественно не изменяется при переходе семян к прорастанию [17].
Ранее исследованы особенности белкового комплекса семян Каштана конского [2; 5], также относящихся к рекальцитрантному типу и обладающих глубоким физиологическим покоем. При этом обнаружены специфические черты белкового комплекса, которые отличают семена конского каштана от большинства ортодоксальных семян. Для семян дуба подобные данные в литературе отсутствуют. Целью настоящей работы было исследовать белки и субклеточную организацию осей и семядолей семян Дуба черешчатого и сравнить с семенами Каштана конского.
Объект и методы исследования. Зрелые семена Дуба черешчатого (Quercus robur L.) собирали после опадения с деревьев в дендрарии Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина Российской академии наук. В ряде опытов использовали семена, проклюнувшиеся после стратификации во влажном песке. Семена промывали водой, вручную отделяли зародышевые оси и семядоли и сразу использовали для анализа.
Влажность осей и семядолей определяли гравиметрическим методом.
Субклеточное фракционирование, получение белковых препаратов, электрофорез белков проводили так, как описано для семян каштана конского [2; 5].
Для световой микроскопии материал фиксировали в смеси 70-процентного спирта с формалином (97 : 3) и после обычной проводки и заливки в парафин срезы толщиной 10 мкм окрашивали бромфеноловым синим или толуидиновым синим. Первый краситель БФС — в виде 1-процентного раствора в насыщенном растворе сулемы в 96-процентном этаноле применяется для окраски белков семян [6]. Белковая часть алейронового зерна при этом окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Другую составную часть алейронового зерна — глобоид, состоящий в основном из фитина, обычно окрашивают 0,1-процентным раствором толуидинового синего в 30-процентном этаноле [11]. Глобоиды при этом
окрашиваются в синий цвет, в то время как белковая часть алейронового зерна остается неокрашенной. Препараты просматривали и фотографировали на микроскопе Olympus CX 41 с камерой Altra 20.
Результаты и обсуждение. Семена Дуба черешчатого (Quercus robur L.), так же как и семена Каштана конского (Aesculushippocastanum L.), относятся к рекальцитрантному (неустойчивому к высыханию) типу семян. Подобно семенам каштана, семена дуба содержат небольшое количество белка (см. табл. 1).
Таблица 1
Некоторые физиологические параметры зародышей семян Дуба черешчатого
Части зародыша Сырой вес одной оси, мг Влажность, % от сырого веса Общее содержание белка, % от сырого веса
Зародышевые оси, выделенные из свежеопавших семян 10,58 59,75 1,96
Семядоли свежеопавших семян - 45,60 0,52
Зародышевые оси из проклюнувшихся семян 90,0 2,80 -
При субклеточном фракционировании гомогената клеток, как зародышевых осей, так и семядолей семян дуба, во фракции клеточных структур (20 000 ^-осадок) обнаружено значительно больше белка, чем в аналогичной фракции из семян каштана. Полученные результаты позволили предположить присутствие белковых тел (алейроновых зерен) в зародышах семян дуба. Известно, что в ортодоксальных (высыхающих при созревании) семенах запасные белки откладываются в вакуолях клеток в виде алейроновых зерен (белковых тел) [12], которые при субклеточном фракционировании могли бы осаждаться вместе с фракцией клеточных структур.
В то же время электрофоретическое исследование не выявило в белковом комплексе как осей, так и семядолей семян дуба труднорастворимых сверхмажорных компонентов, которые могли бы претендовать на роль запасных белков (см. рис. 1). При цитологическом исследовании с помощью светового микроскопа и окрашивания парафиновых срезов бромфеноловым синим белковые тела в вакуолях не были обнаружены. Как и в клетках зародышей семян каштана [1], вакуоли клеток зародышевых осей и семядолей дуба выглядели оптически пустыми, бромфеноловый синий окрашивал только цитоплазму и клеточные ядра (см. рис. 2).
М 1 2
3
4
Рис. 1. Электрофореграммы белков зародышевых осей семян Дуба черешчатого: М — маркерные белки; 1, 2 — белки клеточного гомогената (1000 g — центрифугата); 3, 4 — белки субклеточных структур (20 000 g — осадка); 1 и 3 — белки зародышевых осей свежеопавших семян; 2 и 4 — белки зародышевых осей проклюнувшихся семян.
Окрашено Кумасси R-250
Рис. 2. Микрофотографии клеток семядолей зрелых семян Дуба черешчатого. Увеличение х 40. Окрашено бромфеноловым синим
Сходные особенности белкового состава и клеточной структуры семян каштана и дуба могут быть связаны с рекальцитрантным характером исследуемых семян [3], а также с необходимостью переносить в зимний период длительное охлаждение.
Литература
1. Азаркович М.И., Болякина Ю.П. Структурно-биохимические особенности клеток рекальцитрантных семян каштана конского // Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных: мат-лы Всероссийской конференции, посвященной 80-летию профессора А.Г. Юсуфова. Махачкала: ИПЦ ДГУ, 2010. С. 20-23.
2. Азаркович М.И., Гумилевская Н.А. Анализ белков семядолей зрелых семян конского каштана // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 711-720.
3. Азаркович М.И., Назаренко Л.В. Влияние семядолей и семенной кожуры на прорастание рекальцитрантных семян // Вестник МГПУ. Серия «Естественные науки». 2013. № 2 (12). С. 57-65.
4. Болякина Ю.П., Райхман Л.А. Структурные закономерности накопления белка в формирующихся семенах подсолнечника // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 3. С. 400-407.
5. Гумилевская Н.А., АзарковичМ.И., КомароваМ.Е., Обручева Н.В. Белки осевых органов покоящихся и прорастающих семян конского каштана: 1. Общая характеристика // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 5-17.
6. Иванов В.Б. О применении бромфенолового синего для количественного определения белка. 1. Влияние присутствия нуклеиновых кислот и использования фиксатора на связывание красителя // Цитология 1963. Т. 5. № 1. С. 112-116.
7. Каган Д.И., Ковалевич О.А., Ивановская С.И., БарсуковаМ.М. Генетический анализ деревьев дуба черешчатого с различными сроками цветения на лесосеменных плантациях // Леса Евразии — Брянский лес: мат-лы XI Международной конференции молодых ученых, посвященной 80-летию Брянской государственной инженерно-технологической академии и профессору В.П. Тимофееву (12-18 сентября 2011 г.) / Брянская гос. инженерно-технол. академия. М.: МГУЛ, 2011. С. 129-132.
8. Конашова С.И. Состояние и рост дубрав в восточноевропейской части России // Вестник Московского государственного университета леса. Лесной вестник. 2004. № 5. С. 89-93.
9. Маленко А.А., Ширяева Е.С. К вопросу о выращивании дуба черешчатого в сухой степи (Алтайский край) // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2013. № 8 (106). С. 54-58.
10. Мусиевская А.А., Мусиевский А.Л. Предварительные культуры и способы рубок в Шиповой дубраве // Леса Евразии — Подмосковные вечера: мат-лы X Международной конференции молодых ученых, посвященной 90-летию со дня основания Московского государственного университета леса и 170-летию со дня рождения профессора М.К. Турского (19-25 сентября 2010 г.). М.: МГУЛ, 2010. С. 101-104.
11. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во иностранной лит-ры, 1962. 962 с.
12. Соболев А.М. Запасание белка в семенах растений. М.: Наука, 1985. 112 с.
13. Холодова В.П., Болякина Ю.П., Бузулукова Н.П. Запасающие ткани // Атлас ультраструктуры растительных тканей. Петрозаводск: Карелия, 1980. С. 347-384.
14. Bewley D.J., Bradford K.J., Hilhorst H.W.M., Nonogaki H. Seeds. Physiology of Development, Germination and Dormancy. Third Edition. New-York, Heidelberg, Dordrecht, London: Springer, 2013. 392 p.
15. Dodd M.C., Staden J., Smith M.T. Seed development in Podocarpus hencelii Staf. — an Ultrastructural and Biochemical study// Ann. Bot. 1989. V. 64. P. 297-310.
16. Berjak P., Pammenter N.W., Vertucci C.W. Development Status, Desiccation Sensitivity and Water Properties in Embrionic Axes of Camelia sinenis // Comm. Electron Microscop. Soc. South Afr. 1991. V. 21. P. 71-71.
17. Farrant J.M., Berjak P., Pammenter N.W Proteins in Development and Germination of a Desiccation Sensitive (Recalcitrant Seed) Species // Plant Growth Regul. 1992. V. 11. P. 257-265.
Literatura
1. Azarkovich M.I., Bolyakina Yu.P. Strukturno-bioximicheskie osobennosti kletok rekal'citrantny'x semyan kashtana konskogo // Zakonomernosti rasprostraneniya, vos-proizvedeniya i adaptacij rastenij i zhivotny'x: mat-ly' Vserossijskoj konferencii, posvya-shhennoj 80-letiyu professora A.G. Yusufova. Maxachkala: IPC DGU, 2010. S. 20-23.
2. Azarkovich M.I., Gumilevskaya N.A. Analiz belkov semyadolej zrely'x semyan konskogo kashtana // Fiziologiya rastenij. 2006. T. 53. S. 711-720.
3. Azarkovich M.I., Nazarenko L.V. Vliyanie semyadolej i semennoj kozhury' na pro-rastanie rekal'citrantny'x semyan // Vestnik MGPU. Seriya «Estestvenny'e nauki». 2013. № 2 (12). S. 57-65.
4. Bolyakina Yu.P., Rajxman L.A. Strukturny'e zakonomernosti nakopleniya belka v for-miruyushhixsya semenax podsolnechnika // Fiziologiya rastenij. 1999. T. 46. № 3. S. 400-407.
5. Gumilevskaya N.A., Azarkovich M.I., Komarova M.E., Obrucheva N.V. Belki ose-vy'x organov pokoyashhixsya i prorastayushhix semyan konskogo kashtana: 1. Obshhaya xarakteristika // Fiziologiya rastenij. 2001. T. 48. S. 5-17.
6. Ivanov V.B. O primenenii bromfenolovogo sinego dlya kolichestvennogo opre-deleniya belka. 1. Vliyanie prisutstviya nukleinovy'x kislot i ispol'zovaniya fiksatora na svyazy'vanie krasitelya // Citologiya 1963. T. 5. № 1. S. 112-116.
7. Kagan D.I., Kovalevich O.A., Ivanovskaya S.I., Barsukova M.M. Geneticheskij analiz derev'ev duba chereshchatogo s razlichny'mi srokami czveteniya na lesosemenny'x plantaciyax // Lesa Evrazii — Bryanskij les: mat-ly' XI Mezhdunarodnoj konferencii molody'x ucheny'x, posvyashhennoj 80-letiyu Bryanskoj gosudarstvennoj inzhenerno-texnologicheskoj akademii i professoru V.P. Timofeevu (12-18 sentyabrya 2011 g.) / Bryanskaya gos. inzhenerno-texnol. akademiya. M.: MGUL, 2011. S. 129-132.
8. Konashova S.I. Sostoyanie i rost dubrav v vostochnoevropejskoj chasti Rossii // Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo universiteta lesa. Lesnoj vestnik. 2004. № 5. S. 89-93.
9. Malenko A.A., Shiryaeva E.S. K voprosu o vy'rashhivanii duba chereshchatogo v suxoj stepi (Altajskij kraj) // Vestnik Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2013. № 8 (106). S. 54-58.
10. Musievskaya A.A., Musievskij A.L. Predvaritel'ny'e kul'tury' i sposoby' rubok v Shipovoj dubrave // Lesa Evrazii — Podmoskovny'e vechera: mat-ly' X Mezhdunarod-noj konferencii molody'x ucheny'x, posvyashhennoj 90-letiyu so dnya osnovaniya Mos-kovskogo gosudarstvennogo universiteta lesa i 170-letiyu so dnya rozhdeniya professora M.K. Turskogo (19-25 sentyabrya 2010 g.). M.: MGUL, 2010. S. 101-104.
11. Pirs E'. Gistoximiya. M.: Izd-vo inostrannoj lit-ry', 1962. 962 s.
12. SobolevA.M. Zapasanie belka v semenax rastenij. M.: Nauka, 1985. 112 s.
13. Xolodova V.P., Bolyakina Yu.P., Buzulukova N.P. Zapasayushhie tkani // Atlas ul'trastruktury' rastitel'ny'x tkanej. Petrozavodsk: Kareliya, 1980. S. 347-384.
14. Bewley D.J., Bradford K.J., Hilhorst H.W.M., Nonogaki H. Seeds. Physiology of Development, Germination and Dormancy. Third Edition. New-York, Heidelberg, Dordrecht, London: Springer, 2013. 392 p.
15. Dodd M.C., Staden J., Smith M.T. Seed development in Podocarpus hencelii Staf. — an Ultrastructural and Biochemical study// Ann. Bot. 1989. V. 64. P. 297-310.
16. Berjak P., Pammenter N.W., Vertucci C.W. Development Status, Desiccation Sensitivity and Water Properties in Embrionic Axes of Camelia sinenis // Comm. Electron Microscop. Soc. South Afr. 1991. V. 21. P. 71-71.
17. Farrant J.M., Berjak P., Pammenter N.W Proteins in Development and Germination of a Desiccation Sensitive (Recalcitrant Seed) Species // Plant Growth Regul. 1992. V. 11. P. 257-265.
M. I Azarkovich, L.V. Nazarenko
Are There Aleurone Grains in Recalcitrant Seeds of Quercus robur L.?
By the methods of one-dimensional disc-electrophoresis and light microscopy the authors studied proteins of recalcitrant seeds of English oak (Quercus robur L. ). During the electrophoretic study in the protein complex of seeds the authors did not found major polypeptides that could claim to be the storage proteins. Light microscopy did not reveal in the vacuoles any formed aleurone grains or notable protein inclusions. In the article the relationship between found features of the protein composition and cell structure with recalcitrant nature of the investigated seeds is analyzed.
Keywords: Quercus robur L .; recalcitrant seeds; proteins of seed; cellular structures; aleurone grains.
