CC BY
24
СУПРАХОРОИДАЛЬНАЯ ИМПЛАНТАЦИЯ БИОДЕГРАДИРУЮЩЕГО ИМПЛАНТАТА «ММ-ГЕЛЬ» В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ (Экспериментальное исследование)
Шишкин М.М.1, Штильман М.И.2, УДК: 612.6.021.842.42:617.723-089.843
Юлдашева Н.М.1, Артюхов А.А.2
1 Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова;
2 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева
Резюме
На 18 кроликах породы «шиншилла» (36 глаз) изучены изменения органа зрения после супрахороидальной имплантации пористого полимера «ММ-гель», как носителя лекарственных веществ. На 3 сутки от начала введения полимера только у 3 животных (6 глаз) были отмечены признаки слабовыраженной воспалительной реакции со стороны радужки и сетчатки. Кратковременное угнетение показателей ретинограммы свидетельствовало о реакции ретинальной ткани на операционную травму. Результаты гистологического исследования свидетельствуют об отсутствии токсического действия полимера на внутренние структуры глаза экспериментальных животных.
Ключевые слова: супрахороидальная имплантация, полимер «ММ-гель», носитель лекарственных веществ.
SUPRACHOROIDAL IMPLANTATION BIODEGRADABLE POLIMERIC MATERIAL «MM-GEL», AS A DRUG-RELEASING IMPLANT (Experimental trials)
Shishkin M.M., Shtilman M.I.,
Juldasheva N.M., Artjuhov A.A.
On 18 «shinshilla» rabbits (36 eyes) were investigated clinical parameters and histological changes of the eye after suprachoroidal implantation of the polymer "MM-GEL”, as drug-releasing implants. In 3th day after introduction of polymer to experimental animals only 3 animals (6 eyes) had the attributes of ill-defined inflammatory reaction from an iris and retinas were marked. Short-term oppression of parameters of a reti nogram testified to reaction of a retinal tissue to an operational trauma. Results of histological research testify to absence of toxic action of polymer on internal structures of an eye of experimental animals.
Keywords: suprachoroidal implantation, polymer, drug delivery system.
Активно изучаемыми вопросами в лечении диабетической ретинопатии (ДР), являются методы адресной доставки лекарств к внутренним оболочкам глаза и создание в них оптимальных и безопасных концентраций препарата [15]. Сложность заключается в наличии различных офтальмологических барьеров и в быстрой элиминации препаратов из тканей глаза. Наиболее эффективными были признаны субтеноновый и интравитреальный пути введения препаратов. Однако при субтеноновом пути введения основным препятствием для проникновения лекарства внутрь глаза является склера [2, 6]. В то время как интравитреальное введение фармпрепаратов требует особых условий и сопряжено с риском серьезных осложнений. Мало изученным и менее безопасным по сравнению с интравитреальным представляется путь введения лекарственных веществ в супрахороидальное пространство [7, 12].
В отличие от традиционных методов введения лекарств (субконъюнктивальный, парабульбарный) транссклеральные методики требуют использования различных пролонгирующих устройств [6]. В настоящее время изучаются три основных варианта доставки фармпрепаратов в полость глаза: 1) имплантаты с системой микропор, способные постепенно выделять лекарственное вещество; 2) системы контролируемого выброса, включающие прибор дозатор и микрокатетеры; 3) наноформы лекарственных веществ [7, 8, 9].
Несмотря на увеличивающееся число исследований в данном направлении, полученные результаты носят предварительный характер, и проблема по-прежнему остается открытой. Основным недостатком имплантатов, вводимых в полость глаза, является матрица, которая не разрушается по мере отдачи фармпрепарата [11]. Применение систем контролируемого выброса требует длительного врачебного контроля и, как любой высокотехнологичный метод лечения, является дорогостоящим и мало доступным [7, 9]. Широкое внедрение нанотехнологий в практику лечения пациентов с патологией сетчатки и стекловидного тела является перспективой будущих лет [8].
На наш взгляд, среди всех исследований, проводимых в данном направлении, изучение полимеров, как носителей лекарственных веществ, представляется наиболее актуальным. Это объясняется уже существующими научными наработками, менее дорогостоящим процессом синтезирования этих химических соединений и наличием такого свойства как биодеградация. Однако именно это свойство во многом ограничивает клиническое использование многих из них. Причина в отсутствии сведений
о влиянии продуктов их распада на внутриглазные структуры.
Нами уже сообщалось о предварительных результатах в эксперименте исследования интравитреального введения биодеградирующего имплантата, образующегося непосредственно в среде живых тканей при
структурировании способного к сшиванию продукта модификации поливинилового спирта. К сожалению, вводимая в данном случае система, содержащая инициатор отверждения полимера оказала токсическое действие на внутренние структуры глаза.
Это дало нам основание для поиска альтернативных полимеров, способных выполнять функцию носителя лекарственного препарата при этом, не оказывая токсического действия на внутренние структуры глаза. В данной работе исследованы результаты имплантации в качестве носителя лекарственных веществ пористого сшитого поливинилового спирта («ММ-гель»), предназначенного для применения в медицине. Полимер был предварительно очищен от низкомолекулярных примесей и подвергнут стерилизации нагреванием (заявка на изобретение № 2006125842/15/028036). Согласно токсикологическому заключению №119-07 от 02.05.2007 (ФГУ «Всероссийский НИИИ медицинской техники РОСЗДРАВНАДЗОРА») полимерный материал «ММ-гель» обладает высокой биосовместимостью, продукты его распада нетоксичны.
Предварительные результаты клинических испытаний по применению полимера в торакальной хирургии с целью заполнения полостей в легочной ткани дали положительный результат [Протокол клинических испытаний пористого гидрогелевого материала «ММ-гель» на кафедре торакальной хирургии РМАПО №03-2270/0480 от 25.08.05].
Эти данные стали основанием для экспериментального исследования по применению пористого материала «ММ-гель» в качестве биодеградирующего имплантата для супрахороидальной имплантации подопытным животным.
Материал и методы
Материал - макропористый полимерный гидрогель «ММ-гель» (рис. 1) получен методом сшивки модифицированного поливинилового спирта (концентрация поли-
мера 5 масс.%) в присутствии инициирующей системы перекись водорода - аскорбиновая кислота и очищен кипячением в дистиллированной воде. Стерилизация была осуществлена автоклавированием (МУ 287-113 от 30.12.98).
Введение имплантата животным осуществляли в условиях общей анестезии. В области верхне-наружного квадранта глазного яблока выполняли разрез конъюнктивы и Теноновой капсулы. В 6 мм от лимба производили разрез склеры длиной 5 мм параллельно лимбу. Затем с помощью шпателя формировали тоннель в супрахорои-дальном пространстве соответственно размерам трансплантата. Производили парацентез передней камеры с постепенным дренированием влаги с целью профилактики офтальмогипертензии. Полимерную пластинку (5,0х3,0 мм х1,5мм) вводили в супрахороидальное ложе, склеру и конъюнктиву герметизировали узловым швом 8/0. В конъюнктивальную полость закладывали тетра-циклиновую мазь.
Объектом для экспериментального изучения действия материала «ММ-гель» стали 18 кроликов (36 глаз) породы «шиншилла» серой окраски, в возрасте 12-17 месяцев - группа I. Вес животных соответствовал 2,4-3,1 кг. Животным этой группы «ММ-гель» имплантировали супрахороидально.
Животным II группы - 3 кролика (6 глаз) - также под общим наркозом по выше описанной методике вводили препарат Остенил 0,3 мл (1% гиалуронат натрия). Известно, что данный препарат применяют в хирургии отслоек сетчатки для введения в супрахороидальное пространство в качестве пломбировочного материала. Доказано, что при этом отсутствуют воспалительная и токсическая реакции [10, 13]. Порода, возраст и окраска животных II группы соответствовали таковым же параметрам животных I группы.
Работу с экспериментальными животными проводили согласно требованиям нормативных документов
Рис. 1. Биодеградирующий материал «ММ-гель»: А - готовое изделие из полимера; Б - микрофотография материала
МЗ «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77) и «Санитарным правилам по устройству и содержанию экспериментально-биологических клиник» (Утвержденный главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973 №1045-73).
Клинические методы исследования: тонометрия, биомикроскопия и офтальмоскопия с линзами (60D) выполняли на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1, 2 и 3 месяца от начала эксперимента. Электроретинограмму регистрировали до имплантации полимера и на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1 месяц от начала эксперимента. Статистическую обработку данных проводили средствами программы AnalystSoft Biostat 2007.
Из эксперимента животных выводили передозировкой препарата «Наркотан» по три кролика в сроки 1, 3, 10 день и 1, 2 и 3 месяцы с выполнением энуклеации обоих глаз. В группе II забор материала осуществляли в сроки
1, 3 день и через 1 месяц. Материал фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида. Заливали в среду Аралдит-М. Ультратонкие срезы (1 мкм) выполняли на ультрамикротоме ККВ-4800 (131 срез) и окрашивали метиленовой синью и основным фуксином.
Результаты
Состояние животных сразу после имплантации удовлетворительное. Глаз спокоен. Среды прозрачные. Сетчатка прилежит на всем протяжении, кровоизлияний нет. В течение 3-5суток у животных обеих групп сохранялись гиперемия, отек конъюнктивы и беспокойство при пальпации через веко в области послеоперационной раны. На 3-10 сутки наблюдения появилась слабо выраженная пе-рикорнеальная инъекция у 3 животных (6 глаз) I группы. На 2-4 сутки отмечали незначительный отек радужки и сглаженность её рисунка в 23,3% наблюдений, которые самостоятельно купировались на 10 сутки. В стекловидном теле (СТ) в 10% наблюдений регистрировали слабую опалесценцию (1 степень по Nussenblatt R.B. et а1., 1985). При офтальмоскопии обнаружили незначительный отек по ходу вен на стороне имплантации в 40% наблюдений. Через 1 месяц все изменения сетчатки полностью исчезли. Только у 1 кролика (2 глаза) помутнение СТ несколько усилилось (2 степень по Nussenb1att R.B. et а1., 1985). На 3 месяц наблюдения у 2 кроликов (30%) в зоне имплантации при склеропрессии отмечали зону перераспределения пигмента. У животных группы II в зоне имплантации в сроки 3-10 дней отмечали побледнение сетчатки. А спустя 1 месяц при склеропрессии выявляли локальную депигментацию над имплантированным материалом.
Контроль внутриглазного давления (ВГД) у животных I группы выявил тенденцию к постепенному его повышению в течение первых 3 дней до 19,9±2,66 мм рт. ст. (р=0,-05), с колебаниями 12-25 мм рт.ст. (норма 12-20 мм рт.ст.), что связано, на наш взгляд, с некоторым набуханием полимера. На 10 день ВГД нормализовалось (18,1±2,08 мм рт.ст). У животных в группе II также отмечали повышение ВГД
в 1-3 сутки после вмешательства, к 10 суткам давление у всех животных нормализовалось (рис. 2).
На ЭРГ у животных группы I выявили умеренное снижение амплитуды а-волны (до 84-79% от исходных значений) и Ь-волны (до 75-84%) в 1 сутки после введения полимера. На 3-10 сутки наблюдали картину слабовы-раженной гиперреакции (а-волна - 114-123% и Ь-волна до 110-116% от исходного уровня) (рис. 3, 4). К концу 1 месяца исследования у животных экспериментальной группы отмечалась лишь незначительная депрессия а-волны ретинограммы (рис. 3).
Изменения ЭРГ мало отличаются друг от друга у животных I и II групп. Депрессию а- и Ь-волн ЭРГ, зарегистрированную у животных обеих групп в 1 сутки после имплантации, можно считать ответной реакцией на хирургическое вмешательство. Увеличение амплитуды а- и Ь-волн на 3-10 сутки, связано с раздражающим воздействием нейромедиаторов в ответ на гибель клеточных структур в зоне имплантации, однако быстро наступающая стабилизация показателей свидетельствует об обратимости возникших повреждений ретины [3]. Показатели ЭРГ животных с супрахороидальной имплантацией полимера «ММ-гель-Ф» спустя 1 месяц совпадают с показателями ЭРГ животных с введением натрия гиалуроната.
25_,
18,7 1^8^* 16,7 17'9 20,4 19,9 18,9 18,1 17,4 17.1 16,3
15,7 14,8 15,2
і . і исходное 1 сут Зсут ' 10 сут 1 мес 2 мес 3 мес
"ММ-гель- натрия гиалуронат
Рис. 2. Динамика показателей внутриглазного давления у животных после супрахороидальной имплантации материала «ММ-гель»
%
Рис. 3. Динамика a-волны ЭРГ после супрахороидальной имплантации полимера «ММ-гель-Ф».
Примечание: Вследствие малого количества наблюдений и большого разброса показателей данные на графиках представлены в процентах от исходных значений амплитуд волн ЭРГ (в контрольных точках медиана).
%
Рис. 4. Динамика Ь-волны ЭРГ после супрахороидальной имплантации материала «ММ-гель»
По данным световой микроскопии у животных
I группы изменения дренажной зоны отсутствовали (рис. 5А). На гистологических срезах препаратов радужки на 1-3 сутки отмечено незначительное сужение просвета капилляров (рис. 5Б). Сетчатка и хороидея в зоне имплантации слегка приподняты над полимером, вследствие его набухания. Отмечали дезорганизацию рецепторного и наружного ядерных слоев. Структура внутренних слоев на препаратах не изменена (рис. 6А). Полимер (1 сутки) на препаратах выглядел как плотно упакованные разноориентированные волокна (рис. 7А, Б), окрашенные в темно-синий цвет. На препаратах хороидеи отмечали расширение просвета артериол. На гистологических срезах к 10 суткам в краевой зоне ткани окружающей полимер отмечали зону с единичными макрофагами и фибробластами, а также формирующиеся сосуды (рис. 6Б). Среди синих волокон полимера отмечали участки, увеличенные в объеме и пропитанные плазмой (розоватого оттенка) (рис. 7 А, Б, В). По краю резорбируемого полимера обнаружили крупные клетки со светлым ядром. Признаков скопления субретинальной жидкости не отмечено.
Через 1 месяц на гистологических срезах по периферии полимера отмечали зоны частичного распада и замещения, хотя формирования соединительнотканной капсулы не отмечено. На отдельных участках, контактирующих с полимером, наблюдали легкое уплотнение волокон склеры (рис. 7А). Спустя 2 месяца, на гистологических срезах 1/2 часть площади полимера в стадии плазматического пропитывания и эрозии (рис. 7Г). Вокруг полимера обильная сеть кровеносных сосудов с околососудистой клеточной инфильтрацией. Спустя 3 месяца на препаратах отмечали почти полную деградацию полимера и замещение его рыхлыми волокнами соединительной ткани, с единичными макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами. Отмечали единичные островки эрозированного полимера и сосуды. В отдельных случаях в ретине выявлены участки разрушения пигментного эпителия. В интактной зоне сетчатка сохраняла свою клеточную структуру (рис. 6В). Признаков отслоения сетчатки и сосудистой оболочки
не обнаружено ни в одном случае, как и повреждения зрительного нерва.
У животных группы II в зоне введения натрия гиа-луроната в супрахороидальное пространство обнаружена атрофия пигментного эпителия сетчатки над зоной введения.
Результаты гистологического исследования дополняют приведенные ранее клинико-функциональные наблюдения и свидетельствуют о минимально допустимых патологических изменениях во внутренних структурах глаза экспериментальных животных при имплантации супрахороидально материала «ММ-гель».
Обсуждение
Предварительные результаты выполненных исследований свидетельствуют о том, что материал «ММ-гель», имеющий форму пластинки достаточно легко им -плантируется в супрахороидальное пространство. Сама процедура имплантации хорошо контролируется, малотравматична и, при необходимости, может повторяться ещё до 3 раз. Риск развития ятрогенных осложнений (повреждение хрусталика, пролиферативная витреоре-тинопатия, эндоофтальмиты) значительно ниже, чем при часто повторяющихся интравитреальных инъекциях Нахождение полимера в супрахороидальном пространстве хорошо переносится глазом животных и не сопровождается заметными клиническими осложнениями. Небольшая зона перераспределения пигмента над зоной имплантации не сопровождалась атрофией пигментного эпителия, как при введении натрия гиалуроната в супрахороидальное пространство. Наличие макрофагов вокруг полимерной пластинки свидетельствует в пользу его биологической деградации и объясняет отсутствие признаков разрушения «ММ-геля» при нахождении в физиологическом растворе. Имплантация материала «ММ-гель» не вызывала скопления субретинальной жидкости и ни в одном случае не вызвала отслойки сосудистой оболочки. Это еще раз подтверждает безопасность данного метода имплантации носителя фармпрепаратов. Тесный контакт полимера с хороидальной тканью не сопровождался формированием соединительнотканной капсулы, что необходимо для обеспечения быстрого проникновения фармпрепаратов в хороидальный кровоток. Постепенная биодеградация полимера в течение 2-3 месяцев дает возможность не только максимально приблизить фармпрепарат к внутренним оболочкам глаза, но и длительно поддерживать его терапевтическую концентрацию.
Таким образом, результаты клинико-функциональных наблюдений за экспериментальными животными и морфологических исследований свидетельствуют об отсутствии токсического воздействия материала «ММ-гель» на ткани глаза при супрахороидальной имплантации. Материал «ММ-гель» может быть использован как биодеградирующий носитель лекарственных веществ.
Рис. 5. Гистологический срез тканей глаза животных с супрахороидальной имплантацией материала «ММ-гель»: А - область угла передней камеры (1) и цилиарного тела (2) ув. х40; Б - ткань радужки, ув. х100. Окраска - метиленовая синь и основной фуксин
Рис. 6. Гистологический срез тканей глаза. А - полимер в супрахороидальном простарнстве (указ. стрелкой) ув. х10 (10 сутки), Б - формирование сосуда вокруг полимера, ув. х100 (10 сутки). Окраска: основной фуксин и метиленовая синь
Литература.
1. Shtilman M.I., Artyukhov A.A., Zolotaikina T.S., Korshak A.Yu., Gorchakov A.V., Tsatsakis A.M. Crosslinked macroporous polymeric hydrogels of polyvinyl alcohol: a study of the influence of the synthesis conditions. International Polymer Science and Technology, 2006, Vol 33, № 10. P. 25-29.
2. Басинский С.Н. Способ адресной доставки лекарственных препаратов в лечении дистрофических состояний глаз // Клиническая офтальмология. - 2004.
- Т. 5, №1. - С. 5-7.
3. Шамшинова А.М., Волков В.В. Функциональные методы исследования в офтальмологии. - М.: Медицина, 1999. - 416 с.
4. Bajpai A.K., Saini R. Designing of macroporous biocompatible cryogels of PVA-haemoglobin and their water sorption study // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2009.
- May 20.
5. Chu K.C., Rutt B.K. Polyvinyl alcohol cryogel: an ideal phantom material for MR studies of arterial flow and elasticity // Magn. Reson. Med. 1997. - Feb; 37(2): 314-9.
6. Del Amo E.M., Urtii A. Current and future ophthalmic drug delivery systems // Drug Discov. Today. - 2008. - Vol. 13, N3-4. - P. 135-143.
7. Eljarrat-Binstock E., Raiskup F., Frucht-Pery J. et al. Transcorneal and trans-scleral iontophoresis of dexomethasone phosphate using drug loaded hydrogel // J. Control Release. - 2005. - Vol. 106, N3. - P. 386-390.
8. Hastings M.S., Li S.K., David J. et al. Visulex: Advancing Iontophoresis for Effective Noninvasive Back-of-the-Eye Therapeutics // Drug Delivery Technology.
- 2007.
9. Lee S.W., Seo J.M., Ha S. et al. Development of Microelectrode Arrays for Artificial Retinal Implants using Liquid Crystal Polymers // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
- 2009. - Jun 24.
10. Mittl R.N., Tiwari R. Suprachoroidal injection of sodium hyaluronate as an «internal» buckling procedure // Ophthalmic. Res. - 1987. - Vol.19. - P. 255-260.
11. Mohammad D.A., Sweet B.V., Elner S.G. Retisert: Is the New Advance in Treatment of Uveitis a Good One? //The Annals of Pharmacotherapy. - 2007. - Vol. 41, №3. - P. 449-454.
12. Olsen T.W., Feng X., Wabner K. et al. Cannulation of the suprachoroidal space: a novel drug delivery methodology to the posterior segment // Am. J. Ophthalmol.
- 2006. - Vol. 142, N5. - P. 777-787.
13. Poole T.A., Sudarsky R.D. Suprachoroidal implantation for the treatment of retinal detachment // Ophthalmology. - 1986. - Vol.93. - P. 1408-1412.
14. Tzekov R. Abelson M.B., Dewey-Mattia D. Recent Advances in Back of the Eye Drug Delivery // Retina Today. - 2009. - Vol. 4, №4. - P. 46-50.
Рис. 7. Гистологический срез тканей глаза животных I группы. Эволюция полимера в супрахароидальном пространстве: 1 - неизмененные волокна полимера, 2 - волокна полимера в стадии плазматического пропитывания, 3 - волокна полимера в стадии эрозирования. А - полимер через 10 дней после имплантации, Б - полимер через 1 месяц после имплантации, В- полимер через 2 месяца после имплантации, Г - полимер через 3 месяца после имплантации. Окраска метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение х100.
Контактная информация
Шишкин М.М.
Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова 105203, г. Москва, ул. Нижняя Первомайская, д. 70
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
