CC BY
99
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 22009 (выпуск 2)
ЛАБОРАТОРНЫЕ И
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 543.068.8 - 615.077
А.П. Асташкина, А.А. Бакибаев, А.Ю. Яговкин, О.В. Шарахова
E-mail: apa2004@mail.ru
СУБСТРАТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
ГОУ ВПО «Томский политехнический университет»
ВВЕДЕНИЕ
В современном ритме жизни организм человека подвергнут различным неблагоприятным техно-, био- и социогенным факторам, которые негативным образом сказываются на состоянии здоровья. Широко распространенным заболеванием является нарушение микробиоценоза, который играет значительную роль в патогенезе различных заболеваний [1, 2]. Лактобактерии как важнейшие представители нормального микробиоценоза человека давно и широко применяются для коррекции дисбиозов кишечника и родовых путей [3].
Организация массового производства пробиотиков в виде порошков связана с решением ряда технологических проблем, обусловленных спецификой физических свойств лиофилизированной бактериальной массы [4]. Поэтому разработка методов контроля качества биотехнологических процессов готовой продукции является актуальной задачей.
В настоящей работе предлагается использовать ранее разработанный субстратный способ [5] для кондуктометрического определения суммарной ферментативной активности лиофилизированной биомассы лактобактерий. При внесении в анализируемую культуральную среду субстрата, например, моно-или дисахарида, который легко поглощается культурой и претерпевает ферментативное расщепление, происходит активизация различных биохимических превращений, электропроводность культуральной среды изменяется за счет образования электрохими-
46
чески активных веществ [6]. Конечным продуктом метаболизма этих грамположительных неподвижных бактерий является Э- и Ь-молочная кислота. Электрические свойства субстратов и продуктов метаболизма отличаются, следовательно, электропроводность анализируемой культуральной среды изменяется пропорционально скорости ферментативных превращений.
Цель работы - исследование суммарной ферментативной активности лиофилизированной биомассы лактобактерина субстратным способом.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для определения электропроводности использовали стандартный кондуктометр.
Для экспериментов использовали лиофилизи-рованный препарат «Лактобактерин сухой» производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г. Томск НПО «Вирион». Препарат хранили при температуре не выше 10°С.
Содержимое флакона (5 доз) разводили в 15 мл дистиллированной воды комнатной температуры, в 1 мл образца содержится (0,7-1,3)х109 живых лактобактерий.
В качестве субстратов были выбраны следующие углеводы: глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза, ара-биноза. В качестве основных продуктов ферментации глюкозы, фруктозы соответственно выступают: углекислота, манит и молочная кислота [7]. Изменение электропроводности культуральной среды фиксировали через каждые 15 с в течение 900 с. Субстрат вносили в анализируемый образец через 300 с.
Для исследования жизнедеятельности лактобактерий в молоке, в колбы с 240 мл молока добавляли лиофилизат лактобактерина сухого и плотно закрывали крышкой. Анализируемый образец содержал не менее 1,25х108 живых лактобактерий. Колбы с анализируемым образцом хранили при температуре не выше 10°С. Суммарную ферментативную активность по глюкозе [5] определяли 1 раз в сутки в течение 8 дней.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Cуммарная ферментативная активность лактобактерий по отношению к субстратам углеводного типа.
Скорость утилизации и метаболизм клетками субстрата зависит от видовых и биохимических свойств лактобактерий и природы субстратов. На рисунке 1 представлены изменения суммарной ферментативной активности исследованного препарата лактобактерий при внесении субстратов углеводного типа. Как видно из представленных данных, наибольшая скорость ферментативного расщепления наблюдается при утилизации глюкозы и фруктозы. Этот результат можно объяснить тем, что продуктом метаболизма глюкозы являются угольная и молочная кислоты, которые значительно изменяют электропроводность анализируемой культуральной среды
А.П. Асташкина, А.А. Бакибаев и др.
СУММАРНАЯ ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
4.5 Е-*
4 Е-1 | 3.5 Е -1 § ЗЕ*1 ш 2.5 Е-* 5
О 2Е-* 2
< 1.5 Е-1 § 1 Е-1
5 Е-1
V. V. ■ ■
■ ш V. Я ■ 1 ■ ■ ■ ■ Я 1
V» ■ ■ Wi ■ ■ ■
v! ■ ■ ■
■ ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■
v: ■ ■ 1 ■ ■ ■
■ ■ ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■W ■ ■ і f^l Fxl m
глюкоза 1 фруктоза сахароза | лактоза | арабиноза
субстрат
Рис. 1. Суммарная ферментативная активность лактобактерий по различным субстратам
за время эксперимента. Утилизация дисахаридов (сахароза, лактоза) протекает с меньшей скоростью.
Суммарная ферментативная активность (СФА) лактобактерий по различным субстратам отличается и имеет хорошую воспроизводимость (не более 5%). Таким образом, совокупность СФА по различным субстратам может быть использована для идентификационного параметра препарата «Лактобактерин сухой».
Исследование жизнедеятельности лактобактерий в молоке.
Для выяснения возможности мониторинга контроля качества кисломолочных продуктов нами была исследована жизнедеятельность лактобактерий в модельной молочной среде по глюкозе (рис. 2).
Рис. 2. Зависимость изменения скорости электропроводности в процессе жизнедеятельности лактобактерий в молоке при внесении глюкозы
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что предложенный кондуктометрический субстратный способ пригоден для экспресс-контроля качества кисломолочных продуктов, содержащих лактобактерии.
Таким образом, предложен экспресс-метод, позволяющий определить суммарную ферментативную активность (СФА) лактобактерий по отношению к субстрату. Совокупность СФА по различным субстратам является идентификационной характеристикой анализируемой культуры. Метод представляет собой ценность для пищевой промышленности и биотехнологии. С помощью предложенного метода можно производить контроль качества продуктов или полупродуктов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Молокеев А.В., Криницина Э.В., Ильина РМ. Рецепту-ростроение комплексных эубиотиков, адекватных возрастному микробиоценозу человека // Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека: Тез. докл. науч. конф. 21-23 апреля 1999 г. - М., 1999. - С. 34-35.
2. Бойцов А.Г., Лифляндский В.Г. Как победить дисбактериоз у детей и взрослых. М., изд. Олма-Пресс. - 2002. - 132 с.
3. Фармакопейная статья предприятия 42-0135-2415-02 «Лактобактерин сухой».
4. Семченко А.В. Технологические аспекты разработки и совершенствования лекарственных форм лактобакте-рина: Автореф. дис. ...канд. фарм. наук: 15.00.01/ Перм. гос. фарм. акад. Росздрава. - П., 2008. - 23 с.
5. Асташкина А.П., Яговкин А.Ю., Бакибаев А.А. Субстратный способ определения суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток //Вестник Казанского технологического университета. - 2009. - № 3.
6. Биотехнология: Учебник / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др. Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. С-Пб.: ГИОРД, - 2005. - 792 с.
7. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.Т.1. М. - Изд. Грантъ, 1998.
SUBSTRATE METHOD OF DETERMINING TOTAL FERMENTATIVE ACTIVITY OF LACTOBACTERIA
A.P. Astashkin8, A.A. Bakibayev, A.Yu. Yagovkin, O.V. Sharakhova
SUMMARY
Total fermentative activity of lactobacteria of «Lactobacterin» specimen was measured by conduc-tometric substrate method. The influence of sensitive of lactobacteria preparation «Lactobacterin» was investigated. Total fermentation activity of lactobac-teria preparation «Lactobacterin» in milk medium to glucose was investigated.
Key words: conductometric method, substrate, serum activity, lactobacteria.
