CC BY
14
УДК 577.15.02
СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ДРОЖЖЕЙ Trigonopsis variabilis, ЭКСПРЕССИРОВАННОЙ В КЛЕТКАХ E. coli
C.C. Савин, И.В. Чернышев, В.И. Тишков, С.В. Хороненкова
(кафедра химической энзимологии; e-mail vit@enz. chem. msu. ru)
Осуществлена экспрессия оксидазы D аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках E. coli в виде растворимого и активного фермента. Изучена субстратная специфичность рекомбинантного фермента и определены кинетические параметры с несколькими аминокислотами. Разработаны и оптимизированы методики определения высоких и низких концентраций рекомбинантной оксидазы D аминокислот по ферментативной активности.
Оксидаза D-аминокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO) является флавинсодержащим ферментом. Она катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты с образованием аммиака и восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода. Этот фермент представляет значительный интерес для биотехнологии, так как может быть использован при получении 7 аминоцефа-лоспорановой кислоты из цефалоспорина С [1, 2]. Данная стадия является ключевой для синтеза полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков различных поколений. Оксидаза D-аминокислот все в более широких масштабах используется для получения неприродных L-аминокислот [3] и а-кетокислот [4], а также в биосенсорах [5-7] для детекции D-аминокислот в различных биологических образцах. Оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) является наиболее перспективным для практических целей ферментом из-за своей повышенной активности и стабильности в сравнении с DAAO из других источников [8-10].
Аналитическое применение DAAO в биосенсорах определяется главным образом субстратной специфичностью фермента. В литературе имеется достаточное количество данных по этому вопросу [9-11], однако результаты разных авторов противоречивы. Это может быть связано, во-первых, с разными методами и условиями определения активности фермента, во-вторых, с разной концентрацией растворенного кислорода, максимальная величина которой (0,21 мМ) при 37°С, рН 8,0 и при обычном давлении ниже, чем значение константы Михаэлиса фермента (Км) по кислороду (0,72 мМ для TvDAAO) [9].
Следует отметить, что для образцов DAAO, полученных из разных источников, наблюдается значительное различие в спектрах субстратной специфичности, что может быть использовано для селективного определения концентрации отдельных D-аминокис-лот в образцах на основе мультибиосенсора. В настоящее время на практике используют, как правило, не природные ферменты, а их мутантные формы с улучшенными свойствами (активность, стабильность). Чем более чувствительной будет методика определения активности, тем меньшее количество мутантного фермента потребуется для анализа и тем дешевле обойдется поиск новых мутантов, поскольку получение десятков тысяч мутантов и их скриниг - очень дорогая процедура. Оксидаза D-аминокислот - высокоактивный фермент, который легко детектируется различными методами при низких концентрациях (не более 0,05% от общего белка клетки), однако анализ высоких концентраций фермента без предварительного разбавления невозможен. При проведении единичных анализов процедура разбавления не является определяющим фактором, тем не менее в случае систематических анализов по определению DAAO в высоких концентрациях временные и денежные затраты на процедуру разбавления становятся существенными. Подобная ситуация наблюдается, например, при оптимизации культивирования рекомбинантных штаммов - продуцентов DAAO или при очистке фермента.
В предлагаемой работе была исследована субстратная специфичность оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, экспрессированной в клетках E. coli, а также предложены и оптимизирова-
ны методики определения высоких и низких концентраций рекомбинантного фермента.
Экспериментальная часть
Экспрессия гена daao. Для экспрессии целевого белка была использована плазмида pKanDAAO, полученная клонированием гена daao по сайтам рестрикции Ncol и BamHI в экспрессионный вектор рЕТЗЗЬ [12]. Трансформацию клеток E. coli плазмид-ной ДНК проводили согласно методу [1З]. Для экспрессии гена daao использовали штамм E. coli BL21(DE3)/pLysS Codon Plus ("Novagen", США). Клетки культивировали при комнатной температуре (22°С) на 2*YT среде (16 г/л бактотриптона и 10 г/л дрожжевого экстракта фирмы "Difco" (США), 1,5 г/л дигидрофосфата натрия, 1 г/л хлорида натрия, 1 г/л гидрофосфата калия и 1% глицерина фирмы "Fluka/BioChemika" (Швейцария), рН 7,5). Индукцию осуществляли добавлением IPTG (изопропил^^-тио-галактозид) фирмы "Sigma" (США) до конечной концентрации 1,0 мМ при плотности клеток на 600 нм A600 = 1,0. Культивирование прекращали после достижения постоянной величины поглощения при 600 нм при 22 °С.
Очистка рекомбинантной TvDAAO. Очистка включала термообработку при 45 °С в течение 10 мин, ионобменную хроматографию на колонке "MonoQ" ("PharmaciaBiotech", Швеция) и гель-фильтрацию на колонке "Sephacryl S 200" ("PharmaciaBiotech", Швеция). Чистота полученных ферментных препаратов составила не менее 95%, выход по активности - 85%.
Определение активности DAAO. Для определения активности оксидазы D-аминокислот по выделению пероксида водорода использовали пероксидазу из корней хрена (ПХ) ("Reanal", Венгрия) и ее субстрат ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)) фирмы "Sigma" (США). В качестве субстрата для DAAO использовали различные D-аминокислоты ("Reanal", Венгрия). В кювету спектрофотометра (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см) добавляли раствор D-аминокислоты в 50 мМ калий-фосфатном буфере (КФБ), 20 мкл раствора ABTS (16 мг/мл) в воде, 10 мкл раствора пероксидазы в 50 мМ КФБ (1000 Ед/мл) и насыщенный кислородом 50 мМ КФБ (рН 8,0) до общего объема 980 мкл. После термостатирования в течение 10 мин добавляли 20 мкл фермента. Определение проводили при З0°С по накоплению продукта окисления ABTS на длине волны 414 нм (&414= 36000 М^см-1) на спектрофотометре "Shimadzu 1601PC".
Определение кинетических параметров реакции DAAO. Для определения величин максимальной скорости реакции и константы Михаэлиса концентрацию соответствующей D-аминокислоты варьировали в диапазоне 0,5-5,0 Км. Приблизительное значение Км определяли в отдельном эксперименте, измеряя скорость реакции при концентрациях D-аминокислоты 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10 мМ. Зависимость скорости реакции от температуры определяли при насыщающей концентрации D-триптофана (10 мМ) и D-метионина (10 мМ) при температурах 20, 25, 30 и 37°С. Зависимость кинетических свойств от рН среды изучали, измеряя величи-Vm и Км при значениях рН 7,0, 8,0 (50 мМ КФБ буфер) и 9,0 (50 мМ Трис-НС1). Значения рН определяли на рН-метре "Эксперт-001" ("Эконикс-экс-перт", Россия) с точностью до 0,05 ед. рН при температуре 30°С. Градуировочный график получали из зависимости активности фермента от его концентрации при насыщающей концентрации D-аминокислоты (30°С, рН 8,0). Значения активности при каждой концентрации измеряли не менее 3 раз, а на границах и в середине диапазона определение проводили по 5 раз.
Величины Vm и Км определяли как результат нелинейной регрессии зависимости скорости реакции от концентрации D-аминокислоты с помощью программы "Origin Pro 7,5", позволяющей оценить также и ошибки расчета параметров.
Обсуждение результатов
Для определения активности DAAO использовали дополнительную реакцию восстановления образующегося пероксида водорода при сопряженном окислении ABTS, катализируемую пероксидазой из корней хрена:
AAO
D-аминокислота + O2 ^ а-кетокислота + NH+4 + H2O2, lö
H2O + ABTS ^ окисленный ABTS (Хмкс = 414 нм) + Н^Э.
Перед изучением субстратной специфичности ре-комбинантного фермента было решено провести оптимизацию условий определения активности, так как выбор неоптимальных условий может быть причиной расхождения с данными других авторов.
На точность определения оксидазы D-аминокислот может влиять большое количество факторов. Во-первых, тип D-аминокислоты. Для достижения наибольшей чувствительности следует использовать такую D-аминокислоту, при которой активность фермента является максимальной, тогда как в случае высоких концентраций DAAO, наоборот, следует использовать D-аминокислоту, при которой активность фермента
минимальна. Величина константы Михаэлиса должна быть наименьшей, поскольку в таком случае можно использовать низкие концентрации субстрата и в конечном итоге сократить стоимость анализа.
Вторым важным фактором является точность дозирования растворов, используемых при определении активности. Ошибка измерения будет зависеть как от точности добавления растворов, так и от возможного изменения скорости реакции при изменении концентрации субстратов и ферментов, возникающего за счет ошибки дозирования. В настоящее время на практике широко используются автоматические пипетки с переменным объемом. Точность таких пипеток составляет 1-2%. Для проведения анализа требуется смешать пять компонентов: два раствора субстратов (D-аминокислота и ABTS), два раствора ферментов (DAAO и ПХ) и раствор буфера. Таким образом, только за счет операций дозирования ошибка определения будет составлять не менее 2,4-4,5%. Кроме того, поскольку скорость ферментативной реакции зависит от концентраций фермента и субстрата, на точность измерения будут влиять изменения в концентрации субстратов (D-аминокислоты и ABTS), полученные за счет ошибки дозирования. Этот фактор может быть нивелирован при использовании "насыщающих" концентраций субстратов (i20-25 Км), что следует непосредственно из уравнения Михаэлиса-Ментен.
Вначале была проведена оптимизация условий реакции, катализируемой пероксидазой хрена. Для корректной детекции активности DAAO образующийся в основной реакции пероксид водорода не должен накапливаться в реакционной среде, поэтому необходимо подобрать оптимальную концентрацию ПХ. Обычно в подобных системах активность второго фермента должна превышать активность основного фермента, как правило, в 10 раз. В зависимости от константы Михаэлиса эта величина может возрасти еще больше. Теоретический расчет показывает, что максимальная величина активности DAAO с помощью выбранной методики не должна превышать 1 ед. активности. При больших значениях активности скорость изменения поглощения раствора будет более 1 ед. поглощения за 10 с, что делает невозможным ее точное определение. Поэтому было решено использовать при анализе 10 ед. активности пероксида-зы. Было установлено, что в присутствии ~1 ед. активности DAAO при использовании 10 (и выше) ед. активности ПХ, активность пероксидазы постоянна (рис. 1).
Вторым этапом была оптимизация концентрации ABTS. Для обеспечения максимальной активности ПХ необходимо работать с "насыщающими" концентрациями ABTS. Из литературы известно, что активность пероксидазы хрена не зависит от концентрации ABTS0 (32 мг/мл). Как следует из табл. 1, в случае биферментной системы величина наблюдаемой активности DAAO была постоянна при концентрации ABTS в кювете >0,32 мг/мл.
Таким образом, для определения активности ре-комбинантной TvDAAO необходимо использовать количество пероксидазы хрена не менее 10 ед., а концентрация ABTS в кювете >0,32 мг/мл.
В табл. 2 представлены кинетические параметры для реакции рекомбинантной TvDAAO с различными D-аминокислотами, полученные нами при оптимизированных условиях определения. Из табл. 2 видно, что наибольшим сродством рекомбинантный фермент обладает к субстратам с большим гидрофобным радикалом (D-триптофан, D-фенилаланин, D-метионин и D-лейцин). Для сравнения в этой же таблице приведены данные других авторов по субстратной специфичности TvDAAO.
Наиболее высокая активность фермента наблюдается с D-метионином и D-валином. Эти D-аминокис-лоты более других подходят для определения низких концентраций рекомбинантной TvDAAO. Однако в случае D-валина наблюдается высокое значение КМ, т.е. для работы в режиме "насыщения" концентрация этого субстрата в реакционной смеси должна быть порядка 0,35 М, что существенно превосходит его растворимость (0,22 М). Таким образом, D-валин не подходит для проведения анализов образцов с низкой
Рис. 1. Зависимость активности DAAO с D-метионином от количества пероксидазы в реакционной смеси (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 8,0; 10 мМ D-метионин, 0,32 мг/мл ABTS)
Т а б л и ц а 1
Зависимость активности рекомбинантной TvDAAO от концентрации ABTS
Концентрация ABTS в кювете, мг/мл Активность TvDAAO, нмоль/мин
0,16 0,58 ± 0,01
0,32 0,79 ± 0,02
0,48 0,78 ± 0,02
0,64 0,80 ± 0,03
концентрацией ТуБААО. Б-метионин, напротив, имеет низкое значение КМ и его концентрация в реакционной смеси должна составлять -10-15 мМ. Для определения высоких концентраций рекомбинантной ТуБААО необходимо использовать субстрат с наименьшей максимальной скоростью и минимальным
значением КМ (в силу ограниченной растворимости большинства Б-аминокислот). Для этих целей был выбран Б-триптофан, который имеет величину КМ в 30-80 раз меньшую, чем другие "плохие" субстраты БААО (пролин и треонин). В отдельных экспериментах было показано, что изменение рН в диапазоне 7,0-9,0 не оказывает влияния на активность фермента с Б-метионином и Б-триптофаном (табл. 2).
При оптимизации методик определения низких и высоких концентраций ТуБААО была исследована зависимость активности фермента от температуры. Эта зависимость имеет довольно сложный вид. Например, при повышении температуры с 30 до 37°С происходило снижение наблюдаемой скорости реакции, связанное, по-видимому, с уменьшением растворимости кислорода. В качестве оптимальной была выбрана температура 30°С. При более низких температурах снижается чувствительность определения, тогда как при более высоких время термостатирова-ния увеличивается. На рис. 2 представлена зависи-
Т а б л и ц а 2
Значения константы Михаэлиса и максимальной скорости для рекомбинантной TvDAAO с некоторыми D-аминокислотами (50 мМ КФБ, 30° С, рН 8,0). Для D-метионина и D-триптофана приведены значения кинетических параметров при рН 7,0, 8,0 (50 мМ КФБ), рН 9,0 (50 мМ Tris HCl)
D-аминокислота Km, мМ Vm, мМ/мин Относительная активность*, %
данная работа [10] [9]
D-метионин pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0 0,58±0,02 0,46±0,04 0,44±0,04 4,56±0,08 4,60±0,10 4,40±0,20 100 78 100
D-аланин 9,7±0,8 2,51±0,08 50 97 32
D-валин 17,7±0,4 4,51±0,05 89 100 39
D-лейцин 0,78±0,06 1,70±0,08 34 32 30-40
D-пролин 26±6 0,27±0,02 5 25 2
D-треонин 10,0±1,6 0,25±0,02 5 4 30-40
D- фенилаланин 0,40±0,04 2,00±0,09 39 36 80
D-триптофан рН 7,0 рН 8,0 рН 9,0 0,33±0,03 0,32±0,03 0,34±0,03 1,10±0,05 1,08±0,05 1,10±0,05 21 38 100
D-аспарагиновая кислота нет реакции
* Значения указаны в процентах к максимальной активности с наилучшим субстратом - D-метионином
Рис. 2. Градуировочиый график зависимости величины ферментативной активности от количества DAAO в пробе. Субстрат - 10 мМ D-метионин. 50 мМ фосфатный буфер (рН 8,0); концентрации пероксидазы и ABTS 10 ед. /мл и 0,32 мг/мл соответственно
Т а б л и ц а 3
Статистическая обработка данных точности определения низких концентраций Б АЛО с Б-метионином.
Количество DAAO в пробе, мкг Среднее значение активности, мкмоль/мин Доверительный интервал
1х10~3 4,28 х10~3 0,30х10~3
З5х10~3 194х10~3 9,7х10~3
70х03 З85х10~3 25х10~3
0,42 0,0265 0,0013
2,1 0,197 0,0016
8,4 0,764 0,0026
мость наблюдаемой активности ТуБААО с Б-мети-онином от концентрации фермента. Как видно из этого рисунка, активность рекомбинантной ТуБААО линейно зависит от ее концентрации в диапазоне 170 нг/мл.
На рис. 3, а представлена концентрационная зависимость активности ТуБААО с Б-триптофаном. Линейность наблюдается только при концентрациях фермента меньше 8,4 мкг/мл (рис. 3, б). При более вы-
соких концентрациях наблюдается отклонение от линейной зависимости, связанное с образованием олиго-меров фермента. В нативном состоянии ТуБААО представляет собой димер, тогда как олигомеры более высокого порядка имеют более низкую удельную активность по сравнению с димером (рис. 3, а). Это согласуется с литературными данными [9].
Для определения точности предложенных методик для минимальных и максимальных количеств
Рис. 3. Концентрационная зависимость активности DAAO (а)и ее линейный участок (б). 10 мМ D-трипто-фана в качестве субстрата (50 мМ фосфатный буфер, рН 8,0; концентрация пероксидазы 10 ед/мл,
концентрация ABTS 0,32 мг/мл)
фермента в пробе, а также в середине линейного диапазона было проведено по 5 контрольных измерений активности рекомбинантной ТуБААО. Полученные результаты представлены в табл. 3. Во всех случаях относительная погрешность измерения не превышает 5-7%.
Таким образом, была исследована субстратная специфичность оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis и предложены условия для проведения больших количеств анализов активности фермента в диапазоне 1-70 нг и 0,42-8,4 мкг фермента в пробе.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агенства по науке и инновациям,
контракт № 02.435.11.3005.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ConlonH.D., Bagal J., BakerK., Shen Y.Q., WongB.L., NollesR.,
Rausch C. W. IIBiotechnol. Bioeng. 1995. 46. P. 510.
2. Курочкина В.Б., Ныс П.С. II Антибиотики и химиотерапия. 2002.
47. С. 29.
3. Nakajima N., ConradD., Sumi H., Suzuki K., Esaki N., Wandrey C.,
SodaK. II J. Ferm. Bioeng. 1990. 70. P. 322.
4. Beard T.M., Turner. N.J. II Chem. Commun. (Camb.) 2002. 3. P. 246.
5. Van Staden J.F., Stefan R.I., Aboul-Enein H. Y. II Fresenius J. Anal.
Chem. 2000. 367. P. 178.
6. Dominguez R., Serra B., Reviejo A.J., Pingarron J.M. II Anal.
Biochem. 2001. 298. P. 275.
7. Ihaba Y., Mizukami K., Hamada-Sato N., Kobayashi T., Imada C.,
Watanabe E. II Biosens. Bioelectron. 2003. 19. P. 423.
8. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. //
Biotechnol. Prog. 2004. 20. P. 467.
9. Shrader T., Andreesen J.R. // Arch. Microbiol. 1996. 165. P. 41.
10. Gabler M, Hense M, Fischer L. //Enz. Microb. Technol. 2000. 27. P. 605.
11. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. 65. P. 627.
12. ДавъдоваЕ.Е., ТишковВ.И. // Вести. Моск. ун-та. Сер.2. Хи-
мия. 2002. 43. С. 353.
13. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press. P. 172.
Поступила в редакцию 01.12.05
SUBSTRATE SPEaFTTY OF D-AMINO ACID OXIDASE FROM YEAST TRIGONOPSIS VARIABILIS EXPRESSED IN E. COLI CELLS
S.S. Savin, I.V. Chernyshov, V.I. Tishkov, S.V. Khoronenkova
(Department of Chemical Enzymology)
D amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilis was expressed in E. coli cells as active and soluble protein. Substrate specifity of the enzyme was studied and kinetic parameters with different D-amino acids were determined. Methods of detection of low and high concentrations of the recombinant D-amino acid oxidase were developed.
