CC BY
20
УДК 577.158
Ключевые слова: субстрат, ингибитор, аминоксидаза, моноамины, белуга Key words: substrate, inhibitor, amine oxidase, monoamines, beluga
Басова И. Н., Ягодина О. В., Басова Н. Е.
СУБСТРАТНАЯ И ИНГИБИТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТь МОНОАМИНОКСИДАЗы ПЕЧЕНИ БЕЛУГИ
SUBSTRATE AND INHIBITOR SPECIFICITY OF LIVER MONOAMINE OXIDASE OF BEL UGA
ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова» РАН Адрес: 194223, Россия, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences Address: 194223, Russia, Saint-Petersburg, Torezapr., 44
Басова Ирина Николаевна, науч. сотрудник. E-mail: irbas01@yandex.ru, тел. (812) 402-43-04
Basova Irina N., Research Assistant. E-mail: irbas01@yandex.ru, tel. +7 (812) 402-43-04 Ягодина Ольга Викторовна, к. х. н, ст. науч. сотрудник. E-mail: yagod.ov@yandex.ru, тел. (812) 542-03-55 Yagodina Olga V., Ph.D. in Chemical Science, Senior Research Assistant.
E-mail: yagod.ov@yandex.ru, tel. +7 (812) 542-03-55 Басова Наталья Евгеньевна, к. б. н, ст. науч. сотрудник. E-mail: basovn@rambler.ru, тел. (812) 543-47-62 Basova Natalya E., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Assistant.
E-mail: basovn@rambler.ru, tel. +7 (812) 543-47-62
Аннотация. Проведено исследование субстратной и ингибиторной специфичности митохондриальной моноами-ноксидазы (МАО) печени половозрелых самцов белуги Huso huso из устья Волги. Результаты субстратно-ингиби-торного анализа с использованием ингибиторов хлоргилина и депренила, а также пяти специфических субстратов являются косвенным доказательством присутствия в печени белуги одной формы МАО. Исследованный фермент проявляет высокую чувствительность к хлоргилину, специфическому ингибитору формы МАО, и очень низкую чувствительность к депренилу, специфическому ингибитору формы МАО Б. Определены кинетические параметры ферментативного дезаминирования - константы Михаэлиса (КМ) и максимальной скорости реакции (V), тирамина, серотонина, норадреналина, бензиламина, Р-фенилэтиламина, N-метилгистамина. Установлено, что исследуемый фермент проявляет более высокую активность по отношению к серотонину и норадреналину - субстратам формы МАО А, по сравнению с бензиламином, р-фенилэтиламином и N- метилгистамином - субстратам формы МАО.
Summary. Study of substrate and inhibitory specificity of liver mitochondrial monoamine oxidase (MAO) of sexually mature individuals of the beluga Huso huso from the mouth of Volga river was performed. The results of substrate-inhibitory analysis with the use of inhibitors deprenyl, chlorgyline and five specific substrates are indirect proofs of the existence in the beluga liver of one molecular MAO form. The studied enzyme have high sensitivity to chlorgyline, the specific inhibitor of MAO A form, and very low sensitivity to deprenyl, the specific inhibitor of MAO B form. Kinetic parameters of enzymatic reaction - the Michaelis constant (KM) and the maximum enzymatic reaction rate (V) for the deamination of tyramine, serotonine, noradrenaline, benzylamine, fi-phenylethylamine, N-methylhistamine were calculated. The enzyme has been established to be more active in the oxidative deamination of the substrates of MAO A form - serotonine and noradrenaline as compared with the substrates of MAO B form - benzylamine, fi-phenylethylamine, N-methylhistamine.
Введение
В последние годы возрос интерес исследователей к изучению природы и свойств митохондриальной моноаминоксидазы (МАО; моноамин: О2-оксидоредуктаза, дезамини-рующая; НФ 1.4.3.4), что определяется ее важной функциональной ролью в организме. Обеспечивая биологическую инактивацию аминов, МАО участвует в защите организма от токсических воздействий экзогенных или образующихся в органах и тканях биогенных
аминов, а также в регуляции уровня нейро-медиаторов. Основная часть работ по изучению каталитических свойств МАО посвящена исследованию фермента млекопитающих, у которых было обнаружено две формы этого фермента - форма МАО А и форма МАО Б, кодируемые разными генами, а также различающиеся по чувствительности к ингибиторам и по преимущественному окислению субстратов [7, 10]. Среди множества МАО особое место занимает фермент органов
и тканей рыб, благодаря выраженному своеобразию его субстратных и ингибиторных характеристик, однако в список тестируемых моноаминоксидазных объектов вошли единичные представители отдельных семейств. Обнаружено, что такие костистые рыбы, как радужная форель Salmo gairdneri [8] и рыба-зебра Danio rerio [7, 10], в отличие от млекопитающих, содержат только один ген, кодирующий МАО. Следует отметить, что МАО, как и другие мембранно-связанные ферменты, с трудом поддается выделению в чистом виде, поэтому субстратный и ингибиторный анализы являются исключительно удобным средством изучения каталитических свойств данного фермента. Исследование МАО печени рыб отряда Acipenseriformes (осетро-образные) представляет особый интерес, поскольку эти представители реликтовой ихтиофауны издавна являются ценными объектами промысла. Целью настоящей работы было исследование субстратной и ингиби-торной специфичности МАО печени рыбы из отряда осетрообразных - белуги Huso huso. Наши первые результаты по определению моноаминоксидазной активности печени этого вида рыбы представлены в работе [3].
Материал и методика
Источником активности фермента служили митохондрии печени рыбы, представителя семейства осетровых - белуги Huso huso, пойманной в ходе августовской экспедиции в устье реки Волги. Животных забивали путем декапитации сразу после вылова. Печень выделяли из половозрелых самцов, хранили при -18 °С и транспортировали в замороженном виде. В качестве ферментных препаратов использованы фрагменты мито-хондриальных мембран печени, полученные согласно методу [2]. Митохондрии выделяли из 10%-го гомогената в 0,25 М сахарозе центрифугированием 20 мин. при 13 000 g (после удаления ядер и обрывков клеток предварительным центрифугированием гомогената 3 мин. при 600 g). Полученную митохондри-альную фракцию повторно центрифугировали в 0,0075 М калий-фосфатном буфере рН 7,4 (20 мин., 13 000 g), затем суспендировали в том же буфере и хранили при -20 °С.
Для получения фрагментов митохондриаль-ных мембран суспензии митохондрий оттаивали, суспендировали в 10-кратном объеме 0,0075 М калий-фосфатного буфера, рН 7,4, и центрифугировали на холоду 20 мин. при 20 000 g. Надосадочную жидкость отбрасывали, осадок, содержащий фрагменты ми-тохондриальных мембран, суспендировали в том же буферном растворе (31±2 мг белка в одном мл для белуги, определено биуре-товым методом). Полученную суспензию фрагментов митохондриальных мембран замораживали и хранили при -20 °С в морозильной камере. Для анализа были использованы объединенные суспензии фрагментов митохондриальных мембран, полученные из печени 3 животных.
Активность МАО определяли спектро-фотометрическим методом (при 420 нм) по количеству аммиака, образующегося за 30 мин. в результате ферментативной реакции окислительного дезаминирования моноаминов: тирамина гидрохлорида, бен-зиламина гидрохлорида, Р-фенилэтиламина гидрохлорида (ФЭА), норадреналина гидрохлорида и N-метилгистамина дигидрохлори-да («Sigma», США), серотонин-креатинин сульфата и гистамина («Reanal», Венгрия) по модифицированному методу Конвея с последующей несслеризацией [2]. Пробы (конечный объем 2,5 мл) содержали фрагменты митохондриальных мембран в количестве 1 мг/мл белка, 0,5 мл ингибитора (исследуемого препарата) заданной концентрации или 0,5 мл воды (в контрольных опытах), 0,5 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,4, и 0,5 мл субстрата заданной концентрации. При исследовании торможения активности МАО ингибитором фрагменты митохондриальных мембран в указанном выше количестве пре-инкубировали в 0,1 M фосфатном буфере с соответствующими концентрациями ингибитора в течение 15, 30 и 45 мин. при 25 °С, затем к пробам добавляли субстрат и определяли активность, как указано выше.
В качестве ингибиторов использовали депренил (М-1-фенилизопропил-Ы-метил-2-пропиниламин гидрохлорид) и хлоргилин (^[2,4-дихлорфенокси]-пропил-Ы-метил-2-пропиниламин-гидрохлорид) фирмы «Sigma».
Расчет кинетических параметров ферментативной реакции - константы Михаэлиса (КМ) и максимальной скорости ферментативной реакции (V) проводили по методу Лайнуивера и Берка (цит. по [9]). При изучении зависимости скоростей ферментативных реакций от концентраций субстратов было проанализировано 9-11 точек (значений концентраций) в каждом исследованном диапазоне концентраций для каждого субстрата. Эффективность ингибирующего действия соединений оценивали по величине кд бимолекулярной константы скорости взаимодействия МАО с ингибитором. Величины kn рассчитывали по остаточной активности фермента после взаимодействия с изучаемым ингибитором [9]. Для определения kn подбирали диапазон концентраций ингибитора, в котором активность фермента угнеталась на 20-80 %. В этом диапазоне для каждого ингибитора анализировали 5-7 точек (значений концентраций) для 15, 30 и 45 мин. инкубации ингибитора с ферментом.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы MS Excel.
Результаты и обсуждение
Гомогенность МАО печени осетровых рыб. Для таких исследований наиболее адекватным является метод субстратно-ингиби-торного анализа [9] с использованием специфических ингибиторов и субстратов. Если антимоноаминоксидазная эффективность (оценена по величине kn) различных ингибиторов, определенная с помощью разных субстратов, одинаковая, то можно заключить, что в ткани содержится только одна форма МАО. Существенные различия в величинах Ц измеренные при разных субстратах для одного или нескольких ингибиторов, свидетельствуют о наличии в ткани по крайней мере двух форм МАО с разной субстратно-ингибиторной специфичностью. Согласно современным представлениям [7], у млекопитающих формой МАО А называют ами-ноксидазы (АО), активность которых блокируют низкие концентрации хлоргилина; специфическими субстратами таких МАО считают важнейшие нейромедиаторы нор-
адреналин и серотонин. Активность формы МАО Б тормозят лишь значительно более высокие концентрации хлоргилина; избирательным ингибитором этого типа МАО является депренил, а специфическими субстратами -бензиламин, ФЭА, №метилгистамин. Тира-мин, так называемый смешанный субстрат, дезаминируется обеими формами МАО. Для расчета кд в зависимости от используемого субстрата и времени инкубации фермента с ингибитором были использованы ингибиторы в следующих диапазонах концентраций: хлоргилин - 2,0*10"8-7,0*10-7 М, депренил - 8,0«10-5-2,5«10-3 М.
Для выяснения типа (обратимого или необратимого) ингибирования при исследовании действия хлоргилина и депренила был использован критерий, предложенный в работе [9]. Обнаружено, что ингибирую-щее влияние этих соединений на активность МАО нарастало с увеличением времени инкубации препарата с ферментом и при избытке препарата заканчивалось полной утратой каталитической активности фермента, что говорит о необратимом характере ингибиро-вания. Исследованные ацетиленовые соединения нельзя было удалить из прочного продукта, полученного при их взаимодействии с ферментом, а также получить фермент в неизменном виде. Так, после пропускания продукта взаимодействия МАО с хлорги-лином или с депренилом через колонку с Sephadex G-100, а также после диализа в течение 48 часов активность МАО не восстанавливалась.
Результаты субстратно-ингибиторного анализа для МАО печени белуги с использованием специфических субстратов и специфических ингибиторов формы МАО А и формы МАО Б приведены в таблице 1. Для хлоргилина получены практически одинаковые значения кд в пределах погрешности эксперимента для всех используемых специфических субстратов МАО обеих форм. Такая же закономерность наблюдалась и для депренила. Выявленное в настоящей работе отсутствие специфичности действия каждого из ингибиторов при дезаминировании различных субстратов является косвенным доказательством наличия у МАО печени бе-
Таблица 1.
Оценка методом субстратно-ингибиторного анализа гомогенности активности МАО печени осетровых рыб (антимоноаминоксидазная эффективность Ы!, M"1 • Мин-1)
Субстрат Ингибиторы
Депренил Хлоргилин
Серотонин (4,1±0,64) х 101 (1,6±0,23) х 105
Норадреналин (5,2±0,67) х 101 (2,2±0,34) х 105
Бензиламин (4,6±0,69) х 101 (1,9±0,29) х 105
ФЭА (5,0±0,85) х 101 (1,5±0,21) х 105
N-метилгистамин (3,9±0,53) х 101 (1,2±0,19) х 105
Примечание: приведены средние арифметические значения из 6 опытов и их среднеквадратичные отклонения.
Таблица 2.
Кинетические параметры ферментативного дезаминирования некоторых аминов под действием МАО печени белуги
Субстрат, область концентраций, М Км (мМ) V, 10-10 (моль • мин-1 • мг-1) V / Км, 10-7 М' ( л • мин-1 • мг-1)
Тирамин, 2,0^10-2-6,5^10-4 3,41±0,511 6,76±1,014 1,98±0,277
Серотонин, 7,5^10-3-2,5^10-4 1,42±0,213 8,74±1,224 6,15±0,926
Норадреналин, 7,5^10-3-2,5^10-4 1,90±0,258 7,33±1,099 3,86±0,540
Бензиламин, 2,5^10-2-8,0^10"4 4,43±0,660 0,62±0,090 0,14±0,021
ФЭА, 2,0^10-4-6,0^10-3 1,20±0,180 0,41±0,057 0,34±0,047
N-метилгистамин, 4,5^10-2-3,5^10-4 0,84±0,118 0,36±0,051 0,43±0,064
Примечание: приведены средние арифметические значения из 6 опытов и их среднеквадратичные отклонения.
луги одного центра связывания субстратов или одной молекулярной формы фермента. Следует отметить, что ранее методом суб-стратно-ингибиторного анализа нами была также показана «кинетическая» гомогенность МАО печени других костных рыб: сига Coregonus lavaretus ludoga [1], кеты Oncorhynchus keta [4] и тунца Katsuwonus pelamis [5]. Показано, что чувствительность МАО рыб к ингибиторам имеет выраженную видовую специфичность и уникальна по своей природе, отличаясь от чувствительности фермента наземных млекопитающих (цит. по [1]). Так, фермент паку Piaractus mesopotamicus Holmberg, сома Parasilurus asotus, форели Salmo gairdneri и окуня Pera flavenscens проявляет более высокую чувствительность к хлоргилину, чем к депре-нилу, но при этом значительно ниже, чем фермент млекопитающих. В случае карпа Cyprinus carpio, щуки Esox lucius и рыбы-зебры Danio rerio обнаружена одинаковая
чувствительность фермента к хлоргилину и депренилу. Такой же эффект наблюдался при действии селективных обратимых ингибиторов МАО А - FLA 788(+), FLA 336(+) (амифламин) и МАО Б - MD 780236 на МАО мозга карпа Cyprinus carpio. Показано [7], что ряд селективных обратимых ингибиторов МАО А человека угнетает активность MAO рыбы-зебры (ZMAO), в то время как селективные обратимые ингибиторы МАО В человека не угнетают активность этого фермента, что позволило авторам сделать вывод о некоторой близости ингибиторных свойств этого фермента и МАО А млекопитающих.
На основании анализа данных таблицы 1 можно сделать вывод о том, что МАО печени белуги проявляет в 3100-4200 раз большую, в зависимости от субстрата, чувствительность к хлоргилину, чем к депренилу, что свидетельствует о выраженном сходстве его ингибиторной специфичности с МАО А, чем с МАО Б наземных млекопитающих. Необ-
ходимо подчеркнуть, что способность к угнетению под действием хлоргилина у МАО печени белуги оказалась на несколько порядков выше, а под действием депренила практически такой же, как у МАО печени сига [1].
Субстратная специфичность МАО печени белуги. Поскольку проведенный субстрат-но-ингибиторный анализ с использованием хлоргилина и депренила свидетельствовал о гомогенности исследованного фермента, нами были определены кинетические параметры ферментативных реакций де-заминирования ряда субстратов (табл. 2). Набор использованных субстратов включал как шесть классических субстратов МАО, так и гистамин - субстрат диаминоксидазы (ДАО; НФ 1.4.3.6). Обнаруженная нами ранее способность МАО печени сига дезами-нировать гистамин [1] стала основанием для его использования в качестве возможного субстрата в представленной работе. Установлено, что МАО печени белуги дезаминирует тирамин, серотонин, норадреналин, бензила-мин, ФЭА, N-метилгистамин и не дезамини-рует гистамин, т. е. проявляет субстратную специфичность, характерную для классической МАО млекопитающих. Как известно [9], величина V наилучшим образом характеризует потенциальную активность фермента по отношению к каждому субстрату. Как следует из таблицы 2, соотношения величин V при дезаминировании тирамина, серото-нина, норадреналина, бензиламина, ФЭА и N-метилгистамина для фермента печени белуги составляет 100 : 129 : 108 : 9 : 6 : 5. Проведенный анализ показывает, что исследованный фермент со значительно большей скоростью дезаминировал серотонин и норадреналин, чем бензиламин, ФЭА и N-метилгистамин. При этом активности при дезаминировании субстратов МАО А - се-ротонина и норадреналина - близки между собой, то же наблюдалось для субстратов МАО Б - бензиламина, ФЭА и N-метил-гистамина. Таким образом, МАО печени белуги проявляет более высокую активность по отношению к исследуемым субстратам МАО А, чем по отношению к субстратам МАО Б. Несомненно важным является тот факт, что фермент печени бе-
луги обладает активностью, которая почти в 3 раза выше активностей фермента печени севрюги Аегретет stellatus, осетра персидского Аегретет persicus и осетра русского Аегретет gueldenstaedtii по отношению к субстрату обеих форм МАО - тирамину [3]. Величина активностей МАО печени белуги при дезаминировании тирамина, серотонина и бензиламина близка к соответствующим значениям для МАО печени тунца, при этом сходным было также соотношение активностей, которое составляет 1 : 1,3 : 0,09 для белуги и 1 : 0,87 : 0,03 для тунца [5]. Как следует из представленных результатов, каталитическая активность изученной МАО была ниже по сравнению с ферментом печени крысы -наиболее широко изученного представителя млекопитающих [6], эти отличия составляли при дезаминировании тирамина 5 раз, серотонина - 1,3 раза, бензиламина - 14 раз и ФЭА - 16 раз. Выявленная энзимологиче-ская особенность, по-видимому, свидетельствует о менее напряженной «барьерной» функции МАО в печени этого вида рыбы по сравнению с печенью крысы. Можно предположить, что в печени белуги процесс инактивации биогенных аминов, катализируемый МАО, вследствие ряда факторов протекает менее интенсивно, чем в печени млекопитающего. Необходимо отметить, что наибольшие отличия наблюдаются для субстратов формы МАО Б.
Величина К является сложным количе-
М
ственным параметром, характеризующим взаимодействие фермента с определенным субстратом, поскольку представляет собой соотношение констант скоростей всех парциальных реакций ферментативного процесса. Следует отметить, что в литературе нет единого мнения о физическом и кинетическом смысле этого параметра. Однако это, в определенном смысле, количественная энзимологическая характеристика, дающая возможность сравнительных сопоставлений. Различие в величинах К , полученных для ферментов разного происхождения при дезаминировании одного и того же субстрата, говорит о том, что эти ферменты не идентичны. Именно такой вывод можно сделать при сравнении полу-
ченных результатов для МАО печени белуги с результатами для МАО печени крысы, отличие между величинами КМ составляет 5-15 раз в зависимости от субстрата [6]. Значительно меньшая разница в величинах КМ наблюдается при дезаминировании тира-мина, серотонина, бензиламина и ФЭА под действием МАО печени двух рыб - белуги и сига, отличие составляет 1,1-3,6 раз [1]. Установлено [8], что в случае ТМАО, значение КМ при дезаминировании серотонина было в 2 раза меньше, чем для МАО А человека, значения КМ при дезаминировании ФЭА было в 8 раз больше, чем для МАО Б человека. Для ZMAO при дезаминировании серотонина, кинурамина, дофамина и тира-мина были получены [7] также значения КМ, отличные от соответствующих значений для MAO A и MAO Б человека. Нами были также рассчитаны значения величин V/К^ характеризующие первую сорбционную стадию процесса ферментативного дезаминирова-ния (в какой-то мере эта величина отражает сродство субстрата к ферменту). Наибольшие значения ^КМ были получены для серо-тонина и норадреналина, наименьшие - для бензиламина, ФЭА и N-метилгистамина. Разница в значениях, полученных для специфических субстратов формы МАО А и формы МАО Б составляет 9-44 раза. Таким образом, сорбционная способность специфических субстратов МАО А на активном центре исследуемых ферментов была выражена сильнее, чем сорбционная способность субстратов МАО Б.
Представленные данные изучения субстратной специфичности МАО печени белуги, вероятно, могут быть объяснены тем, что по аминокислотному составу субстрат-свя-зывающие сайты изученного фермента более сходны с МАО А, чем с МАО Б млекопитающих. Для подтверждения этого предположения нужны дополнительные исследования. Полученные в настоящей работе результаты могут служить еще одним весомым аргументом в пользу правомочности существующего предположения [10] о том, что наличие формы МАО Б является проявлением эволюционной физиологической адаптации животных к наземному образу жизни.
Заключение
На основании результатов субстратно-ингибиторного анализа митохондриальной МАО печени белуги с использованием хлор-гилина и депренила, а также данных кинетического анализа ферментативного дезами-нирования шести классических субстратов МАО, высказано предположение о наличии в печени белуги одной формы МАО, более похожей на МАО А, чем на МАО Б наземных млекопитающих. По-видимому, МАО печени белуги представляет собой новый тип МАО или промежуточную форму МАО, характерную для данного таксона. Приведенные в настоящей статье данные представляют особый интерес для сравнительных биохимических исследований обширного семейства АО животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.
Список литературы
1. Басова, И. Н. Каталитические характеристики моноаминоксидазы печени сига Coregonus lavaretus ludoga / И. Н. Басова, О. В. Ягодина // Ж. эвол. био-хим. и физиол. - 2011. - Т. 47. - С. 272-277.
2. Северина, И. С. О возможном механизме избирательного торможения хлоргилином и депренилом активности митохондриальной моноаминоксидазы печени крыс / И. С. Северина // Биохимия. - 1979. -Т. 44. - С. 195-204.
3. Ягодина, О. В. Исследование моноаминоксидаз-ной активности печени и мозга некоторых рыб Волжского бассейна / О. В. Ягодина, И. Н. Басова, А. Е. Хованских // ДАН. - 2006. - Т. 407. - C. 124-126.
4. Ягодина, О. В. Моноаминоксидазная активность печени кеты (Oncorhynchus keta). Субстратно-ингиби-торная специфичность // О. В. Ягодина, И. Н. Басова / ДАН. - 2007. - Т. 414. - С. 120-122.
5. Ягодина, О. В. Моноаминоксидаза печени тунца полосатого (Katsuwonus pelamis). Субстратно-ингиби-торный анализ / О. В. Ягодина, И. Н. Басова // ДАН. -2008. - Т. 421. - С. 838-841.
6. Ягодина, О. В. Сравнительное исследование каталитических свойств моноаминоксидазы печени норки и крысы / О. В. Ягодина // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2008. - Т. 44. - С. 570-575.
7. Aldeco, M. Catalytic and inhibitor binding properties of zebrafish monoamine oxidase (z-MAO): Comparison with human MAO-A and MAO-B / M. Aldeco, B. K. Arslan, D. E. Edmondson // Comp. Biochem. Physiol. В. Biochem. Mol. Biol. - 2011. - V. 159. -P. 78-8.
8. Chen, K. Cloning of novel monoamine oxidase cDNA from trout liver / K. Chen, H. F. Wu, J. Grimsby, J. C. Shih // Mol. Pharmacol. - 1994. - V. 46. - P. 12261233.
