CC BY
36
УДК 579.841.95-092.9+612.112.94
В.В. Войткова В.И. Дубровина Ж.А. Коновалова В.Б. Николаев 1, С.А. Татарников
А.С. Сорокоумова А .Д. Крючкова 2
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ, ПРИМИРОВАННЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОМ РПАМС/БЕИА ПЛ-АЙЕЫБ/Б
1 Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (Иркутск)
2 Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
При формировании специфического иммунного ответа к туляремии существенная роль отводится Т-лимфоцитам, оценка степени активации которых является одним из прогностических факторов развития и течения заболевания. В данной работе представлены материалы по изучению влияния препаратов липополисахарида (ЛПС) туляремийного микроба разных подвидов на активацию Т-лимфоцитов крови в условиях in vitro с помощью цитофлуориметрического анализа.
Показано, что ЛПС Francisella tularensis разных подвидов стимулирует экспрессию CD25 Т-хелперами и цитотоксическими Т-лимфоцитами по сравнению с контролем. Входе экспериментов установлено, что ЛПС туляремийного микроба является индуктором иммунного ответа, но, тем не менее, степень активации Т-клеток зависит от подвидовой принадлежности и вирулентности F. tularensis. Ключевые слова: Francisella tularensis, липополисахарид, Т-лимфоциты, проточный цитофлуориметр
SUBPOPULATION STRUCTURE T-LYMPHOCYTES OF BLOOD EXPERIMENTAL ANIMALS PRIMED BY LIPOPOLYSACCHARIDE FRANCISELLA TULARENSIS
V.V. Voitkova V J. Dubrovina Sh.A. Konovalova l, V.B. Nikolaev L, S.A. Tatamikov l,
A.S. Sorokoumova 2, A.D. Kryuchkova 2
1Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk 2 Irkutsk State Medical University, Irkutsk
T-lymphocyte play the essential role at formation of the specific immune answer to tularemia. The estimation of their degree of activation is one of prognostic factors of development and current of disease. In the given work materials on studying influence of a lipopolysaccharide of a tularemic microbe of different subspecies on activation T-lymphocyte of blood under conditions in vitro by means of the cytofluorimetry analysis are presented.
It is shown, that lipopolysaccharide Francisella tularensis of different subspecies stimulates expression CD25 marker on T-helpers and cytotoxic T-lymphocytes in comparison with the control. During experiments it is established that the lipopolysaccharide of a tularemic microbe is an inductor the immune response, but the degree of activation ofT-cells depends on a subspecies accessory and virulence F. tularensis.
Key words: Francisella tularensis, lipopolysaccharide, T-lymphocyte, flow cytometry
Проблеме изучения возбудителя туляремии посвящено много работ, тем не менее, некоторые вопросы иммуногенеза и патогенеза инфекции остаются нераскрытыми. Несмотря на то, что АПС туляремийного микроба не является типичным провоспалительным эндотоксином [8], биомолекула ЛПС рассматривается как один из основных факторов патогенности возбудителя, а снижение вирулентности и иммуногенности бактерий коррелирует с нарушениями в его структуре [2]. ЛПС представляет собой сигнальную молекулу, распознаваемую системой врожденного иммунитета. Известно, что в защите от туляремийного микроба доминирующая роль отводится клеточному иммунитету, в частности СБ4+ и С08+ Т-лимфоцитам [10].
В связи с этим, изучение иммуногенности эндотоксина туляремийного микроба является актуальным направлением в исследовании особенностей реагирования макроорганизма на ЛПС К Ы1аге1^5 разных подвидов.
Цель работы — сравнительная оценка влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов,
выделенных различными методами, на активацию Т-лимфоцитов крови в условиях in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 32 сертифицированные (НПО «Вектор», Новосибирск) беспородные белые мыши (массой 15 — 20 г). Животных выводили из эксперимента декапитацией в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», Приложение №4 (2003).
В качестве объекта исследования использовали препараты ЛПС, выделенные твин-экстракцией (ЛПСт) [3] и водно-фенольным методом (ЛПСв) [1] из F. tularensis subsp. tularensis Schu 11 (Del для белых мышей составляет 1 КОЕ); F. tularensis subsp. holarctica И-250 (Del — 10 КОЕ); F. tularensis subsp. mediasiatica A-120 (Del — 10 КОЕ); F. tularensis subsp. novicida F 6168 (авирулентен для белых мышей в дозах 1000 КОЕ). В качестве контроля использовали клетки интактных животных.
Материалом для исследования служили лимфоциты, выделенные из гепаринизированной крови
мышей. Кровь отстаивали до четкого разделения эритроцитов и плазмы в течение 40 — 60 мин на льду. Отбирали плазму и верхний слой эритроцитов, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 5 мллизируюгцего буфера (BD Biosciences, Oxford, UK), инкубировали 5 мин на льду, отмывали при 1000 об/мин в течение
2 мин и доводили до концентрации 2 х 107 кл/мл фосфатно-солевым буфером. Жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим составляла 96 — 98 %. Клетки в концентрации 2 х 105 инкубировали с ЛПС туляремийного микроба разных подвидов (10 мкг) в течение 3 часов. Фенотип лимфоцитов определяли с использованием моноклональных антител компании Becton Dickinson (США) в следующей панели: CD45-PE-Cy5/CD3-FITC/CD4-Alexa-700/ CD8-APC-Cy7/CD25-PE-Cy7. Анализ окрашенных образцов проводили на проточном цитофлуориме-тре BD FACSCanto™ II в программе BD Diva 6.0.
Для изучения Т-клеточного звена иммунной системы определяли следующие субпопуляции Т-лимфоцитов: активированные Т-лимфоциты (CD3 + CD25 + ), активированные Т-хелперы (CD3+CD4+CD25+), активированные цитотокси-ческие Т-лимфоциты (CD3+CD8+CD25+), нативные Т-хелперы (CD3+CD4+CD25_), цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+CD25_), атакже регуляторные Т-лимфоциты (CD3+CD4+CD25high).
Статистическую обработку данных проводили при помощи стандартного пакета прикладных программ «Statistica», версия 6 (CopyrightOStatSoft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897) с использованием U-критерия Манна — Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0,05. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена (г ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе экспериментов нами установлено, что ЛПС F. tularensis оказывает стимулирующее
влияние на экспрессию С025 Т-лимфоцитами. Так, ЛПС К tu.laren.sis независимо от подвидовой принадлежности способствует увеличению общей популяции активированных Т-клеток (СОЗ+С025+) в 2,7 —3,1 раза (Р < 0,001) по сравнению с контролем, что свидетельствует об активации иммунных процессов (рис. 1).
При сравнительном анализе действия ЛПС К Шагв1^5, в зависимости от способа выделения, на экспрессию С025 Т-лимфоцитами показано, что тенденция к стимуляции в большей степени выявлена у ЛПСт, тем не менее, различия не были достоверными. Установлено значительное увеличение экспрессии раннего маркера активации С025 на СЭ4 + (Р < 0,01) и С08+лимфоцитах (Р < 0,05) по сравнению с контролем. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют об участии в иммунном ответе как Т-хелперов, так и цитоток-сических Т-лимфоцитов. Выявленное снижение процентного содержания во всех исследуемых образцах С04 + СБ25~ клеток, вероятно, связано с увеличением числа С04 + СБ25+ (г = —0,94, Р < 0,001), подобная ситуация наблюдается также и в случае цитотоксических С08+лимфоцитов (г = -0,89, Р< 0,001).
Известно, что в регуляции иммунного ответа на внедрение патогена существенная роль отводится популяции Т-лимфоцитов — СВ4+СВ25“д11, которая выступает в качестве ингибитора эффекторных клеток СБ4+ иСБ8+ [4,6]. Принцип дифференцировки регуляторных клеток от популяции СБ4+СБ25 + лимфоцитов основан на определении высокого уровня экспрессии С025, что позволяет изолировать популяцию клеток. Идентификация С04+СВ25“д11 Т-лимфоцитов в образцах клеток крови, примиро-ванных ЛПС К Мотеля/я разных подвидов, выявила статистически значимое (Р < 0,01) увеличение этой популяции клеток по сравнению с контролем. Отмечена прямая зависимость содержания числа лимфоцитов с маркером С04+СБ25+ Т-клеток от
ЛПСв F. tularensis
ЛПСт F, tularensis
0 Контроль. Hholarctica Я mediasiatica ■ novicida ®tularensis
Рис. 1. Влияние ЛПС Г. Ги/агепв/в разных подвидов на содержание (%) общей популяции активированных Т-клеток (С03+С025+): * - Р < 0,001 по сравнению с контролем.
Таблица 1
Характеристика экспрессии маркера активации С025 на Т-лимфоцитах после примирования клеток крови ЛПС Р. Ш/агепв/в разных подвидов (М ± э)
Подвиды Препарат Показатель, %
CD4+CD25+ CD4+CD25~ CD4+CD25high CD8+CD25Y|ok )затель+С025
F. tularensissubsp. holarctica ЛПСт 68,1 ±8,2* 34,1 ±9,6* 4,3 ±2,3* 69,8 ±9,1* 26,6 ±9,4**
ЛПСв 59,2 ± 8,5** 43,3 ±8,7 2,57 ±0,8 63,6 ±6,1** 32,8 ± 3,4**
F. tularensissubsp. tularensis ЛПСт 69,1 ±8,0* 32,6 ± 8,5* 4,43 ± 1,7* 71,6 ±8,3* 26,2 ± 7,6**
ЛПСв 64,8 ± 5,2** 37,0 ±5,3* 2,47 ±0,3* 72,4 ±9,1** 28,7 ±9,6**
F. tularensissubsp. mediasiatica ЛПСт 69,1 ± 10,7* 29,2 ± 8,4* 4,67 ± 1,6* 73,1 ±5,8* 25,1 ±5,6**
ЛПСв 68,9 ± 7,8** 33,2 ±8,3* 4,77 ± 1,7* 73,6 ± 9,0** 24,1 ±9,2**
F. tularensissubsp. novicida ЛПСт 69,7 ± 6,3* 31,7 ±6,6* 4,5 ±2,2* 70,1 ±7,5* 27,5 ±7,1**
ЛПСв 66,9 ± 8,9** 34,8 ±9,9* 3,83 ± 1,3* 70,1 ±9,5** 28,3 ±9,1**
Контроль - 29,4 ±14,5 53,6 ±4,8 1,8 ±0,2 39,8 ± 13,7 59,5 ±13,0
Примечание: * - Р < 0,01 по сравнению с контролем; ** - Р < 0,05 по сравнению с контролем.
содержания CD4+CD25high (г, = 0,72, Р < 0,001), что может указывать на повышение содержания в исследуемой пробе популяции регуляторных клеток.
Подтверждением того факта, что генерированные в течение инкубации с ЛПС F. tularensis, CD4+CD25high клетки дифференцируются из CD4+CD25_ Т-лимфоцитов является корреляционная взаимосвязь этих субпопуляций (г = — 0,77, Р < 0,001). Следует отметить, что показатели содержания CD4+CD25highH CD4+CD25~ Т-лимфоцитов при взаимодействии с ЛПСв подвида holarctica (И — 250) не имели достоверных различий, что свидетельствует о слабом стимулирующем действии данного препарата на активацию этих популяций клеток относительно контроля.
В ходе эксперимента выявлена тенденция ЛПСт F. tularensis стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов в большей степени, чем у ЛПСв F. tularensis, однако, достоверное отличие содержания этой популяции лимфоцитов по сравнению с контролем, было отмечено только в случае ЛПС F. tularensis subsp. tularensis (Р < 0,05) и не зависело от способа получения препарата.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛПС туляремийного микроба является индуктором как CD4+, такиСБ8+ Т-клеток, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности и вирулентности F. tularensis, но и от способа выделения ЛПС.
Таким образом, в ходе исследований были получены данные, подтверждающие сведения других авторов [5, 7, 9] о значимости выявления маркеров Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8) и их активации (CD25) для выявления нарушений функционирования иммунной системы при контакте с патогеном.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамс Г.А. Выделение липополисахари-дов из грамотрицательных бактерий // Методы
исслндования углеводов; пер. с англ. — М.: Мир, 1975. - С. 126-130.
2. Оноприенко Н.Н., Павлович Н.В. Рольлипо-сахарида в токсичности бактерий рода Francicella // Молекул, генетика. — 2003. — № 3. — С. 25 — 28.
3. Николаев В.Б. и др. Получение липополисахаридного антигена туляремийного микроба: метод. рекомендации // Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. — Иркутск, 2010 — 5 с.
4. Shevach Е.М. et al. Control of T-cell activation by CD4+ CD25+ suppressor T-cells // Immunol. Rev. - 2001. - Vol. 182. - P. 58-67.
5. Cowley S.C., Elkins K.L. Multiple T-cell subsets control Francisella tularensis LVS intracellular growth without stimulation through macrophage interferon gamma receptors // J. Exp. Med. — 2003 — Vol. 198. - P. 379-389.
6. Nishikawa H. et al. Definition of target antigens for naturally occurring CD4( + )CD25( +) regulatory T-cells // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 201. -P. 681-686.
7. Gosselin E.J., Gosselin D.R., Lotz S.A. Natural killer and CD8 T cells dominate the response by human peripheral blood mononuclear cells to inactivated Francisella tularensis live vaccine strain // Hum Immunol. - 2005. - Vol. 66, N 10. - P. 1039-1049.
8. Hajjar A.M. et al. Lack of in vitro and in vivo recognition of Francisella tularensis subspecies lipopolysaccharide by Toll-like receptors // Infect Immun. - 2006. - Vol. 74, N 12. - P. 6730-6738.
9. Heather J.R. et al. Oral live vaccine strain-induced protective immunity against pulmonary Francisella tularensis challenge is mediated by CD4 T cells and antibodies, including immunoglobulin A // Clinical and Vaccine Immunology. — 2009. — Vol. 16, N4. - P. 444-452.
10. Yee D., Rhinehart-Jones T.R., Elkins K.L. Loss of either CD4 or CD8 T cells does not affect the magnitude of protective immunity to an intracellular pathogen, Francisella tularensis strain LVS // J. Immunol. - 1996. - Vol. 11. - P. 5042-5048.
Сведения об авторах
Войткова Валентина Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35; e-mail: woitkova@mail.ru)
Дубровина Валентина Ивановна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8(3952)22-01-35)
Коновалова Жанна Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Восток (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01 -35)
Николаев Валерий Борисович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник биохимического отдела Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Восток (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8(3952)22-01-35)
Татарников Станислав Александрович - кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Восток (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35)
Сорокоумова Алена Сергеевна - студентка Иркутского государственного медицинского университета (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1; тел.: 8 (3952) 24-38-25)
Крючкова Александра Дмитриевна - студентка Иркутского государственного медицинского университета (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1; тел.: 8 (3952) 24-38-25)
