CC BY
85
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ... 95
УДК 618.19-006.6:612.42
О.В. Короткова, Т.Н. Заботина, Л.В. Скотаренко, А А. Борунова, НЮ. Очеева, И.К. Воротников, ЗГ. Кадагидзе СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РМЖ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Короткова Ольга Витальевна, старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии опухолей
Централизованного клинико -лабораторного отдела
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-17-14
e-mail: [email protected]
Статья поступила 19.04.2011., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
Изучены линейные маркеры клеточного звена иммунитета и оценена субпопуляционная структура лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы с использованием многопараметрового анализа иммунофенотипа лимфоцитов. В исследование было включено 77 первично операбельных больных. Распределение больных по стадиям было следующим: I (Т1Ы0) - 31,2 %, II (T1N1, T2N0-1) - 49,3 %, III (T2-4, N0-2) - 19,5 %. В результате исследования было выявлено, что у 58,4% пациенток имеются нарушения структуры Т-лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами. Хирургическое лечение не оказало влияния на динамику распределения основных популяций лимфоцитов при анализе общей группы больных. Индивидуальный анализ иммунограмм в зависимости от исходного уровня CD3 показал, что у 28,5 % больных было исходно снижено содержание СО3+-лимфоцитов, у 41,5% - исходно нормальное число CD3+-лимфоцитов, у 30,0 % - исходно повышенное количество. У больных со сниженным содержанием СО3+-лимфоцитов было исходно повышено количество NK-клеток с фенотипом CD3CD16+CD56+, в то время как у пациентов с нормальным и высоким числом CD3+-лимфоцитов было значительно увеличено количество NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ - 14,0+1,1 и 19,3±1,4 соответственно.
Ключевые слова: рак молочной железы, субпопуляции лимфоцитов.
O.V. Korotkova, T.N. Zabotina, L.V. Skotarenko, A.A. Borunova, N.Yu. Ocheeva, I.K. Vorotnikov, Z.G. Kadagidze LYMPHOCYTES SUBPOPULATION
FROM BREAST CANCER PATIENT’S PERIPHERAL BLOOD
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
The linear markers of cellular immunity of peripheral blood lymphocytes in breast cancer patients have been identified. We have also estimated the subpopulation structure of peripheral blood lymphocytes using multiparameter analysis of lymphocytes’ immunophenotype. 77 patients with primary operable tumors were enrolled in this study: I (TiNn) - 31,2 %, II (TiNi. T2Nn-1) - 49,3 %, III (T2-4, Nn-2) - 19,5 %. The study revealed that 58,4 % of patients are violations of the structure of T lymphocytes compared with healthy donors. Surgical treatment had no effect on the dynamics of the distribution of major lymphocyte populations in the analysis of the total group of patients. Individual analysis immunograms based on the initial level of CD3 showed that 28,5 % of patients had initially reduced level of CD3+ lymphocytes, 41,5% had initially normal level of CD3+ lymphocytes and 30,0 % had initially high level. Here we show that the patients with reduced level of CD3+ lymphocytes had initially increased number of NK cells with the phenotype CD3-CD16+CD56+, whereas the patients with normal and high level of CD3+ lymphocytes had significantly increased number of NKT cells with phenotype CD3+CD16+CD56+ - 14,0+1,1 h 19,3+1,4, respectively.
Key words: breast cancer, lymphocyte subpopulation.
Введение
РМЖ занимает лидирующее место в структуре онкологической заболеваемости и смертности в России среди женщин; при этом 10,3% пациенток погибают от дальнейшего прогрессирования болезни в течение первого года после постановки диагноза [2]. Ранее было показано, что большинство злокачественных новообразований сопровождаются значительными нарушениями различных звеньев иммунной системы (Уменьшение числа Т-лимфоцитов и их субпопуляций, числа и функциональной активности естественных киллеров и т.д.). Выраженность этих процессов неодинакова в исследованных группах больных, однако те или иные нарушения, а также их сочетания встречаются практически у всех больных РМЖ. Кроме того, было показано, что полные или частичные ремиссии встречаются чаще у больных
РМЖ с нормальными показателями клеточного иммунитета по сравнению с пациентами со сниженными показателями [1; 10]. В противоопухолевой защите организма играют большую роль различные популяции клеток, включающие в себя как клетки-эффекторы, так и клетки-супрессоры. В настоящее время большое внимания уделяется исследованию регуляторных клеток. Это гетерогенная популяция, в которой можно выделить С04+- и С08+-субпопуляции лимфоцитов, а также ЫКТ-клетки [9]. Данные клетки обладают способностью угнетать развитие клеточного иммунного ответа, а также участвовать в модуляции противоопухолевого иммунитета [5; 6; 8]. Исследования особенностей функционирования иммунной системы и взаимосвязи изменений в иммунном статусе с клиническими проявлениями болезни у женщин с диагнозом РМЖ достаточно актуальны.
Изменения субпопуляционной структуры T-лимфоцитов диктуют необходимость иммунокоррекции клеточного звена иммунитета для проведения адъювантной химио- и ЛГ в полном объеме.
Целью исследования было изучение субпо-пуляционной структуры лимфоцитов больных РМЖ.
Материалы и методы
В исследование включено 77 женщин первичных больных раком молочной железы. Распределение по стадиям: I (T1N0) - 31,2 %, II (T1N1, T2N0-1) - 49,3 %, III (Т2-4, N0-2) - 19,5 %. Всем больным были выполнены радикальные операции: (мастэктомия с сохранением грудных мышц - 76,6 % случаев или органосохраняющая операция - 23,3 %). Средний возраст пациенток составил 56,4+1,1 лет. Иммунофенотипиро-вание лимфоцитов проводили методом многопара-метрового цитометрического анализа до и через 2 недели после хирургического лечения с использованием коммерческих наборов моноклональных антител, конъюгированных FITC, PE, PE-Cy5, PC5 (BD Biosciences, Bekman Coulter, США). Использовали следующие двух- и трехцветные реагенты: СD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD16+56, CD3/HLA-Dr, CD4/CD25, CD4/CD127/CD25. В качестве контрольных образцов использовали периферическую кровь 25 практически здоровых женщин в возрасте 25+58 лет. Многопараметровый количественный цитомет-рический анализ проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences). В каждом образце накапливали и анализировали не менее 5000 событий в гейте CD45+/CD14-лимфoцитoв, количество клеток с фенотипом CD45+/CD14- составляло не менее 95-97 %. Использовали Dotplot-анализ, учитывали относительное число позитивных клеток (%). Для дискриминации неспецифического связывания использовали конъюгат IgG1FITC/IgG2aPE. Цитотоксический потенциал клеток-эффекторов изучали с использованием коммерческой тест-системы, содержащей моноклональные антитела к внутриклеточному белку пер-форину (BD Biosciences). Применяли комбинированное окрашивание поверхностных антигенов в сочетании с окрашиванием внутриклеточного белка CD8/Perforin, CD16/Perforin. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения “Sigma Plot 11.0” for Windows 2003. Достоверность различий в исследовании оценивали по t-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона - Манна - Уитни и Фишера. Для выявления различий в частоте распределения нормальных и измененных величин отдельных показателей в сравниваемых группах использовали критерий %2. Различия считали достоверными при Р<0,05. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартноой ошибки.
Результаты
При анализе показателей иммунологического статуса до начала лечения и после операции у всех больных выявлено, что практически все средние значения основных линейных показателей CD3, CD4, CD8, CD3-CD16+CD56+, CD19, находились в пределах физиологической нормы. Однако количество CD3-CD8+, CD8+CD16+ и CD3+CD16+CD56+ клеток у данной группы пациенток статистически достоверно отличалось от аналогичных показателей здоровых женщин (табл.1).
В настоящее время известно несколько систем реализации цитотоксической функции лимфо-
цитами. Одним из основных путей является экзо-цитоз литических гранул - перфорина и гранзимов. При взаимодействии клетки-эффектора с клеткой-мишенью происходит высвобождение перфорина, который, встраиваясь в мембрану клетки-мишени полимеризуется в присутствии ионов кальция, образуя большие трансмембранные поры, вызывая тем самым осмотический «взрыв» и лизис клетки. Через эти поры в клетку приникают гранзимы, довершающие разрушение клетки, которые опосредуют деградацию ДНК клетки-мишени путем активации каспа-зы 3. Действие тандема этих молекул необратимо [7; 11; 12 ]. В связи с этим нами были исследованы основные субпопуляции эффекторных лимфоцитов, содержащих перфорин - СО45+СО8+РегЮип+ Т-лим-фоциты и СО45+СО16+Рег1Ьпп+ ЫК-клетки.
При оценке содержания перфорина в СО 16+ и СО8+-лимфоцитах было установлено, что количество СО45+СО8+Рег1оип+-лимфоцитов и их цито-токсический потенциал статистически значимо превышает показатели доноров и составляет 17,5+0,7 и 12,1+ 1,2; 52,0±1,4 и 36,5+ 2,5 соответственно. Цитотоксический потенциал СО16+-лимфо-цитов не отличался от показателей доноров (табл. 2-3). Ранее было показано, что наличие высокого содержания перфорин-позитивных клеток в структуре СО45+СО8+ Т-лимфоцитов можно рассматривать как фактор неблагоприятного прогноза основного заболевания [3; 4].
В результате исследования было выявлено, что у 58,4 % пациенток имеются нарушения в линейной структуре Т-лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами. Индивидуальный анализ иммунограмм в зависимости от исходного уровня СО3 показал, что у 28,5 % больных было исходно снижено содержание СО3+-лимфоцитов (группа 1), у 41,5 % - исходно нормальное число СО3+-лимфоцитов (группа 2), у 30,0 % -исходно повышенное (группа 3). Количество СО3-СО19+ В-лимфоцитов соответствовало норме у всех больных. У больных со сниженным содержанием СО3+-лимфоцитов было исходно повышено количество ЫК-клеток с фенотипом СО3-СО16+СО56+ (30,0+1,3). Известно, что отличительной особенностью ЫК-клеток является их способность лизировать клетки-мишени без предварительной сенсибилизации. По всей вероятности в условиях дефицита СО3+ Т-лимфоцитов увеличение естественных киллеров носит компенсаторный характер и играет определенную роль в противоопухолевой и противовирусной защите. У пациентов с нормальным и высоким числом СО3+-лимфоцитов было значительно увеличено количество ЫКТ-клеток с фенотипом СО3+СО16+СО56+ - 14,0+1,1 и 19,3+1,4 соответственно, кроме того у больных с исходно высоким уровнем СО3+ Т-клеток количество ЫК-лимфоцитов было значительно ниже показателей доноров. Увеличение ЫКТ-клеток, представляющих минорную популяцию Т-лимфоцитов, является плохим прогностическим признаком, поэтому данная группа больных будет взята под пристальное наблюдение.
Особо следует отметить, что у больных 1 и 2 групп было статистически значимо понижено содержание СО4+-лимфоцитов и незначительно повышено число СО8+-лимфоцитов, и как следствие этого снижен иммунорегуляторный индекс (соотношение СО4+/СО8+), который составил 0,8+0,07 и 0,9+0,06 соответственно (табл. 4). Кроме того, у больных 1 группы было статистически значимо понижено количество цитотоксиче-ских лимфоцитов с фенотипом СО3+СО8+. Проведенное хирургическое лечение не оказало влияния на динамику распределения основных популяций лимфоцитов при анализе общей группы больных.
Таблица 1
Популяции лимфоцитов периферической крови больных РМЖ до и после хирургического лечения (% антиген+ клеток)
Маркер До операции (M+ m) После операции (Ы+ ш) Доноры (M+m)
CD3+ 67,3+1,4 68,3+1,5 73,8+ 1,5
CD3+CD4+ 35,6+1,0 37,3+1,3 43,4+ 1,6
CD3+CD8+ 25,4+1,0 24,9+1,0 26,9+ 1,1
CD3-CD8+ 13,8+1,0* 12,9+0,9* 7,7+ 0,6
CD8+ 39,2+1,1 37,8+1,0 34,6+ 1,4
CD3+HLA-DR+ 7,7+0,5 7,6+0,5 5,8 + 0,6
CD3-CD16+CD56+ 19,5+1,0 19,1+1,2 16,7+ 1,3
CD3+CD16+CD56+ 14,8+0,8* 14,4+0,8* 8,7+ 1,1
CD3-CD19+ 6,8+0,4 6,7+0,4 6,6+ 0,9
CD8+CD16+ 10,3+0,6* 10,9+0,7* 6,4+ 0,6
CD4/CD8 0,98+0,04* 1,1+0,06 1,4 + 0,1
*различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05)
Таблица 2
Относительное содержание (%) антиген (белок)-позитивных лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы до и после хирургического лечения_______________________________________________
Маркер До операции (M+ m) После операции (M+ m) Доноры (M+m)
CD45+CD16+Perforin+ 19,4+0,8 18,5+0,9 15,5+ 1,4
CD45+CD8+Perforin+ 17,5+0,7* 16,7+0,7* 12,1+ 1,2
* различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05)
Таблица 3
Цитотоксический потенциал эффекторных лимфоцитов больных раком молочной железы___________________
Маркер До операции (M+ m) После операции (M+ m) Доноры (M+m)
Цитотоксический потенциал CD16+ лимфоцитов 82,0+1,6 80,7+1,8 75,9+ 5,5
Цитотоксический потенциал CD8+ лимфоцитов 52,0+1,4* 51,4+1,6* 36,5+ 2,5
* различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05)
Таблица 4
Относительное (%) содержание популяций лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы до и после операции в зависимости от исходного количества СР3+ Т клеток (Ы+ш)_________________
Маркер Операция Группа 1 (n=22) Группа 2 (n=32) Группа 3 (n=23) Доноры (n=25)
CD3+ До 52,1+1,3* 67,4+0,8 81,6+1,0* 73,8+ 1,5
После 56,5+2,2* 67,7+1,6 80,3+2,2
СD3+CD4+ До 29,0+1,3* 33,7+1,2* 44,5+1,6 43,4+ 1,6
После 32,3+1,3* 36,6+0,9 43,0+1,8
CD3+CD8+ До 17,6+1,3* 25,9+1,3 32,2+1,8 26,9+ 1,1
После 17,7+1,4* 24,9+1,4 31,6+1,8
CD3-CD8+ До 21,3+2,2* 13,7+0,9* 6,7+0,7 7,7+ 0,6
После 19,3+2,1* 12,7+1,1* 7,1+1,0
CD8+ До 38,9+2,6 39,6+1,4 38,9+1,9 34,6+ 1,4
После 36,9+2,5 37,6+1,3 38,7+1,8
CD3+HLADR+ До 5,7+0,9 7,1+0,7 10,4+0,8* 5,8 + 0,6
После 6,8+1,2 6,9+0,7 9,4+1,0*
CD3-CD16+CD56+ До 30,0+1,3* 19,1+1,1 10,1+0,8* 16,7+ 1,3
После 29,4+2,2* 18,2+1,6 10,4+1,1*
CD3+CD16+CD56+ До 11,3+1,3 14,0+1,1* 19,3+1,4* 8,7+ 1,1
После 11,4+1,3 13,1+1,1* 19,2+1,5*
CD19+ CD3- До 7,4+0,6 7,9+0,8 4,8+0,4 6,6+ 0,9
После 6,4+0,4 8,1+0,8 4,8+0,6
CD8+CD16+ До 11,7+1,5* 9,9+0,9 9,5+0,9 6,4+ 0,6
После 13,6+1,8* 9,9+1,0 9,6+1,0
CD4/CD8 До 0,8+0,07* 0,9+0,06* 1,2+0,1 1,4 + 0,1
После 1,0+0,1 1,1+0,09 1,2+0,1
*различия статистически достоверные по сравнению с донорами (р<0,05)
Таким образом, с целью дальнейшей коррекции адъювантной химио- и лучевой терапии в полном объ-
субпопуляционной структуры Т-клеточного звена им- еме необходимо проводить индивидуальный монито-
мунитета и обеспечения возможности проведения ринг состояния иммунной системы больных РМЖ.
Литература
1. Артамонова ЕВ, Короткова О.В., Заботина Т.Н. и др. Результаты применения полиоксидония у больных раком молочной железы // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, №.1. - С. 96-7.
2. ДавыдовМ.И., Аксель ЕМ. Сб. «Злокачественные новообразования в России и странах СНГ» - 2010 -
3. Борунова А А, Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. Перфориновый потенциал эффекторных клеток у онкологических больных при вакцинотерапии // Вестник Вестник ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2005. - № 3-4. - С. 3-4.
4. Борунова А А, Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Арустамян ЛЮ. Перфорин-опосредованная цитотоксичность лимфоцитов // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, №. 2-3. - С. 273.
5. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Славина Е.Г. NKT-клетки и противоопухолевый иммунитет // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 3. - С.
6. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И, Славина Е.Г. Регуляторные Т клетки и их роль в противоопухолевом иммунном ответе // Вопросы онкологии. - 2009. - Т. 55, № 3. - С. 269-77.
7. Кадагидзе З.Г., Борунова А А, Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н. Субпопуляции Granzyme-B+- лимфоцитов у больных меланомой при вакцинотерапии // Иммунология. - 2008. - № 2. - С. 87-94.
8. Baecher-Allan C, Viglietta V. andHafler DA. Human CD4+CD25+ regulatory T cells // Semin. Immunol. -2004. - 16. - P. 89-98.
9. Jiang H. and Chess L. An integrated view of suppressor T cells subsets in immunoregulation // J. Clin. Investigation. - 2004. - 114(9). - P. 1198-208.
10. Knutson K.L., Krco C.J., Erskine C.L et.al. T-Cell Immunity to the Folate Receptor Alpha Is Prevalent in Women With Breast or Ovarian Cancer // J Clin Oncol. - 2006. - 24. - C. 4254-61.
11. Law R.H., Lukoyanova N, Voskoboinik I. et al. The structural basis for membrane binding and pore formation by lymphocyte perforin // Nature. - 2010. - 468(7322). - C. 447-51.
12. Rousalova I., Krepela E. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation // Int J Oncol. -2010. - 37(6). - C. 1361-78.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
