CC BY
85
УДК 579.66
М. И. Шуктуева (м.н.с)1, А. В. Автономова (к.биол.н., с.н.с.) 1, Я. А. Масютин (студ.)2, А. А. Новиков (к.х.н., м.н.с.) 2, Л. М. Краснопольская (д.биол.н., зав.лаб.) 1
Погруженное культивирование Flammulina velutipes и химический состав мицелия
1 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 11; e-mail: [email protected] 2Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119991, г. Москва, Ленинский просп., д. 65, корп. 1; тел. (499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected]
M. I. Shuktueva1, A. V. Avtonomova1, Ya. A. Masyutin1, A. A. Novikov2, L. M. Krasnopolskaya1
Submerged cultivation and chemical composition of Flammulina velutipes mycelium
1 Gause Institute of New Antibiotics Russian Academy of Medical Sciences, 11, B. Pirogovskaya Str., 119021, Moscow, Russia; e-mail: [email protected] 2Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskiy Pr., 119331, Moscow; ph. (499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected]
В статье приведены результаты работы по оценке влияния источников питания на накопление в погруженной культуре биомассы двух штаммов ПашшиПпа velutipes и оценке химического состава погруженного мицелия одного штамма. Разработан способ погруженного культивирования двух штаммов Б. velutipes, обеспечивающий получение 34—39 г/л воздушно-сухой биомассы на 6—7 сутки ферментации. Способы погруженного культивирования масштабированы для условий лабораторного ферментера. Изучен химический состав погруженного мицелия F.velutipes штамм бу-1. По содержанию всех незаменимых аминокислот за исключением триптофана биомасса F.velutipes соответствовала требованиям ФАО/ВОЗ. Выделеная фракция водорастворимых биополимеров содержала в своем составе рамнозу, фукозу, ксилозу, маннозу, глюкозу и галактозу. В погруженной биомассе F.velutipes обнаружены витамины В1, В6, РР.
Ключевые слова: аминокислотный состав; ба-зидиомицеты; БЫшш^та velutipes; погруженное культвирование; полисахариды.
Submerged cultivation of Flammulina velutipes in various media has been studied. The yield of biomass was shown to depend mainly on the carbon source. Using optimal medium composition, the biomass yield of 34—39 g/l in 6—7 days was achieved. The biomass obtained was characterized by determination of total protein and lipid contents. In addition, amino acid composition of biomass was determined and shown to meet all the requirements of FAO/WHO concerning the amounts of essential amino acids (with exception of tryptophane). The water-soluble polysac-charide fraction was obtained and shown to contain rhamnose, fucose, xylose, mannose, glucose and galactose. The presence of vitamins B1, B6, PP was also detected in the biomass of F. velutipes.
Key words: amino acid composition; Basidiomycetes; Flammulina velutipes; polysaccharide; submerged cultivation.
Поиск и изучение высокопродуктивных штаммов базидиальных грибов были и остаются перспективными направлениями в микологии и биотехнологии. Известно, что базиди-альные грибы являются уникальными продуцентами целого ряда соединений, используе-
Дата поступления 26.09.11
мых в различных отраслях народного хозяйства. Метаболиты базидиомицетов активно используются в области охраны здоровья (в том числе медицины). Известно, что различные соединения грибов могут оказывать иммуно-модулирующее, противоопухолевое, гепатопро-текторное, антибиотическое, противовирусное
и другие действия 1,2 Важным качеством бази-диомицетов является их питательная ценность. Плодовые тела и мицелий базидиомицетов содержат полноценный белок, в котором испытывает дефицит население многих стран мира.
Качественный и количественный состав мицелия и плодовых тел базидиомицетов сильно зависит от условий произрастания и/или культивирования. Самым веским показателем в оценке питательности считается количество и соотношение незаменимых аминокислот в исследуемом продукте. Стандартное высокое количество и качество биомассы возможно получать только в хорошо контролируемых условиях, что в полной мере может обеспечить погруженное культивирование.
Грибы вида Flammulina velutipes (Curtis) Singer — зимний опенок, энокитаке, — привлекают внимание исследователей в связи с многолетней историей использования в кулинарной практике и практике традиционной медицины Китая. Метаболиты F. velutipes обладают противоопухолевыми, антибактериальными, антиоксидантными свойствами 3'4. Погруженную биомассу F.velutipes можно использовать для пищевых целей, получения биологически активных веществ, в качестве посевного материала при производстве плодовых тел. Продуктивность различных штаммов F.velutipes в погруженной культуре различается в зависимости от условий культивирования. Так, например, штамм F.velutipes на среде с глюкозой и пептоном на 7-е сутки роста образовывал до 8.5 г/л воздушно-сухой биомассы 5.
Целью настоящей работы было изучение роста F.velutipes в погруженных условиях, разработка оптимизированных условий культивирования и определение химического состава полученного мицелия.
Материалы и методы исследования
В работе был использован штамм F. velutipes Fv-1 из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных веществ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук.
Культуры хранили на картофельно-глю-козном агаре, содержащем опилки лиственных пород деревьев при 4 оС, выращивали на данной среде при 25 оС в течение 7 сут. Пересевы на свежеприготовленную среду осуществляли один раз в год.
Погруженное культивирование осуществляли в колбах объемом 0.75 л на ротационной качалке со скоростью вращения 220 об./мин. при 25 °С. Среды для погруженного культивирования содержали соли: дигидрофосфат калия и сульфат магния, источник углерода и источник азота. В качестве источников углерода были использованы: глюкоза, растительное масло и меласса, в качестве источников азота: соевая мука, пептон, дрожжевой экстракт с нитратом натрия и кукурузный экстракт с нитратом натрия. Среды стерилизовали при 1.2 атм. 30 мин. Длительность процесса культивирования составляла от 2 до 8 сут. В процессе культивирования оценивали накопление воздушно-сухой биомассы весовым методом. Опыты ставили в трех повторностях. По завершении процесса культивирования погруженную культуру лиофилизировали или мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой и сушили до постоянного веса при температуре, не превышающей 45 оС. Влажность воздушно-сухого мицелия не превышала 7%.
Оптимизацию количественного состава ферментационной среды для погруженного культивирования проводили с применением методов математического планирования эксперимента. Были использованы: метод полного факторного эксперимента и метод крутого восхождения 6. Обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения 51аМ8Пса 6.0.
Для приготовления водных экстрактов навеску сухого мицелия массой 3.6 г заливали 100 мл дистиллированной воды и экстрагировали при избыточном давлении 1.2 атм. в течение 2 ч. Экстракт охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр, доводили до 100 мл стерильной дистиллированной водой. Готовый экстракт хранили при —20 оС.
Суммарную полисахаридную фракцию водного экстракта погруженного мицелия Г. юв1иИрв$ получали путем добавления в водный экстракт четырех объемов 96% этанола. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Затем осадок растворяли в небольшом количестве воды, раствор фильтровали и лиофилизировали. Для определения моносахаридного состава полисахариды подвергали полному гидролизу действием 2М трифторуксусной кислоты в присутствии в качестве маркера мио-инозита. Полученные моносахариды переводили в ацетаты
полиолов, которые идентифицировали и количественно определяли с применением газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе НР 5890А 7.
Определение аминокислотного состава проводили по методу, заключающемуся в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот с помощью аминокислотного анализатора Биотроник ЬС-7000 8.
Определение витаминов В1, В5 и В6 проводили методом ВЭЖХ в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуорометрическим детектированием (интервал длин волн 220—650 нм) 8.
Определение общего содержания жиров
проводили экстракционным методом с предва-
8
рительным гидролизом навески .
Результаты и их обсуждение
Разработка способа погруженного культивирования. Способы погруженного культивирования Г.'ивЫИрвз штамм бу-1 и Г.ювЫИрвз штамм бу-4 были разработаны по описанному ранее методу 9.
На среде, содержащей глюкозу и соевую муку, определяли сутки, на которые приходится максимум накопления воздушно-сухой биомассы, и выход биомассы культур Г.юв1иИрв$ в неоптимизированных условиях. Максимум воздушно-сухой биомассы был получен на 6-е сутки для Г.ювЫИрвз штамм бу-1 и составил 14.2 г/л, для Г.ювЫИрвз штамм бу-4 на 7-е сутки — 14.1 г/л.
На следующем этапе был осуществлен качественный подбор источников питания для каждой культуры. Для этого оба штамма выращивали на двенадцати средах, различающихся
сочетаниями источников углерода и азота. Штамм бу-1 выращивали 6 сут, штамм бу-4 — 7 сут. Наилучшей средой для роста штаммов бу-1 и бу-4 оказалась среда, содержащая растительное масло и соевую муку (рис.).
Для разработки питательных сред с оптимальными соотношениями источников питания для роста культур Г. ювЫИрвз были использованы методы математического планирования эксперимента: полного факторного эксперимента и крутого восхождения.
Увеличение выхода биомассы было достигнуто путем оптимизации питательной среды с применением методов математического планирования эксперимента. Для двух штаммов Г.юв1иИрвз бу-1 и бу-4 были проведены серии экспериментов, включавших полный факторный эксперимент (ПФЭ) и крутое восхождение. ПФЭ был проведен для четырех факторов (растительное масло, соевая мука, дигид-рофосфат калия и сульфат магния) на двух уровнях, всего число комбинаций варьируемых факторов составило 2 4. В результате было выяснено, что на образование биомассы Г.ювЫИрвз штаммов бу-1 и бу-4 статистически значимое влияние оказывают растительное масло и соевая мука. Концентрации соевой муки и растительного масла находились в лимитирующей области, из чего следует, что количество обоих компонентов в среде нужно было увеличивать. На основании данных ПФЭ были поставлены эксперименты по методу крутого восхождения. В этих опытах концентрацию значимых факторов (растительное масло и соевая мука) постепенно увеличивали. Одновременное увеличение концентраций значимых факторов проводили от значений в исходном составе среды, в соответствии с величинами коэффициентов регрессии. Макси-
Рис. 1. Выход воздушно-сухой биомассы Г^еЫПреэ штаммы ру-1 и ру-4 на средах с различным сочетаниями источников углерода и азота
мальный показатель содержания воздушно-сухой биомассы для Г.юв1иИрв$ штамм бу-1 был отмечен на 9-м шаге и составил 38.9 г/л, для Г.юв1иИрв$ штамм бу-4 на 13-м шаге — 36 г/л.
Таким образом, методы математического планирования эксперимента позволяют в несколько раз увеличить выход воздушно-сухой биомассы. Разработанные рецептуры сред для погруженного культивирования Г.юв1иИрв$ штамм бу-1 и бу-4 стабильно обеспечивали выход воздушно-сухой биомассы 37—39 г/л и 34—37 г/л, соответственно. Способы погруженного культивирования масштабированы для условий лабораторного ферментера.
Химический состав Г.юеЫЫрез. Было проведено определение химического состава мицелия более продуктивного штамма бу-1, выращенного в погруженных условиях по разработанному способу.
В мицелии Г.юв1иИрв$ было обнаружено 17 аминокислот. Было показано, что в процентном отношении от общего количества аминокислот больше всего в погруженной биомассе содержалось глутаминовой кислоты (14.7%), пролина (9.4%), аспарагиновой кислоты (9.0%) и лизина (8.8 %), тогда как по данным Бухало 5, доминирующими аминокислотами погруженной биомассы Г.юв1иИрв$ были глицин (11%), глутаминовая кислота (5.6%), треонин (4.8%) и аспарагиновая кислота (4.2%). Содержание незаменимых аминокислот — изолейцина, лейцина, фенилаланина, тирозина, лизина, вали-на, метионина и цистина в мицелии Г.юв1иИрв$ было выше, чем в стандартном белке ФАО/ ВОЗ (табл. 1). Исключение составил треонин, содержание которого было немного ниже оптимального. Больше всего среди незаменимых аминокислот в мицелии Г.юв1иИрв$ было лизина, изолейцина и лейцина. Триптофан в пробе обнаружен не был.
Об общем содержания белка в мицелии судили по сумме аминокислот, составившей 31.6 % от навески биомассы.
Был изучен моносахаридный состав водорастворимой фракции биополимеров, полученной из водного экстракта мицелия Г.юв1иИрв$ путем осаждения этанолом. По данным ГЖХ фракция биополимеров содержала: рамнозу -1.6 %, фукозу — 4.4%, ксилозу — 2.5%, манно-зу — 4.1%, глюкозу — 8.8 %, галактозу — 8.9 %.
Общее количество липидов, выделенных из биомассы Г.юв1иИрв$ штамм бу-1, полученной путем погруженного культивирования по разработанному способу, составило 2.5%.
В погруженной биомассе Г.юв1иИрв$ было оценено содержание витаминов В1, В5(РР), В6. Из вышеперечисленных витаминов больше всего в биомассе Г.юв1иИрв$ содержалось витамина РР — 266 мг/ 100г биомассы. Количество витамина В1 составило 3.2 мг/100 г биомассы, В6 - 7.9 мг/100г.
Таким образом, разработаны способы погруженного культивирования двух штаммов Г.юв1иИрв$, позволяющие получить свыше 30 г/л воздушно-сухой биомассы, тогда как в литературе приводятся более скромные показатели накопления погруженного мицелия Г.юв1иИрв$, варьирующиеся в пределах от 3.2 до 26.5 г/л 11,12. Полученные высокие показатели выхода погруженной биомассы свидетельствуют о преимуществах Г.юв1иИрв$ как биотехнологического объекта и о целесообразности примененной стратегии оптимизации состава жидкой питательной среды. Показано, что сухая биомасса Г. юв1иИрв$ содержит полноценный белок с более высоким содержанием незаменимых аминокислот, чем в эталонном белке ФАО. Это позволяет предположить, что биомасса Г.юв1иИрв$, полученная в условиях погруженной культуры, может являться по-
Необходимый Оптимальный Содержание
Аминокислота уровень НА уровень НА. Эталон ФАО/ВОЗ в мицелии F. velutipes
Изолейцин 1.80 2.80 7.90
Лейцин 2.50 6.60 7.50
Лизин 2.20 5.80 8.80
Метионин + Цистин 2.40 2.50 3.80
Фенилаланин + Тирозин 2.50 6.30 9.00
Треонин 1.30 3.40 3.10
Триптофан 0.65 1.10 -
Валин 1.80 3.50 3.9
Таблица 1
Потребность взрослого человека в незаменимых аминокислотах (НА) согласно рекомендации ФАО/ВОЗ (Food and Agriculture Organization & World Health Organization, 1990) 10 и содержание НА в мицелии F.velutipes (г/100г белка)
тенциальным источником питания с высокой питательной ценностью.
Литература
1. Mizuno T., Wasa T., Ito H., Suzuki C., Ukai N. // Bioscince, Biotechnology and Biochemistry. 1992.- V.56, №2.- P. 347.
2. Wasser S., Weis A. // International Journal of Medicinal Mushrooms.- 1999.- V.3.- P.31.
3. Ikekawa T., Maruyama H., Miyano T., Okura A., Sawasaki Y., Naito K., Kawamura K., Shiratori K. // Japanese journal of cancer rsearch.- 1985.-V.76, №2.- P.142.
4. Gu Y.H., Leonard J. // Oncology reports.-2006.- V.15.- P.417.
5. Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомице-ты в чистой культуре.- Киев: Наукова думка, 1988.- 176 с.
6. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии.- М.:Изд-во МГУ, 1980.- 280 с.
7. Слонекер Дж. Методы исследования углеводов. / Под ред. А. Я. Хорлина.- М.: Мир, 1975.-С. 22.
8. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672-03. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.- 240 с.
9. Краснопольская Л. М., Автономова А. В, Леонтьева М. И., Белицкий И. В., Исакова Е. Б., Бухман В. М. Высокоэффективные способы погруженного культивирования ксилотрофных лекарственных и лекарственно-съедобных видов базидиальных грибов. // в сб. Успехи медицинской микологии. Материалы пятого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 2007.- Т.9.- С.241.
10. Food and Agriculture Organization and World Health Organization. Protein Quality Evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. 1990. http://www.fao.org.
11. Qiong MA. //China Brewing, 2008.- V.11.-P. 15.
12. Shin K.-S., Yu K.-S., Lee H.-K., Lee H., Cho W.-D., Suh H.-J. //Food Technol. Biotechnol., 2007.- V.45.- №3.- P.319.
Исследование проводится в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
