CC BY
35
МЕДИКО-БМОЛОГИНЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
Субклеточные механизмы развития воспалительных реакций
Г.Г.Кругликов1, В.Б.Суслов2, А.П.Эттингер2
1Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета, Москва (зав. кафедрой - акад. РАМН, проф. О.В.Волкова);
2Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований, отдел электронной микроскопии, Москва (директор НИИ - проф. А.П.Эттингер)
В работе представлены результаты исследования клеточных реакций при воспалении методами световой и электронной микроскопии. Экспериментальное воспаление вызывали моделированием пневмокониозов у белых крыс, которым интратрахеально вводили частицы кварца, угля, лунного грунта. Анализировали клетки очага воспаления спустя 1-7, 14 сут и 1, 3, 5 мес после введения образцов. В качестве специфического воспаления изучали клетки туберкулезной гранулемы от больных фиброзно-кавернозной формой туберкулеза легких. Установлено наличие местной иммунной реакции, проявляющейся бласттрансформацией лимфоцитов в активно синтезирующие плазматические клетки. В развитии пневмокониозов цитотоксическая устойчивость макрофагов к фагоцитируемым частицам является определяющей, аутоиммунная реакция выражена незначительно.
Ключевые слова: воспаление, электронная микроскопия, туберкулез, пневмокониоз
Subcellular mechanisms for the development of inflammatory reactions
G.G.Kruglikov1, V.B.Suslov2, A.P.Oettinger2
1N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Histology, and Embryology of Pediatric Faculty, Moscow (Head of the Department - Acad. of RAMS, Prof. O.V.Volkova);
2N.I.Pirogov Russian State Medical University, Research Institute for Basic and Applied Biomedical Studies, Department of Electronic Microscopy, Moscow (Director of the Institute - Prof. A.P.Oettinger)
The results of the study of cellular reactions in inflammation by light and electron microscopy are presented in the article. Experimental inflammation was provoked by simulation of pneumoconiosis in albino rats, which were intratracheally injected with particles of quarts, coal and the lunar soil. There were analyzed the cells of an inflammation chamber in 1-7, 14 days and 1, 3 and 6 months after the introduction of the samples. As a specific inflammation there were studied cells with tuberculous granuloma in patients with fibro-cavernous tuberculosis of the lungs. It was established the presence of local immune reaction, which manifested itself in the blast transformation of lymphocytes actively synthesizing plasma cells. In the development of pneumoconiosis cytotoxic resistance of macrophages to fagocited particles was crucial. An autoimmune reaction was expressed only slightly. Key words: inflammation, electronic microscopy, tuberculosis, pneumoconiosis
Метод электронной микроскопии позволяет исследовать функциональную морфологию клеток, осуществляющих воспалительные реакции. Особенно важной представляется возможность получения информации о субклеточных механизмах (роли органелл) в развитии патологических процессов в органах дыхания - пневмокониозов и туберкулеза.
Необходимость исследования патогенеза пневмоконио-зов продолжает оставаться актуальной в связи с интенсифи-
Для корреспонденции:
Кругликов Герман Григорьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-4174
Статья поступила 20.09.2010 г., принята к печати 01.03.2011 г.
кацией производственных процессов и, соответственно, повышением запыленности атмосферы [1, 2]. Ситуация с легочной патологией настолько серьезна, что пульмонологи относят ряд крупных регионов и городов страны к экологически неблагоприятным [3, 4].
Туберкулез тоже остается глобальной проблемой и не ликвидирован ни в одной стране. В настоящее время эффективность химиотерапии туберкулеза снижается в результате длительного применения противотуберкулезных препаратов и роста лекарственной устойчивости бактерий туберкулеза [5-8].
Задачей данной работы является структурно-функциональный анализ органелл при развитии хронических неспецифических заболеваний легких (пневмокониозов) и хронического инфекционного заболевания туберкулезом легких, не определяемых при светооптическом увеличении.
Материалы и методы
Изучали легкие экспериментальных животных (белых крыс), у которых моделировали развитие пневмокониозов под воздействием пылевых частиц, обладающих различной цитотоксичностью.
Интратрахеальным способом вводили инородные частицы в легкие в дозе 50 мг/мл в физрастворе каждому животному. Использовали пылевые образцы кварца, каменного угля, цеолитов, асбеста и лунного грунта, доставленного советскими автоматическими станциями «Луна-16» и «Луна-20» на Землю.
Развитие воспалительной реакции исследовали через 1-2, 5, 7, 14 сут, 1, 3, 5 мес от начала эксперимента. Экспериментальные группы содержали от 16 до 40 животных.
Морфологию воспалительных реакций также изучали в туберкулезных гранулемах на операционном материале. Клинический операционный материал получен от 8 больных фиброзно-кавернозной формой туберкулеза.
Материал изучали на светооптическом уровне после окраски гематоксилином и эозином, азур-2-эозином для обзорного анализа по методу Ван-Гизона (выявление кол-лагеновых волокон). Для оценки фагоцитарной активности макрофагов готовили препараты-отпечатки легких.
Особенно подробно экспериментальный и клинический материал исследовали методом трансмиссионной электронной микроскопии. Использовались электронные микроскопы Hitachi HU-12 и Leo 912-АВ, обладающие высоким разрешением и цифровым накопителем информации с прямым выходом на печатающее устройство Kodak Professional 8670 PS, что значительно повысило качество анализа исследуемого материала и его документирования. Кусочки легочной ткани фиксировали 2,5% раствором глютаральдегида и дофиксировали 1% раствором четырехокиси осмия. Материал заключали в эпоксидную смолу «Аралдит». Ультратонкие срезы приготовлялись на ультрамикротоме LKB-3.
Результаты исследования и их обсуждение
В легких под воздействием вводимых пылевых частиц развиваются воспалительные реакции - пневмокониозы. Начинается воспаление с выраженной сосудистой реакции. В первые сроки воспаления в микрососудах респираторных отделов отмечаются сгущенная плазма, явления стаза и сладж-феномена. Плазма, обедненная белками (низкой электронной плотности), транспортируется путем пиноцито-за и через расширенные контакты эндотелия сквозь утолщенную базальную мембрану барьера в цитоплазму альвео-лоцитов 1-го типа. Кроме того, значительная часть компонентов плазмы транспортируется через многочисленные поры, образующиеся в эндотелии капилляров альвеолярной стенки. Далее плазма в составе пузырчатых структур, образующихся из цитоплазмы альвеолоцитов 1-го типа, фраг-ментируется на альвеолярную выстилку (рис. 1а).
Патологический процесс интенсивно развивается, в аль-веолоцитах 2-го типа отмечается гиперсекреция осмиофиль-ных пластинчатых телец и экзоцитоз в альвеолярную полость, а цитоплазма остается опустошенной.
Деструктивные процессы захватывают и альвеолоциты 1-го типа, в них наблюдается фрагментация цитоплазмы и даже ее полное разрушение, в результате чего происходит оголение базальной мембраны (рис. 1б). Поэтому в отдельных участках аэрогематического барьера пограничную функцию выполняет только базальная мембрана - утолщенная, отечная, разрыхленная.
В альвеолярных капиллярах выявляется значительное количество лейкоцитов и их эмиграция в ткань. Изредка встречаются мононуклеарные клетки в стадии митотическо-го деления непосредственно в полости капилляра (данные электронной микроскопии). Митотические делящиеся бласт-ные клетки и макрофаги наблюдаются в интерстициальной ткани и альвеолярных полостях.
Рис. 1. Цитологические особенности развития пневмокониоза.
а - аэрогематический барьер, сгущение плазмы в капилляре, истончение цитоплазмы и образование пор в эндотелии; экзоцитоз пузырчатых структур и деструкция альвеолоцита первого типа; б - выраженный транспорт плазмы пиноцитозными везикулами в альвеолярную полость, утолщение базальной мембраны; в - альвеолярный макрофаг с фаголизосомами, содержащими микрочастицы лунного грунта; г - плазматические клетки малого размера с расширенными канальцами гЭПС; замедление секреции пикнотич-ными ядрами.
Г.Г.Кругликов и др. / Вестник РГМУ, 2011, №2, с. 58-61
Одной из основных клеточных форм, определяющих интенсивность воспаления при пневмокониозах, являются макрофаги. Макрофаги осуществляют интенсивный фагоцитоз инородных частиц и деструктивных клеток. Наиболее информативный метод изучения фагоцитоза - анализ клеток на препаратах-отпечатках, где клетки располагаются в один слой и четко просматривается содержимое цитоплазмы, что позволяет проводить количественную оценку захваченного материала. В цитоплазме макрофагов наблюдается различное количество захваченных частиц, часто клетки переполнены поглощенным материалом и разрушаются.
Электронно-микроскопические исследования фагоцитирующих макрофагов позволяют анализировать структурно-функциональное состояние органелл при контакте с пылевыми частицами. Анализ показал, что наибольшее воздействие на органеллы оказывают микрочастицы кварца, возле которых появляются зоны коагулированного белка и протео-литические полости, а митохондрии отечны с фрагментиро-ванными кристами. Вокруг фагоцитированных частиц лунного грунта, угля зоны коагуляции не выявляются, но хорошо развиты лизосомы и крупные фаголизосомы, содержащие микрочастицы, вблизи которых группируются митохондрии с отечным матриксом (рис. 1в). В цитоплазме фагоцитирующих макрофагов накапливаются остаточные мембранные тельца различной морфологии и плотности. При фагоцитозе минеральных частиц, особенно кварца, значительная часть фагоцитов погибает. Процесс фагоцитоза многократно повторяется, при этом часть частиц, поглощенных макрофагами, постепенно перемещается по мукоцилиарному эскалатору в ротовую полость, другие частицы переносятся макрофагами с лимфой в лимфоузлы, где окончательно депонируются. Фагоцитоз минеральных частиц всегда остается незавершенным, так как у фагоцитов отсутствуют ферменты, способные их переваривать.
Для экспериментальных исследований пылевые частицы очень интересный объект, который в качестве специфической метки всегда можно проследить в тканях и клетках и оценить степень их патологического воздействия.
В результате разрушения большей части фагоцитирующих макрофагов, поглотивших частицы, выделяются факторы роста, стимулирующие размножение фибробластов и их синтетическую активность. Фибробласты вырабатывают большое количество коллагеновых волокон узелкового характера, изолирующих инородные частицы от окружающих тканей и замещающих респираторные отделы. Кроме того, происходит отложение коллагеновых волокон непосредственно в аэрогематическом барьере между альвеолоцита-ми и эндотелием капилляров, что нарушает процесс газообмена. Выявление патологических образований в виде первичных коллагеновых волокон в барьере возможно только с помощью метода электронной микроскопии.
Наиболее мощный фиброз развивается под воздействием кварцевых частиц, самый незначительный - при введении угля, остальные пылевые образцы (лунный грунт, асбест, цеолиты) вызывают фиброзный процесс, занимающий по степени интенсивности промежуточное положение.
В развитии воспалительной реакции под воздействием минеральных частиц принимают участие и иммунные механизмы. На поле воспаления встречаются плазматические
клетки. Под воздействием минеральных частиц меняются свойства высокомолекулярных белковых образований и развивается аутоиммунный процесс. Плазмоциты располагаются группами по 5-7 клеток, преимущественно вблизи кровеносных капилляров. Плазмоциты имеют небольшие размеры (типа большого лимфоцита), в цитоплазме фиксируются сильно расширенные канальцы гранулярной эндо-плазматической сети, заполненные хлопьевидным материалом, другие органеллы не выявляются, ядра у некоторых клеток очень малых размеров с признаками пикноза (рис. 1г). Данные морфологические признаки плазматических клеток отражают процессы деструкции и нарушения взаимодействия между синтезом и секрецией антител. Встречаются плазматические клетки, лишенные части плаз-молеммы и с сильно пикнотичными ядрами, признаками необратимых патологических изменений и разрушения клеток.
Рис. 2. Цитологические особенности развития туберкулеза.
а - эозинофильный лейкоцит с внутриклеточной деструкцией специфических гранул; б - тучная клетка, деструкция гранул - секреция медиаторов воспаления; в - макрофаг с лизированными микобак-териями; г - плазматическая клетка с признаками интенсивной секреции.
Воспалительные реакции при туберкулезе легких отличаются более разнообразным клеточным составом. Среди клеток туберкулезной гранулемы, изучаемой в период обострения процесса, в большом количестве встречаются зернистые лейкоциты, особенно эозинофильные лейкоциты с признаками внутриклеточной дезинтеграции гранул. В специфических гранулах эозинофилов происходит разрушение кристаллоида и выделение основного белка в межклеточную среду (рис. 2а). На поле воспаления выявляется большое число активированных лимфоцитов: с увеличенной массой ядра и цитоплазмы, с множеством крупных митохондрий, с небольшими канальцами гранулярной эндоплазма-тической сети (гЭПС) и полирибосомами, т.е. признаками бласттрансформации. Лимфобласты постепенно дифференцируются в плазмоциты. Зрелые плазмоциты имеют крупные размеры, многочисленные параллельные канальцы гЭПС, очень крупные митохондрии, центриоли, ядра с глыб-чатым хроматином вдоль кариолеммы с большим числом пор и крупным ядрышком (морфологические признаки активной секреции антител (рис. 2г)). Встречаются также единичные тучные клетки, гранулы которых находятся в стадии внутриклеточной дезинтеграции, т.е. с признаками мерокри-новой секреции медиаторов воспаления в межклеточную среду (рис. 2б).
Среди клеток гранулемы наблюдаются макрофаги. Они небольших размеров, обедненные органеллами, содержат фагоцитированные микобактерии с признаками лизиса различной интенсивности. Бактерии также встречаются в межклеточной среде (рис. 2в).
Полученные результаты исследования хронического инфекционного заболевания туберкулезом в период активации процесса выявили ряд субклеточных механизмов (скрытых при использовании световой микроскопии), полнее раскрывающих особенности развития данной воспалительной реакции. Прежде всего, это внутриклеточное разрушение специфических гранул в эозинофилах и тучных клетках и секреция медиаторов воспаления, усиливающая хронический процесс.
Принципиальное значение имеют данные об интенсивной местной иммунной реакции непосредственно в туберкулезной гранулеме, проявляющейся множественной дифферен-цировкой лимфоцитов в плазматические клетки с хорошо выраженными синтетическими и секреторными функциями. Большое число крупных плазматических клеток с интенсив-
ной секрецией обеспечивает развитие местной иммунной реакции. В макрофагах, фагоцитирующих микобактерии туберкулеза, слабо выражен лизосомальный аппарат. Отмеченные клеточные особенности отличают развитие туберкулезной гранулемы от патогенеза экспериментальных пневмокониозов. В развитии пневмокониозов основная роль принадлежит макрофагам (с развитым лизосомальным аппаратом и интенсивным фагоцитозом) и фибробластам, формирующим фиброз, а аутоиммунные процессы не являются определяющими.
Приведенные субклеточные механизмы развития воспалительных реакций следует учитывать при изучении патогенеза туберкулеза и пневмокониозов, а также при их лечении.
Литература
1. Величковский В.Т. Фиброгенные пыли. - Горький, 1980. - 159 с.
2. Кругликов Г.Г., Величковский В.Т. Ультраструктурные особенности аэрогема-тического барьера при развитии пневмокониозов // Пульмонология. - 2008. -№6. - С.77-79.
3. Чучалин А.Г. Актуальные вопросы пульмонологии // Пульмонология. - 1991. -№1. - С.6-8.
4. Величковский В.Т. Экологическая пульмонология. - Екатеринбург, 2003. - 139 с.
5. Ерохин В.В. Функциональная морфология легких. - М.: Медицина, 1987. -272 с.
6. Мишин В.В. Химиотерапия туберкулеза легких // Пульмонология. - 2008. -№3. - С.5-14.
7. Пауков В.С., Кругликов Г.Г., Угрюмов А.И. Изменения туберкулезной гранулемы при обострении заболевания. - В кн.: Научно-практическая конференция и школа по инфекционной патологии (с международным участием). Сб. научн. трудов. - М., 2007. - С.85.
8. Тернер-Уорвик М. Иммунология легких / Пер. с англ. - М.: Медицина, 1982. -272 с.
Информация об авторах:
Суслов Владимир Борисович, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела электронной микроскопии НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-6429
Эттингер Александр Павлович, доктор медицинских наук, профессор, директор НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-1401
