Стволовые клетки костного мозга в лечении критической ишемии нижних конечностей: биологические аспекты и клиническое применение Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

DOI: 10.23868/201805002

стволовые клетки костного мозга в лечении критической ишемии нижних конечностей: биологические аспекты и клиническое применение

П.Ю. Орехов1, М.А. Коноплянников1, 2, В.П. Баклаушев1, В.А. Кальсин1, А.В. Аверьянов1, А.Г. Коноплянников3, Р.И. Хабазов1, А.В. Троицкий1

1 Федеральный научно-клинический центр ФМБА России, Москва, Россия

2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины, Москва, Россия

3 Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава РФ, Обнинск, Россия

Bone marrow stem cells for the critical limb ischemia treatment: biological aspects and clinical application

P. Yu. Orekhov1, M.A. Konoplyannikov1, 2, V.P. Baklaushev1, V.A. Kalsin1, A.V. Averyanov1, A.G. Konopliannikov3, R.I. Habazov1, A.V. Troitskiy1

1 Federal Research Clinical Center FMBA of Russia, Moscow, Russia

2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Institute for Regenerative Medicine, Moscow, Russia

3 A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center (National Medical Research Center for Radiology), Obninsk, Russia

e-mail: averYanovav@mail.ru

Клеточная терапия является одним из самых перспективных направлений в лечении критической ишемии нижних конечностей (КИНК). Несмотря на достигнутые в последние десятилетия в этой области определенные успехи, связанные с применением стволовых клеток костного мозга (СККМ), все еще остается много нерешенных вопросов. В настоящем обзоре подробно рассматриваются биология СККМ, механизмы оказываемого ими терапевтического эффекта при лечении КИНК, а также детально обсуждаются результаты наиболее значимых клинических исследований, проводившихся на основе СККМ.

ключевые слова: критическая ишемия нижних конечностей, стволовые клетки костного мозга, мультипотентные ме-зенхимальные стромальные клетки, клеточная терапия, регенеративная медицина.

Cell therapy is one of the most promising directions in the treatment of critical limb ischemia (CLI). In spite of certain advances achieved in this field in the last decades, which are related to application of bone marrow stem cells (BMSC), a large number of problems still remain unsolved. In this review, we discuss the BMSC biology, mechanisms of their therapeutic effect in the CLI treatment and results of the most notable BMSC-based clinical studies in detail.

Keywords: critical limb ischemia, bone marrow stem cells, mesenchymal stem cells, cell therapy, regenerative medicine.

введение

С момента публикации в 2007 г. руководства TASK II [1] не было сообщений о масштабных эпидемиологических исследованиях, свидетельствующих о значимом снижении частоты критической ишемии нижних конечностей (КИНК). Несмотря на заметные достижения оперативных, особенно эндоваскулярных методов лечения, КИНК, по-прежнему, связана с высокой частотой ампутаций, летальностью и низким качеством жизни, что подтверждается недавними публикациями [2, 3]. КИНК зачастую представляет собой пограничное состояние, когда компенсаторные возможности во многом исчерпаны, но эффективное медицинское вмешательство еще возможно. Целью этого вмешательства является ликвидация выраженного дисбаланса между кровоснабжением ишемизированных тканей и их метаболическими потребностями.Физиологический компенсаторный артериогенез, активно протекающий на начальных стадиях ишемии конечности, к моменту перехода патологии в финальные стадии практически завершается, и эффективность дальнейшей стимуляции коллатерального роста артериол представляется сомнительной. Поэтому усилия исследователей сосредоточены на технологиях, основанных на молекулярно-клеточных механизмах тканевой и внутриклеточной репарации, которые приводят к росту и активизации микрососудистого русла (ангиогенеза) конечности [4]. Одной из таких технологий является имплантация стволовых клеток (СК). Уже 15 лет прошло с первого применения клеточной терапии (КлТ) в лечении так называемых

«no option» пациентов с КИНК, т. е. когда исчерпаны все возможности стандартной терапии, открытых и эндоваскулярных методов лечения [5]. При запросе по ключевым словам «критическая ишемия конечностей» и «клеточная терапия» в поисковике PubMed находится более 330 работ. Этому вопросу стало уделяться большее внимание и в отечественной литературе [6-12]. Общей тенденцией в публикациях является свидетельство безопасности и относительной эффективности клеточной терапии КИНК [5, 13, 14]. Расхождения в оценках эффективности связано со многими причинами. Среди ключевых проблем остается выбор клеточного агента, т. е. какой тип клеток оптимален для проведения КлТ при КИНК. У взрослых костный мозг (КМ) является основным резервуаром для стволовых и прогениторных клеток, которые могут стимулировать восстановление и рост кровеносных сосудов. Поскольку мало прямых сравнений эффективности различных субпопуляций стромальных клеток костного мозга (СККМ), остается неясно, какая именно из данных субпопуляций является оптимальной для лечения КИНК. Исследования на животных показали, что различные субпопуляции СККМ могут улучшить васкуляризацию ишемизированных конечностей [15]. Одним из наиболее перспективных направлений является применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (mesenchymal stromal cells — МСК), которые сохраняют способность к неоваскуляризации в условиях КИНК и дают возможность их аллогенного применения [16]. Также предполагается, что комбинация разных типов клеток может

принести заметную пользу за счет дифференцировки в различные типы зрелых клеток, а также благодаря взаимодействию между ними.

С клинической точки зрения важными представляются не только безопасность и потенциальная терапевтическая эффективность какой-то конкретной клеточной популяции, но и вопросы, связанные с применением СК в рутинной практике: доступность и инвазивность их получения, проблемы культивирования и хранения, иммунизация реципиента, вопросы повторной трансплантации и т. д.

определение, свойства, тканевое

распределение и источники мононуклеарных

стволовых клеток костного мозга человека

Клеточный состав КМ неоднородный по происхождению и морфологии; клетки КМ представлены на разных стадиях своего развития, среди них значительный процент составляют мононуклеарные клетки КМ (bone marrow mononuclear cells — BMMNCs), которые имеют одно ядро, обладают ангиогенными свойствами и не относятся к кроветворению [17, 18]. Таким образом, BMMNCs-фракция — это обширный источник различных субпопуляций клеток [19-21], которые могут быть использованы в технологиях регенеративной медицины [22].

Среди BMMNCs-фракций все большее внимание привлекают МСК, которые являются негемопоэтическими мультипотентными клетками и кроме КМ, представляют гетерогенную субпопуляцию стволовых клеток стромы различных тканей [23-25].

МСК были впервые выделены из костного мозга А.Я Фриденштейном и его сотрудниками в 1968 г. [26]. Кроме КМ, МСК были обнаружены почти во всех постна-тальных органах и тканях, включая жировую клетчатку, пульпу зуба, синовильные мембраны и жидкости, кожу, трабекулярную кость, суставные хрящи, пуповинную кровь, плаценту, пуповину, хорион и т. д. [23, 25, 27-34]. МСК, полученные из небольшого кусочка ткани с помощью культивирования, могут дифференцироваться в костные, жировые, хрящевые, миокардиальные и эндо-телиальные клетки. МСК также обладают способностью ингибировать гибель клеток. Все это делает их привлекательными в качестве клеточного источника для сердечно-сосудистой реваскуляризации [32-34].

Для получения МСК наиболее часто используется КМ [23, 25], хотя в нем они представляют очень малую фракцию от общей популяции ядерных клеток КМ (0,001%-0,01 %). Жировая ткань, пуповинная кровь и пуповина обычно рассматриваются как главные альтернативные источники МСК КМ [35]. Появляется все больше аргументов в пользу жировой ткани как источника аутогенных МСК, поскольку она легко доступна в больших количествах при небольшом дискомфорте ее получения для пациента [36, 37], а пролиферация и потенциал дифференцировки МСК жировой ткани эквивалентен МСК КМ [36].

Несмотря на сходные биологические характеристики МСК, выделенных из различных тканей, существенные отличия между ними все-таки имеются [38]. Исходя из этого, актуальным остается определение наиболее подходящих источников получения МСК для будущего применения в клинической практике.

механизмы действия Сккм в условиях ишемии

Цели клеточной терапии при КИНК — улучшение кровоснабжения и репарации ишемизированных тканей, достигаются несколькими путями:

1. уплотнение васкуляризации тканей и увеличение тканевой микроперфузии на уровне капиллярного русла;

2. ремоделирование соединительной ткани, что обеспечивает рост новых капилляров и увеличение обмена интерстициальной жидкости;

3. изменение направления ответного воспалительного процесса от разрушения тканей к заживлению.

Реализация этих путей происходит посредством нескольких механизмов, вероятно присущим в той или иной мере всем СК: миграция, пролиферация, тканеспецифи-ческая дифференцировка, способность к синтезу комплекса трофических и (или) ростовых факторов и других биологически активных молекул. Специфичность действия СК определяется их фенотипической принадлежностью к тому или иному типу ткани и молекулярно-кле-точными характеристиками микроокружения. Так как комбинация этих механизмов может иметь синергетиче-ский характер, комплексное применение различных клеток-предшественников (мехенхимальных, эндотелиаль-ных и противовоспалительных) должно играть важную роль в улучшении терапевтического воздействия [39].

Миграция, хоуминг и дифференцировка СККМ

Данные о миграции в очаг ишемии (хоуминг), диффе-ренцировке и участии в ангиогенезе были получены на основании экспериментов in vitro [40, 41] Предполагается, что in vivo стволовые клетки, особенно МСК, также могут мигрировать в поврежденные и воспаленные ткани из кровотока и оказывать терапевтический эффект [42, 43]. Имплантированные МСК под воздействием микроокружения могут дифференцироваться по крайней мере в 3 типа клеток [35]:

1) тканеспецифические клетки поврежденной ткани, например, в кардиомиоциты, гладкомышечные клетки и сосудистые эндотелиальные клетки;

2) функционально родственные клетки, которые нужны для соответствующей ткани организма-хозяина. Такой тип дифференцировки, возможно, принимает участие в создании особого микроокружения для тканевой репарации;

3) регуляторные клетки, которые участвуют в восстановлении и регенерации тканей через секрецию цитокинов с трофической и иммуномодуляторной активностью.

Механизмы, которые контролируют процесс диффе-ренцировки МСК в различные типы клеток еще плохо изучены. Воздействие микроокружения в разных тканях еще более усложняет этот процесс. Некоторые гипотезы предполагают, что гены или особые белки, содержащиеся в МСК, активируются под воздействием окружающей микросреды, что определяет в конечном итоге результат дифференцировки.

Для лечения КИНК наиболее важным свойством МСК, извлеченных из различных источников [24, 44-46], является дифференцировка в гладкомышечные и сосудистые эндотелиальные клетки, которые участвуют в ремоделировании сосудов.

Сложный процесс взаимодействия между МСК, глад-комышечными и эндотелиальными клетками приводит к увеличению пролиферации и миграции этих клеток, что обеспечивает персистенцию сосудистых зачатков (пре-существующих сосудов) в дозо- и времязависимом формате и быстрый рост сосудов [47, 48].

Еще одной важной особенностью с точки зрения терапевтического применения при КИНК, является способность МСК из различных источников вызывать регенерацию скелетных мышц, и наиболее эффективны в этом плане МСК жировой ткани [49], а МСК, инкубированные в условиях гипоксии (гипоксического прекондициони-рования), могут еще больше усиливать регенерацию

скелетных мышц [50]. Более того, МСК могут быть «запрограммированы» на определенный тип дифференци-ровки перед трансплантацией, что снижает вероятность аберрантной дифференцировки [51].

Тем не менее, существует ряд спорных вопросов, касающихся механизмов реализации ангиогенного потенциала СК. Возможность замещения погибших или поврежденных клеток сосудов введенными извне СК пока не получила достаточного экспериментального подтверждения. Прежде всего, это касается высокоспециализированных клеток, например нейрональных [4, 52, 53].

Также не существует прямых доказательств тому, что трансплантированные стволовые клетки могут встраиваться в стенку капилляра с последующей дифференцировкой в зрелые эндотелиоциты [4, 54]. Считается, что количество МСК, подвергающихся дифференцировке в клетки сосудистых структур, крайне мало — менее 1 % [48].

Еще больше проблема усугубляется у пожилых больных с атеросклерозом периферических артерий (АПА). С увеличением возраста пациента, наличием сопутствующих заболеваний и факторов риска, значительно уменьшается количество активных СК в КМ, снижается их терапевтический потенциал и, следовательно, снижается эффективность терапевтического ангиогенеза [55, 56].

Паракринные и трофические эффекты МСК

Результаты многочисленных экспериментов in vitro и in vivo демонстрируют, что терапевтический эффект СККМ заключается не только в их способности восстанавливать поврежденные ткани за счет процессов миграции в очаг повреждения (хоуминг), пролиферации и дифференцировки.

Контрастирование сосудистого русла после КлТ показывает, что у пациентов с КИНК еще возможно увеличение объема кровоснабжения за счет резерва функционально незадействованных коллатеральных артерий. По-видимому, рост сосудов в данной ситуации обусловлен паракринным воздействием трансплантированных СК на те коллатерали, которые потеряли способность к расширению в ответ на «стресс» гидродинамического растяжения из-за повышения артериального давления над местом окклюзии магистральной артерии, что происходило на ранних стадиях окклюзирующего процесса [4]. Также обнаружено, что экзогенно введенные СККМ могут изменять микроокружение за счет активации эндогенных прогениторных клеток и секреции трофических и (или) ростовых факторов и других биологически активных молекул (цито- и хемокинов). Результатом противовоспалительного и иммуносупрессивного влияния на микроокружение, активации ангиогенеза и нейрогенеза, стимуляции и повышения функциональной активности резидентных (тканеспецифичных) СК и включения их в репаративные процессы является цитопротекция и повышение выживаемости клеток в условиях ишемии [4, 54, 57-65].

Секреция каждого из факторов зависит от источника получения этих СК: из жировой ткани, костного мозга, плю-рипотентных стволовых клеток [24, 66]. СККМ, и, в частности, МСК, секретируют трофические стимуляторы, включая матриксные гликопротеины, цитокины и ростовые факторы, а также факторы, обеспечивающие прямое межклеточное взаимодействие. Эти трофические факторы не только подавляют воспаление, апоптоз и фиброз поврежденных тканей, но и стимулируют регенерацию тканей. Трофические эффекты МСК наблюдались в эксперименте при разных патологиях, включая радиационные ожоги, инфаркт миокарда, болезнь Паркинсона и т. д. Предполагается, что МСК могут реализовать свои трофические эффекты даже в острую фазу травмы или заболевания [35].

МСК чувствительны к факторам окружающей среды и могут модифицировать свою активность и функциональность в зависимости от биомолекулярного контекста, проявляя удивительную приспособляемость [54, 60-64]. Это свойство оказалось чрезвычайно важным в условиях критической ишемии, поскольку трансплантированные клетки попадают в неблагоприятную среду с низким содержанием кислорода, глюкозы и рН. Однако, МСК достаточно устойчивы к апоптозу вследствие голодания или гипоксии [67]. Как уже отмечалось, гипоксия повышает способность МСК усиливать регенерацию скелетных мышц [50]. Интерес представляет исследование, в котором МСК, подвергнутые воздействию гипоксии, in vitro продуцировали больше эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), а их трансплантация в ишемизированную конечность крысы приводила к образованию более плотной сосудистой сети по сравнению с трасплантированными МСК, культивированными в условиях нормоксии [68].

Несмотря на многочисленные данные, вопрос улучшения перфузии под воздействием МСК, все еще остается плохо изученным. Эксперименты на моделях животных показали, что МСК остаются в инъецированной конечности только на короткий период времени и встраивание в сосудистую сеть не коррелирует с наблюдаемым проангиогенным эффектом [69, 70].

Поскольку предполагается, что МСК воздействуют либо через паракринные эффекты, либо напрямую за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки [60], либо опосредованно через привлечение ангиогенных моноцитов, то не совсем понятно, дает ли трансплантация МСК дополнительное преимущество (например, за счет хоуминга) по сравнению с применением только секрети-руемых факторов роста [51].

Противовоспалительные

и иммуномодуляторные свойства МСК

Имеется много доказательств иммуномодулятор-ных и противовоспалительных свойств МСК, которые были описаны относительно недавно и играют большую роль в процессах заживления [54, 58, 65, 71, 72]. Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, изучены еще недостаточно. Предполагается несколько путей их реализации:

МСК любого происхождения слабо или совсем не экс-прессируют основные молекулярные комплексы гисто-совместимости и обладают иммуносупрессивными свойствами [73, 74];

МСК способны подавлять активацию и пролиферацию Т- и В-лимфоцитов [75-77];

МСК способны изменять микроокружение в поврежденных тканях и защищать их через высвобождение факторов, подавляющих воспаление и апоптоз, и таким образом устранять дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в поврежденной ткани [78]. Появляются доказательства, что МСК проявляют антибактериальную активность, что еще более усиливает процессы заживления [65]. Благодаря иммономоду-ляторным свойствам, возможно применение МСК при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний [79, 80], а также синдрома «трансплантат против хозяина» с помощью аллогенных МСК.

Безопасность и побочные эффекты при

клиническом применении клеток костного мозга

В исследованиях, посвященных КлТ, вопросы осложнений и побочных эффектов имели приоритетное значение в течение последних 15 лет. В результате получено

достаточно доказательств безопасности введения человеческих СККМ при разных заболеваниях [59], в т. ч. со сроком наблюдения до 11 лет [81].

Эффективность и безопасность трансплантации аутогенных СК при стимуляции коллатерального кровообращения неоднократно отмечалась в многочисленных работах [2, 5, 82-90]. Проспективное ран-домизированое двойное слепое мультицентровое исследование ПЕБТОПЕ-Ш по изучению безопасности и эффективности терапии КИНК путем внутримышечного введения СККМ было проведено в 18 центрах США на 86 пациентах, со сроком наблюдения 12 мес. Значимых различий между группами по количеству нежелательных эффектов зафиксировано не было: большинство нежелательных эффектов было расценено как «не связанные» или «вероятно не связанные» с проводимой КлТ, а обусловленные основным заболеванием. Анализ данных ПЕБТОПЕ-Ш исследования показал, что внутримышечное введение аутогенных СККМ безопасно, хорошо переносится больными, а также демонстрирует значительное улучшение состояния поврежденной конечности пациентов [39].

При оценке 10 рандомизированных клинических исследований (РКИ) было выявлено, что все осложнения (кратковременные легкие боли, кровотечения и гематомы в точках забора КМ) были связаны с процедурой аспирации. В целом, терапия СККМ оказалась безопасной и хорошо переносимой, а соотношение побочных эффектов в основной и контрольной группах было одинаковым [91]. Никаких других отклонений, аллергических реакций, патологического ангиогенеза или туморогенеза выявлено не было. В детальном обзоре Б.М. Peeteгs Weem и соавт. (2015), где представлены данные мета-анализа большого количества плацебо-контролируемых клинических испытаний безопасности и эффективности терапии КИНК при помощи СККМ, также отмечена относительная безопасность данного метода лечения — наблюдаемые побочные эффекты были умеренно выраженными и транзиторными. Наиболее часто встречались боли в области аспирации КМ, снижение гематокрита без симптомов, гематомы, тромбозы стентов, псевдоаневризмы, умеренная гипо-тензия после аспирации и трансплатации [91].

В настоящее время появляются многочисленные свидетельства безопасности трансплантации СККМ при больших сроках наблюдения. Пятилетнее наблюдение за 21 больным после применения СККМ при лечении КИНК не выявило ни одного случая малигнизации или клинически значимой пролиферативной ретинопатии, и только у 3 (14 %) пациентов были отмечены серьезные кардиальные осложнения [92]. Отечественные исследователи также сообщают о длительном периоде наблюдения (до 12 лет) за пациентами после терапии аутогенными клетками-предшественниками эндоте-лиобластов, отмечая отсутствие побочных эффектов и нежелательных явлений [10]. Тем не менее, в работе Т.В. ,_1ог^оп и соавт. (2012), описаны серьезные осложнения, возникшие у 4 из 9 пациентов после клеточной терапии КИНК, причем у 2 пациентов, по мнению авторов, осложнения были непосредственно связаны с проводимой клеточной терапией [93]. Однако причина осложнений может заключаться в том, что в данном исследовании использовались аутогенные мононуклеар-ные клетки периферической крови, а не КМ.

В работах Э.Р. Lasala и соавт. (2010, 2012), где применялась комбинация МСК и других мононуклеарных клеток КМ (ВММ1\^), побочные эффекты отсутствовали, что говорит о безопасности использования не только

изолированных фракций, но и комбинации клеточных агентов [94, 95].

Таким образом, имеющиеся данные позволяют говорить о достаточной степени безопасности и низком риске осложнений, непосредственно связанных с КлТ (табл. 1). Наиболее часто осложнения вызваны процедурой аспирации костного мозга, что заставляет задуматься об использовании аллогенных клеток, особенно у пожилых и ослабленных больных.

результаты лечения критической

ишемии нижних конечностей стволовыми

клетками костного мозга

К настоящему времени нет единой оценки эффективности клеточной терапии при КИНК. Несколько крупных клинических исследований показали, что введение СККМ улучшает результаты лечения КИНК [14, 15, 96, 97], с крайне высокой эффективностью в отдельных случаях [84].

Результаты многих клинических исследований демонстрируют сходные данные по показателям уменьшения интенсивности болевого синдрома, увеличения дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ) и ТсРО2 [98]. Уменьшение болей в течение короткого периода времени после применения СК у больных с КИНК связывают с нейрональной регенерацией [99]. Эффективность терапии с применением различных клеточных агентов (высокий уровень выживаемости и сохранения конечности) доказана и в отечественных работах [7, 8, 10-12]. Однако следует обратить внимание, что между исследованиями, как отечественными, так и зарубежными, есть заметные различия по типу и количеству оцениваемых критериев.

Наибольшее внимание заслуживают масштабные исследования со строгим дизайном. В РКИ RESTORE-CLI [39] использовано несколько клинических критериев оценки эффективности. По важнейшим из них (выживаемость без ампутаций и заживление язв), а также по комбинированным клиническим показателям было показано превосходство КлТ по сравнению с контролем.

Эффективность терапии зависит от стадии КИНК, хотя не во всех случаях эта закономерность прослеживается. По данным мета-анализа 6 РКИ применение СККМ при КИНК [100] значительно снижало частоту ампутаций, улучшало заживление трофических язв и повышало выживаемость без ампутаций почти у всех пациентов, кроме пациентов с наиболее тяжелой степенью КИНК (Rutherford class 6), что может быть объяснимо тяжестью расстройств в данном случае. В исследовании PROVASA также показано значимое улучшение в общей группе пациентов по частоте заживлении язв и купирования боли при имплантации BMMNCs по сравнению с группой плацебо-контроля [87], за исключением пациентов с исходной ишемией Rutherford class 6, фактически не отвечавших на терапию и имевших плохой клинический результат, который вероятно был детерминирован очень запущенной стадией процесса.

В целом, по результатам работ до 2013 г. было сделано заключение, что КлТ является многообещающей стратегией в лечении КИНК. Так, мета-анализ M. Teraa и соавт. (2013) выявил преимущества КлТ по сравнению с традиционной терапией, однако уже тогда были обнаружены расхождения в эффективности КлТ между плацебо-контролируемыми и неконтролируемыми исследованиями [101]. Более поздний мета-анализ 2015 г. [91], включивший еще 5 крупных РКИ [102-106], был основан уже на результатах

10 рандомизированных плацебо-контролируемых исследований 499 пациентов с КИНК, зарегистрированных в крупнейших (The MEDLINE, Embase, and the Cochrane Controlled Trials Register) базах данных. В основном было использовано внутримышечное введение клеток (8 из 10) и только в 2 случаях — внутри-артериальное. Не было найдено преимуществ КлТ над плацебо-контролем по таким параметрам как выживаемость, частота ампутаций, частота заживления язв и выживаемость без ампутаций. Авторы мета-анализа пришли к заключению, что гетерогенность исследований затрудняет понимание роли факторов, влияющих на терапевтический эффект, и только однородные исследования с более совершенным дизайном позволят разобраться в причинах этого неожиданного результата и более полно раскроют потенциал КлТ.

Еще более крупный сравнительный мета-анализ 25 контролируемых исследований КлТ по сравнению с «неклеточным» лечением проведен в 2016 [107]. Первичная оценка показала достоверное снижение количества ампутаций и достоверное повышение выживаемости без ампутаций, а также более частое заживление язвенных дефектов, возрастание ЛПИ и TcPO2,

уменьшение болевого синдрома и улучшение ходьбы. В то же время анализ подгрупп выявил значительную гетерогенность по способам контроля, дизайну исследования, путям введения, и обнаружил, что для оценки показателя «летальность от всех причин» требуется большее количество обследованных пациентов, которое по расчетам должно составить не меньше 3400 случаев. Авторы делают уже традиционное заключение о том, что только большее количество рандомизированных контролируемых исследований с хорошим дизайном способно привести к более строгим выводам.

Значительный интерес представляют работы, анализирующие отдаленные последствия КлТ при КИНК. В публикации T.W. Liang и соавт. (2016) сообщаются превосходные результаты применения мононуклеар-ных клеток костного мозга при лечении КИНК у 21 пациента через 5 лет наблюдения [92] (табл. 2). Авторы считают, что достигнутый эффект от КлТ даже сопоставим с открытыми или эндоваскулярными вмешательствами, подчеркивают высокую безопасность КлТ, однако, как и в ранее упомянутых работах, для более точных выводов требуются дальнейшие исследования на больших группах пациентов [92].

таблица 1. Осложнения и побочные эффекты клеточной терапии

Источник Вид КлТ Заболевание Значимость и характер ПЭ, НЯ/СНЯ Вид осложнений, ПЭ, НЯ/СНЯ

G.P. Lasala и соавт. (2010, 2012) [94, 95] Комбинация МСК и других ВММ\С ХАН 2Б-4 Умеренно выраженные, транзиторные Боли в области аспирации КМ, снижение гематокрита без симптомов, умеренная гипотензия

R.J. Powell и соавт. (2011) [39] Аутогенные СККМ КИНК Значимых различий между плацебо и основной группой не было; НЯ/СНЯ были «не связанные» или «вероятно не связанные» с проводимой КлТ (94/44 % — НЯ/СНЯ в группе лечения, 100/57 %% — НЯ/ СНЯ в контрольной группе. По 1 летальному исходу в каждой группе без связи с КлТ

F. Liu и соавт. (2012) [100] Аутогенные СККМ КИНК Значимых различий между плацебо и основной группой не было; умеренно выраженные и транзиторные Легкие боли, кровотечения и гематомы в после аспирации КМ

S.M. Peeters Weem и соавт. (2015) [91] Аутогенные СККМ КИНК Умеренно выраженные и транзиторные Боли в области аспирации КМ, снижение гематокрита без симптомов, гематомы, тромбозы стентов, псевдоаневризмы, умеренная гипотензия после аспирации и трансплантации

E. Benoit и соавт. (2013) [89] Аутогенные СККМ КИНК Слабо выраженные и транзиторные Снижение гематокрита на 2,6 % по сравнению с контролем без нестабильности гемодинамики и необходимости специфической терапии

T.W. Liang и соавт. (2016) [92] ВММ\^ КИНК Умеренно выраженные и транзиторные 3 (14 %) серьезных кардиальных осложнений в течение 5 лет

О.А. Демидова и соавт. (2015) [10] Аутогенные клетки- предшественники эндотелиобластов ХАН 2Б-4 Умеренно выраженные и транзиторные ПЭ, НЯ/СНЯ не было; 10-летняя выживаемость 78 %

Примечания:

ХАН — хроническая артериальная недостаточность, ПЭ — побочные эффекты,

НЯ/СНЯ — нежелательные/серьезные нежелательные явления

таблица 2. Клинические исследования трансплантации стволовых клеток костного мозга для терапии пациентов с ишемией нижних конечностей

Источник

Степень ишемии

Вид КлТ

Срок наблюдения

Клинический результат

Показатели перфузии

E. Tateishi-Yuyama и соавт. (2002) [5]

G.P. Fadini и соавт. (2010) [98]

B. Amann и соавт. (2009) [84]

О.А. Демидова и соавт. (2015) [10]

S. Matoba и соавт. (2008) [83]

G.P. Lasala и соавт. (2010, 2012) [94, 95]

КИНК

КИНК

КИНК

КИНК (2Б-4 ст)

КИНК

ХАН 11Б-IV на фоне СД

N.R. Dash и соавт. КИНК (2009) [14]

R.J. Powell КИНК

и соавт. (2011) [39]

T.W. Liang и соавт. (2016) [92]

D.H. Walter и соавт. (2011) [87]

S.M. Peeters Weem и соавт. (2015) [91]

M. Ai и соавт. (2016) [107]

F. Liu и соавт. (2012) [100]

КИНК

КИНК

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs) СККМ

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs)

Аутогенные клетки-

предшественники

эндотелиобластов

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs)

Комбинация МСК и BMMNCs

МСК КМ (BM-MSC)

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs) против плацебо

Уменьшение боли в покое ЛПИ t

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs) против плацебо

Мононуклеарные

(Rutherford клетки

class 4-6)

КИНК

КМ (BMMNCs) против плацебо

Аутогенные СККМ

КИНК

Аутогенные СККМ

12 лет

12 мес.

6/12мес.

5 лет

КИНК

Аутогенные СККМ 3/6 мес.

Болевой синдром ^ ДБХ Т

Частота ампутаций^;

боли

КЖ Т

Большие ампутации 4,4 %, малые ампутации 7,3 %

Частота ампутаций^; боли

размер язв ДХ Т

АББТ; ДХ Т; боли КЖ Т

КЖ t; ДХ t; боли i

AFS t;

большие ампутации^: группа КлТ =19/18 %, контроль 43/36 %; заживление язв t: группа КлТ 31 °%, контроль 13 %

(кроме Rutherford class 6)

AFS 74 °%, сохранение конечности без большой ампутации 78 %, ДБХ t на 71%.

Заживление язв t; боли i

(кроме Rutherford class 6)

Не выявлено преимуществ по выживаемости, АББ, частоте ампутаций и заживлению язв; боли ^ (в группе КлТ)

АББ Т;

ампутации боли

заживление язв Т; ДБХ Т

АББ Т

заживление язв Т; ампутации ^

ТсРО2t

ЛПИ t ТсРО2t

ЛПИ t ТсРО2t

ЛПИ t ТсРО2t

ЛПИ t ТсРО2 t

Плотности капилляров (MRA-ангиография) t; ЛПИ t; ТсРО2t

Плотность капилляров (биопсия) t

ЛПИ t ТсРО2 t

ЛПИ t ТсРО2 t

Нет корреляции с ЛПИ

ЛПИ t, ТсРО2 t (в группе КлТ)

ЛПИ t ТсРО2 t

ЛПИ t ТсРО2 t

инструментальная оценка изменения перфузии после клеточной терапии

Анализ литературных данных не показывает единой тенденции в корреляции между клиническими результатами и динамикой изменения показателей перфузии после КлТ КИНК (табл. 2, 3)

В ряде исследований положительный клинический эффект сочетался с приростом ЛПИ, ТсР02, увеличением дистанции безболевой ходьбы и улучшением качества жизни [90, 94, 95, 108]. В мета-обзоре S.M. Peeters Weem и соавт. (2015) имелись сходные показатели выживаемости, частоты ампутаций и заживлений язв между группами клеточной терапии и плацебо, но явное улучшение перфузии (на основании ЛПИ, TcPO2) и снижение болевого синдрома отмечено только в группе КлТ [91].

В то же время в рандомизированном исследовании PR0VASA [87] не выявлено корреляции между ЛПИ и положительной динамикой в заживлении язв или купировании болевого синдрома. Подобное расхождение между показателями ЛПИ или ТсРО2 и важнейшими клиническими параметрами испытаний были отмечены также в работе J. Tongers и совт. (2008) [109].

Отдельного обсуждения заслуживает применение контрастной или МР-ангиографии, «золотого стандарта» в диагностике макрососудистых поражений. В уже упомянутых работах G. Lasala и соавт. (2010, 2012) положительный ангиогенный эффект подтверждали ангиографией и 99mTc-TF перфузией [94, 95]. По мнению других авторов, контрастная или МР-ангиография оказалась неэффективной при оценке сосудистых изменений на фоне клеточной терапии из-за сложности интерпретации результатов [110]. В работе A. Klepanec и соавт. (2012) цифровая субтракционная ангиография, проводимая по строгому протоколу, не выявила достоверного увеличения количества новых коллатералей через 6 мес. после КлТ по сравнению с исходными ангио-грамами [111]. Функциональное улучшение после обеих методик (плацебо и КлТ) в отсутствие макроваскулярных изменений типа видимых коллатералей или процесса ар-териогенеза по данным ангиографии, поддерживает концепцию, что терапевтический эффект клеточной терапии при КИНК реализуется на уровне микроциркуляции и что ангиография не является подходящим методом для оценки терапевтического ангиогенеза [112]. Сцинтиграфия представляется наиболее объективным методом, однако редкость её применения, различия используемых радиоизотопов и методик исследования, затрудняют сравнительный анализ данных. Авторы исследования PROVASA [87] справедливо отмечают, что наиболее объективный метод оценки эффективности терапии КИНК все еще остается неясным и, возможно, наиболее подходящим будет композитный показатель.

результаты лечения пациентов с кинк при различных способах трансплатации стволовых клеток

Обсуждение способов введения СК представляет интерес из-за двух взаимосвязанных проблем: а) инва-зивность процедуры и простота её применения в рутинной клинической практике б) влияние способа трансплантации на ее эффективность, что напрямую связано с «судьбой» имплантированных СК. Кинетика, распределение и сохранность СК после их введения в организм подробно исследованы в ряде экспериментальных работ [113-115].

При внутривенном (в/в) введении, которое представляется наиболее простым и малоинвазивным, СК способны мигрировать в ишемизированные мышцы [116],

однако, имеются предположения, что in vivo только небольшое количество СК достигают зоны ишемии, сохраняются и подвергаются дифференцировке. При исследовании на модели инфаркта миокарда у мышей, уже через 1 ч. после в/в введения 83 % ксеногенных МСК обнаруживались в легких [117]. По этой причине внутривенный путь трансплатации при КИНК используется редко.

Внутриартериальное введение. Вопросы оптимальной доставки клеток, в т.ч внутриартериального (в/а) введения клеточных препаратов при КИНК, активно изучались во многих работах [82, 96, 111, 118, 119-124].

Имеется несколько методик в/а введения, при которых используется чрезкожный контралатеральный бедренный или антеградный бедренный доступ для селективной катетеризации: катетер малого диаметра (4F) подводится до места окклюзии, после чего осуществляется медленная инфузия [111, 125, 126]. Предполагается, что при селективном в/а введении СК вместе с кровотоком могут достигнуть границы зоны ишемии, хотя степень извлечения их из микроциркуляции и приживления неизвестны. С помощью интравитальной микроскопии мышц было установлено, что после в/а или в/в введения большая часть клеток задерживается в сосудистой сети на прекапиллярном уровне (для МСК до 92 %) [113]. Несмотря на эти данные, внутриартериальное введение дает стабильно положительные клинические результаты (уменьшение интенсивности болевого синдрома, заживление или уменьшение размеров язв, уменьшение частоты ампутаций) и улучшение показателей перфузии, хотя степень эффективности различается между исследованиями [111, 119, 121, 123, 126].

Немаловажным является то обстоятельство, что во всех работах сообщается об отсутствии или очень низкой частоте различных осложнений, связанных с процедурой в/а трансплатации [96, 122].

Повторная внутриартериальная трансплатация СК. Повторная трансплатация СК пока применяется редко. В нерандомизированном иссследовании G. Cobellis и соавт. (2008) отмечают отсутствие осложнений и побочных эффектов, а также крайне высокую эффективность лечения: 100 % выживаемость без ампутаций при сроке наблюдения 12 мес., очень значительный прирост ДБХ (до 500-1000 метров), увеличение ЛПИ и количества новых капилляров по данным видеокапилляроскопии [121]. Несмотря на столь феноменальный результат, внимательное прочтение работы дает повод для серьезных критических размышлений, связанных с критериями включения пациентов и методами контроля. В 2012 г. было проведено мультицентровое проспективное плацебо-неконтролируемое исследование [88] по изучению вопроса повторной в/а трансплантации. Отмечена высокая безопасность: не было летальных исходов и осложнений, связанных с процедурой (аспирацией и инфузией в бедренную артерию), инфекционных осложнений и новообразований, а выживаемость без ампутации у больных с КИНК показала меньший риск летальности и/или ампутации после КлТ в сравнении с естественным течением заболевания. Почти все пациенты отметили уменьшение болей, увеличение ДБХ, улучшение качества жизни. Улучшение показателей перфузии по данным лазерной допплерографии и TcPO2 сохранялись по крайней мере в течение 12 мес. после терапии СК. После 18 мес. наметилась тенденция снижения указанных показателей, что объясняется прогрессированием заболевания. Подобное снижение отмечалось и другими авторами [86]. Таким образом, у пациентов с тенденцией к снижению перфузии через 18 мес. после лечения может рассматриваться возможность повторного курса лечения СККМ.

Для сравнения эффективности плацебо, одно и двукратного интраартериального введения было предпринято рандомизированное двойное слепое исследование (РДСИ) РТОУДЗД [87]. Важность этой работы заключается в том, что в большинстве РДСИ изучали эффективность однократного использования вМмЫСэ, которое, как было показано в исследовании N. 1с1е1 и соавт. (2011), может обладать ограниченной продолжительностью эффекта [86]. Исследование РПОУДЭД обнаружило высокую безопасность аспирации КМ и методики в/а инфузии (на 87 процедур была отмечена 1 гематома и 1 псевдоаневризма, лечение консервативное); осложнений и побочных эффектов, связанных с клеточной терапией, не было. Исследование РПОУДЭД продемонстрировало, что повторное введение и большее количество трансплантированных клеток приводило к значительно лучшему заживлению язв и купированию болевого синдрома,

чем однократное введение. Таким образом, появляется необходимость проведения новых РДСИ с многократными курсами лечения.

Наиболее крупным РДСИ было исследование Л1УЕ\ТД8, включившее 160 пациентов с КИНК, разделенных на группу плацебо-контроль и группу пациентов, которым делали повторные в/а инъекции (3 раза с интервалом 3 нед.). Исследование Л1МЕ\ТА8 также показало высокую безопасность методики, однако основной результат оказался разочаровывающим — повторные в/а инфузии аутогенных ВММ\Сэ не сокращали частоту больших ампутаций при КИНК. Тем не менее, достигнутые ощутимые улучшения по многим параметрам (качество жизни, сила болей покоя, ЛПИ, ТсРО2) в обеих группах, по крайней мере, дают основание для дальнейших исследований [105].

Результаты повторного внутриартериального введения СККМ приведены в табл. 3.

таблица 3. Результаты повторного внутриартериального введения СККМ

Источник

Заболевание

Вид КлТ

Метод применения

Осложнения, ПЭ, НЯ/СНЯ

Клинический эффект

Показатели перфузии

G. Cobellis и соавт. (2008) [121]

A. Schiavetta и соавт. (2012) [88]

D.H. Walter и соавт. (2011) [87]

M. Teraa и соавт. (2015) [105]

КИНК 3-4 ст, 10 пациентов

КИНК

50 пациентов; ХАН 2Б 10 пациентов

87 пациентов

Аутогенные СККМ

Аутогенные СККМ

Мононуклеарные клетки

КМ (BMMNCs) или плацебо

КИНК

160 пациентов

Аутогенные BMMNCs

в/а дважды с интервалом 45 сут.

в/а дважды с интервалом 45 сут.

Однократное в/а введение; двукратное в/а введение; плацебо-контроль

Трехкратные в/а инфузии с 3 нед. интервалом; плацебо-контроль

Нет

Нет

1 гематома + 1 псевдоаневризма на 87 процедур

Высокая безопасность

100 % АБЭ в течение 12 мес. ДБХ Т

75,2 % АБЭ при КИНК ДБХ Т; боли КЖ Т

Заживление язв Т; боли ^ при двукратном введении

Нет разницы по частоте больших ампутаций; боли КЖ Т

ЛПИТ; новые

капилляры t

ЛПИ t; ТсРО2t в течение 12 мес.

ЛПИ t; ТсРО2t

ЛПИ t; ТсРО2 t

Внутримышечная трансплатация стволовых клеток. На терапевтическую эффективность КлТ влияет продолжительность нахождения трансплантированных клеток в зоне ишемии и специфические особенности области ишемии. Например, после внутримиокардиального, вну-трикоронарного и в/в введения был установлен факт быстрого исчезновения клеток из миокарда [127, 128]. В отличие от сердца, в скелетных мышцах имплантированные клетки сохраняются существенно дольше. Так, по данным М.В. Калашниковой и соавт. (2013), сохранность МСК из жировой ткани после введения их в икроножные мышцы мышей и крыс, составляла 50-70% через 1 сут. и 5-10 % через 1 неделю [129]. Существенных различий в сохранности имплантированных клеток в нормальных и ишемизированных мышцах обнаружено не было. Эти обстоятельства могут служить аргументами в пользу введения СК непосредственно в мышцу (в/м). Одним из преимуществ в/м введения является создание локального депо клеток с повышенной паракринной активностью и локальным высвобождением артериогенных

цитокинов в зоне ишемии. Несмотря на относительно короткий период выживания трансплантируемых СК, происходит индуцирование клеточной дифференцировки, прямых клеточных контактов с резидентными клетками и другой паракринной активности, что ведет к увеличению сосудистого русла [15, 48, 111, 130].

В силу этих причин и простоты методики, в/м введение наиболее часто используется в клинических исследованиях. Трансплантация в мышцы голени может осуществляться по принципу симметричной сетки или в проекции расположения берцовых артерий [84, 11 1 , 131, 132]. В редких случаях, помимо трансплантации в бедро и голень, инъекции проводились в интрамета-дорзальные промежутки стопы [39, 133]. Результаты клеточной терапии при КИНК, приведенные в главе настоящего обзора «Результаты лечения критической ишемии нижних конечностей стволовыми клетками костного мозга» в основном основаны на в/м введении.

В то же время, некоторые авторы делают заключение, что опубликованных данных недостаточно для

доказательства безусловной пользы клеточной терапии путем в/м трансплантации и необходимы дополнительные исследования [4, 8].

Заслуживает внимания иранское рандомизированное контролируемое исследование по сравнительной эффективности и безопасности одно- и многократной в/м трансплантации клеток [133]. 22 пациента с обли-терирующим тромбангиитом (ОТ) и сахарным диабетом (СД) были разделены на 2 равные группы: однократного и четырехкратного введения (с 3 недельным интервалом) аутогенных мононуклеарных клеток КМ. Все пациенты наблюдались в течение 6 мес. Осложнений и побочных эффектов не было, у 82 % пациентов ЛПИ увеличился, у 90 % болевой синдром уменьшился и у 90 % наблюдалось значительное улучшение в заживлении язв; по всем этим показателям значимых различий между группами однократной и многократной трансплантации не было. ДБХ также существенно увеличились в обеих группах по сравнению с исходными значениями; однако достоверно большее увеличение к концу срока наблюдения отмечено в группе многократного введения, что, по мнению авторов, является аргументом в пользу повторных курсов лечения.

Отсутствие клинического улучшения в течение 6 мес. после КлТ может рассматриваться как обоснование для повторного курса трансплантации и по мнению отечественных авторов [10].

Комбинированный внутримышечный и внутриарте-риальный способ введения используется редко, хотя логическим обоснованием комбинированного способа служит стремление сочетать преимущества обоих способов с целью доставить максимальное количество клеток в зону ишемии [82, 134-136].

В одной из первых работ B.E. Strauer и соавт. (2002) по изучению сравнительной эффективности и безопасности в/м и комбинированного (в/м+в/а) путей введения BMMNC при кардиальной патологии, улучшение было отмечено в обеих группах без существенных различий [137].

В исследованиях R.W. Franz и соавт. (2009, 2011) частота сохранения конечности была больше в группе комбинированного лечения и достигала 78 %, но статистически значимых отличий от контроля выявлено не было; также значимо не изменились болевой синдром и ЛПИ [135, 136].

В работе R.B. Van Tongeren и соавт. (2008) в обеих группах было отмечено значимое улучшение ЛПИ и ДБХ, уменьшение боли. Частота сохранения конечности не имела значимых различий, хотя большая ампутация потребовалась у 2 из 12 больных с комбинированным способом трансплантации против 7 из 15 больных с в/м путем введения [82].

Особенность работы T. Bartsch и соавт. (2007) заключалась в применении клеточной терапии у 13 больных без критической ишемии (ХАН 2Б), в результате которой через 2 мес. было обнаружено значительное увеличение ДБХ, ЛПИ, сатурации кислорода и др. инструментальных показателей по сравнению с группой контроля [134]. Эффект сохранялся в течение 13 мес. наблюдения.

Важно отметить, что во всех исследованиях побочных эффектов и осложнений не было, за исключением транзи-торной сердечной недостаточности у 2 больных при аспирации КМ в работе R.B. Van Tongeren и соавт. (2008) [82].

Результаты комбинированного внутримышечного и внутриартериального введения СККМ приведены в табл. 4

таблица 4. Результаты комбинированного внутримышечного и внутриартериального введения СККМ

.. „ р, „ т Метод Осложнения, ПЭ, Клинический Показатели

Источник Заболевание Вид КлТ ... .„,,' .. .

применения НЯ/СНЯ эффект перфузии

T. Bartsch ХАН 2Б; Аутогенные в/м+в/а; Нет ДБХ 1 ЛПИ Т;

u coaBT. 13 пациентов СККМ срок наблюдения ТсРО2Т

(2007) [134] 13 мес.

R.W. Franz Rutherford Аутогенные Сравнение Нет Нет Нет

u coaBT. 4-6 класс, СККМ в/м и в/м+в/а увеличения значимого

(2009) [135] 9 пациентов сохранения прироста ЛПИ

конечности (не более

в течение 0,12)

3 мес. по сравнению

по сравнению с контролем

с контролем

R.W. Franz Rutherford Аутогенные Сравнение Нет Нет Нет

u coaBT. 4-6 класс, СККМ в/м и в/м+в/а увеличения значимого

(2011) [136] 18 пациентов сохранения прироста ЛПИ

конечности; по сравнению

боли ^ с контролем

по сравнению

с контролем

R.B. Van Rutherford Аутогенные Сравнение в/м Транзиторная Боли ДБХ ЛПИ Т

Tongeren 4-6 класс, СККМ (15 пациентов) сердечная Т в обеих

u coaBT. 27 пациентов и в/м+в/а недостаточность группах;

(2008) [82] (12 пациентов); у 2 пациентов при нет отличий

срок наблюдения аспирации КМ по частоте

12 мес сохранения

конечности

Сравнение эффективности различных

путей введения стволовых клеток

Имеется не так много данных по прямому сравнению эффективности КлТ при различных путях введения. Сходные ангиогенные эффекты после внутримышечного и внутриартериального введения клеток были получены в эксперименте [138]. Детальный мета-анализ клинических исследований [98], также как и плацебо-контроли-руемое исследование N. Van Royen и соавт. (2005) [139], показали, что улучшение показателя ЛПИ, увеличение ДБХ, уменьшение боли в покое и ускорение заживления язв пораженной конечности статистически не различаются при внутримышечном и внутриартериальном способах введения. В работе A. Klepanec и соавт. (2012) сравнивалась эффективность в/м и в/а введения при КИНК у 41 больного [111]. Обе процедуры были хорошо переносимы без осложнений и сравнимы по терапевтическому эффекту. Результаты этого клинического наблюдения согласуются с ранее полученными экспериментальными данными о сходной ангиогенной активности в/м и в/а введения на моделях ишемии у крыс [67].

В то же время, в недавнем мета-обзоре результатов рандомизированных клинических исследований отмечена меньшая эффективность при в/а пути введения (2 РКИ), чем при в/м (8 РКИ), однако разница была не достоверна [91]. Важно отметить, что ощутимый клинический эффект после введения МСК больным наблюдался независимо от способа введения (в/а или в/м) [111]. Накопленные данные не позволяют однозначно ответить на вопрос о наилучшем способе трансплантации клеток.

Известные или предполагаемые механизмы действия СК, высокая эффективность и относительная простота выполнения дают основание говорить о том, что в/м введение может быть предпочтительным и преимущественно использоваться в будущих клинических исследованиях и рутинной клинической практике.

дозировка трансплантируемых клеток

На сегодняшний день нет убедительной информации, позволяющей объективно рассчитать необходимую дозу трансплантируемых клеток. По нашему мнению, само определение «необходимая доза» также, вероятно нуждается в толковании; представляется, что доза должна быть минимальной с точки зрения количества клеток и риска побочных или нежелательных явлений, но оптимальной с точки зрения достижения эффекта.

В исследованиях используется различное количество вводимых клеток (табл. 5). Выбор оптимальной дозы является трудной задачей, т. к. традиционные фармацевтические параметры (абсорбция, распределение, метаболизм, экскреция) трудны для измерения или неприменимы в этом случае. В настоящее время подбор дозы осуществляется путем экстраполяции результатов экспериментов на животных или эмпирически на основании эффективности, полученной в 1 или 2 фазе клинических испытаний, в которых сравнивали разные дозы. Дополнительные сложности в выборе дозы связаны с непрямой дозо-зависимостью результатов, отмеченных в разных исследованиях. Поиск оптимальной стратегии подбора дозы остается одним из критических пунктов клеточной терапии [16].

таблица 5. Дозировка трансплантируемых клеток

Исследование

Доза клеток

Клинический эффект

Осложнения

E. Tateishi-Yuyama и соавт. (2002) [5]

H. Lawall и соавт. (2010) [15]

R. Ruiz-Salmeron и соавт.

(2011) [119]

A. Klepanec и соавт.

(2012) [111]

F. Liu и соавт. (2012) [100] M. Ai и соавт. (2016) [107]

1,6х109

0,1х109-50х109

100-400х106

15-30х106

1,36х106-3,23х109 106-109

Положительный Не указаны

Положительный, даже при минимальной Не указаны концентрации

Положительный, нет корреляции с дозой Не указаны

Положительный, улучшение заживления Не указаны при увеличении концентрации

Положительный Не указаны

Положительный, нет усиления терапевти- Не указаны ческого эффекта при увеличении дозы

Во многих работах применяется доза клеток 1,6х109, как в первом клиническом исследовании E. Tateishi-Yuyama и соавт. (2002) [5], которое, в свою очередь, основывалось на экспериментальных данных, полученных на животных. Среди проведенных клинических испытаний дозы клеток варьируют от 0,1 х109 до 50,0х109 с положительным эффектом даже при самой низкой концентрации [15].

В исследовании R. Ruiz-Salmeron и соавт. (2011) изучалась корреляция между количеством введенных BMMNC и полученными результатами, не показавшая однозначных результатов [119]. В то же время в работе A. Klepanec и соавт. (2012) доказана статистически достоверная связь между количеством CD34+-клеток в концентрате костного мозга и процессом заживления, что может свидетельствовать о значении концентрации вводимых клеток [111].

О тенденции увеличения дозы трансплантируемых клеток можно косвенно говорить и на основании данных, приведенных в мета-анализе 6 рандомизированных

исследований [1 07], в которых были использованы аутогенные клетки различного происхождения с дозировкой от 1,36х106 до 3,23х109. Увеличения количества осложнений любого рода не было отмечено. Вопрос «дозозависимости» изучался в крупном сравнительном мета-анализе 2016 г., включающем 25 контролируемых исследований клеточной терапии, который, однако, не показал значимого улучшения терапевтического эффекта при увеличении дозы [107]. Таким образом, пока вопросы минимально необходимой и оптимальной терапевтической дозы остаются открытыми.

Сравнение эффективности

различных клеточных агентов

Различия результатов исследований могут объясняться гетерогенностью условий их проведения: используются различные клинические показатели, группы больных, сроки, количество наблюдений и т. д. Значение дозы,

способов и кратности трансплантации клеток уже обсуждались в этом обзоре. Еще одним ключевым вопросом является выбор типа клеток, поскольку от их воздействия, которое реализуется в первую очередь через паракрин-ные механизмы, зависит индукция восстановительных процессов. Сравнительная клиническая эффективность различных клеточных агентов изучалась в некоторых работах. D. Lu и соавт. (2011) провели первое рандомизированное сравнение терапевтического эффекта от в/м введения аутогенных МСК и других фракций мононуклеарных клеток костного мозга у 20 пациентов с КИНК на фоне СД (класс IV по Fontaine) [90]. В группе больных, получавших терапию МСК, была более высокая скорость заживления язв, а также более значительное увеличение дистанции ходьбы, ЛПИ и ТсРО2, но при этом не было различий между группами по болевому синдрому и количеству ампутаций. Также ни для одного из типов клеток не было зафиксировано побочных эффектов. Авторы делают вывод, что среди мононуклеарных клеток КМ, фракция МСК наиболее эффективна в увеличении перфузии и заживлении язв у больных при КИ на фоне СД.

Позднее была показана эффективность и безопасность аутогенных МСК жировой ткани в лечении пациентов с КИНК [140]: отмечено улучшение практически всех показателей, за исключением ЛПИ.

Подробный сравнительный анализ преимуществ и недостатков различных типов клеток, используемых при клеточной терапии, проведен в обзорах японских [141] и итальянских авторов [142]. Такие специфические особенности МСК, как самообновление, пролиферация, способность к дифференцировке в различные типы клеток, продуцирование значительного количества факторов роста, низкая склонность к мутациям, возможность аллогенного применения без им-муносупрессантов, а также легкость получения (о чем уже говорилось выше) выгодно отличают МСК от других типов клеток и позволяют их рассматривать как эффективный и перспективный тип клеток для КлТ.

В недавней работе C. Altaner и соавт. (2013) изучали in vitro свойства имплантированных СККМ, которые были важны для сохранения конечности пациентов с КИНК [54]. Был обследован 41 пациент. Введение СККМ продемонстрировало через 6 мес. наблюдения предотвращение большой ампутации у 73 % пациентов: 27 больных положительно отреагировали на клеточную терапию (сохранение конечности и заживление язв), 14 — не показали положительной динамики. Биологические свойства СККМ оценивали in vitro по способности к диф-ференцировке, экспрессии поверхностных маркеров, секреции цитокинов, хемоаттрактантов и факторов роста. В крови пациентов с положительной динамикой концентрация почти всех секретируемых in vitro факторов была выше, чем у пациентов без положительной динамики. СД и возраст значимого влияния не оказывали. Авторы делают вывод, что СККМ обладают высокой вариабельностью у разных пациентов и индивидуальные особенности пациентов играют важную роль в достижении терапевтического эффекта.

Сравнительная эффективность клеточной

терапии при атеросклерозе и облитерирующем

тромбангиите (болезни Бюргера)

Непосредственный практический интерес представляет сравнительная эффективность клеточной терапии при двух основных заболеваниях, приводящих к КИНК — атеросклерозу периферических артерий (АПА) и обли-терирующем тромбангиите или болезни Бюргера (ОТ). Изучению этого вопроса было посвящено несколько

работ, в которых показано, что клеточная терапия при АПА дает худшие результаты, чем при ОТ из-за более низкой активности клеток костного мозга у пожилых больных, часто имеющих другие системные заболевания [86, 143, 144].

Действительно, ранее было установлено, что факторы риска атеросклероза снижают и (или) уменьшают функцию аутогенных стволовых и прогениторных клеток [145-148]. Гипотеза о том, что лучший клинический эффект связан с более высокой функциональностью СККМ у пациентов с ОТ, чем с АПА, была подтверждена в клиническом исследовании N. Idei и соавт. (2011) [86]. Были получены доказательства, что у пациентов с ОТ имеется большее количество эндотелиальных прогениторных клеток, кроме того, они сохраняют фенотипические характеристики и функциональные свойства, в то время как при АПА они повреждены. Авторы считают, что пациенты с ОТ в целом имеют меньшее количество факторов риска по определению, поскольку ОТ начинается до 50-летнего возраста и развития типичных факторов риска АПА, кроме курения. Важные данные были получены относительно стойкости сохранения достигнутого результата. При среднем сроке наблюдения до 4,8 лет была продемонстрирована различная эффективность имплантации ау-тологичных СККМ пациентам с АПА и ОТ. Если первичное увеличение ЛПИ и TcP02 было в обеих группах пациентов, то на 3 год наблюдения стойкое сохранение показателей было только при ОТ, а при АПА постепенное снижение привело к возврату на исходный уровень.

В обзоре индийских исследователей M.K. Mamidi и соавт. (2012) также приводятся данные экспериментов in vitro, в которых аутогенные клетки сохраняли свои фенотипические характеристики только при ОТ и теряли их при АПА [149]. Авторы этого обзора приходят к однозначному выводу, что чем лучше функция клеток, тем лучше результат лечения и рассматривают это как возможный аргумент в пользу применения аллогенных клеток у пациентов с АПА.

обсуждение и заключение

Применение терапии СККМ при КИНК в эксперименте и в клинических исследованиях демонстрирует перспективность этого направления. Однако недавние исследования показывают многочисленные барьеры на пути реализации потенциала КлТ в клинической практике.

До конца не решены теоретические вопросы терапевтического ангиогенеза, идея которого базируется на представлениях о том, что в тканях ишемизирован-ной конечности, помимо распространенных окклю-зий магистральных артерий, уменьшается количество функционирующих кровеносных капилляров и, таким образом, постулируется необходимость усиления ан-гиогенеза [150]. Однако, неизвестно, имеет ли место частичная гибель капилляров, или некая их часть перестает функционировать из-за недостатка кровоснабжения. Резервные возможности мышц, как и других тканей, во многом определяются наличием резервных микрососудов и коллатералей, включающихся в кровоток при усилении нагрузки или репарации повреждений, что приводит в соответствие объем кровоснабжения потребностям тканей конечности. Насколько адекватно этот физиологический механизм работает в патологических условиях, подлежит уточнению. Серьезные сомнения порождает экстраполяция результатов доклинических исследований на клиническую практику. Воспроизведение результатов клеточной терапии КИНК у лабораторных животных оказалось весьма затруднительным при лечении пациентов, прежде всего из-за

неадекватности лабораторных моделей. Эксперименты в основном были выполнены на моделях острого, полного нарушения кровотока по магистральным сосудам конечности (коагуляция, перевязка, иссечение и пр.), а не при моделировании хронической ишемии нижних конечностей [4]. Несмотря на это, в большом количестве экспериментальных и клинических исследований была показана безопасность и эффективность СККМ и МСК различного происхождения при лечении КИНК.

Тем не менее, остаются вопросы, решение которых имеет практическое значение.

1. Какие клетки наиболее эффективны? Является ли селективное использование изолированных популяций клеток более эффективным, чем их комбинация?

2. Каковы оптимальные методы сепарации и культивирования клеток? Требуется ли предварительная стимуляция клеток, например гипоксией?

3. Какая доза вводимых клеток является оптимальной?

4. Какое влияние оказывает микроокружение?

5. Какие способы и кратность введения клеток оптимальны?

Частично эти аспекты обсуждены в настоящем обзоре, но ответить на все многочисленные сложные вопросы можно только после уточнения механизмов многофакторного воздействия трансплантированных СК, проведения стандартизированных исследований для точной оценки характеристик СК и связанных с ними функций.

Также результат клинического применения КлТ зависит от индивидуальных особенностей пациента. Однако, имеющихся в литературе данных недостаточно для углубленного изучения проблемы. Большинство исследований носят пилотный характер, а количество опубликованных рандомизированных проспективных клинических исследований относительно невелико, также как и количество включенных в них пациентов. Очевидна гетерогенность групп пациентов по нозологии и стадии КИНК, а также методике лечения. Обращает внимание на себя то, что в азиатских публикациях преобладают пациенты с ОТ, в то время как в европейских и американских — с АПА. Возникает вопрос — у каких популяций пациентов рационально применение этой терапии? Не существует однозначно принятого определения "no option" пациент с КИНК: такой пациент может быть не операбельным по местному и (или) сосудистому статусу, общему состоянию или, например, отсутствию аутовены для шунтирования. Однако с точки зрения компенсаторно-восстановительных возможностей это совершенно различные состояния, что, соответственно, влияет на результаты лечения. Следовательно, необходим не только подбор оптимальных терапевтических методов, но и определение критериев, на основании которых можно будет отобрать группу наиболее перспективных больных.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Norgren L., Hiatt W.R., Dormandy J.A. et al. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2007; 33: S1-S75.

2. Sprengers R.W., Teraa M., Moll F.L. et al. Quality of life in patients with no- option critical limb ischemia underlines the need for new effective treatment. J. Vasc. Surg. 2010; 52: 843-9.

3. Benoit E., O'Donnell T.F., Iafrati M.D. et al. The role of amputation as an outcome measure in cellular therapy for critical limb ischemia: implications for clinical trial design. J. Transl. Med. 2011; 9: 165.

4. Лебедев С.В., Карасев А.В., Кунгурцев В.В. и др. Клеточная терапия критической ишемии нижних конечностей (проблемы и перспективы). Вестник РАМН 2013; 3: 33-44.

5. Tateishi-Yuyama E., Matsubara H., Murohara T. et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet 2002; 360: 427-35.

Длительное время основной дизайн исследований был нацелен на изучение безопасности, а не эффективности КлТ, кроме того, период наблюдения был ограниченным, и не превышал 12 мес. Оценка эффективности потребует ответа на вопрос — какие конечные показатели наиболее адекватно отражают результаты лечения? Отсутствие значимого преимущества по основным первичным показателям — ампутациям, выживаемости и AFS в ряде РКИ подчеркивает необходимость дальнейших рандомизированных двойных слепых плацебо-контролируемых испытаний [151], включающих универсальные, а возможно комбинированные, клинические показатели. Обществом сосудистых хирургов США были предложены специфические объективные целевые показатели (specific objective performance goals — OPGs) эффективности и безопасности реваскуляризации при КИНК [152]. Эти показатели позволяют проводить прямое сравнение между различными исследованиями, в том числе могли бы с успехом использоваться для оценки клеточной терапии. На какой стадии хронической артериальной недостаточности наиболее оптимально применять клеточную терапию? КИНК является наиболее тяжелой формой ЗПА, из-за чего имеется вероятность не столь яркой демонстрации эффективности этого терапевтического подхода.

Поскольку собрано достаточное количество доказательств безопасности, возможно, резонным будет применение КлТ не только при КИНК, но и у пациентов с перемежающейся хромотой, т.е. наиболее распространенной формой ЗПА [51]. Потребует своего решения такие вопросы как продолжительность периода наблюдений для оценки отдаленного результата, целесообразность повторных курсов, оценка влияния факторов риска и сопутствующих заболеваний.

Настоящие экспериментальные и клинические исследования не всегда могут показывать стабильную воспроизводимость терапевтической эффективности СК как на животных, так и на пациентах, а недостаточная однородность и сопоставимость испытаний вносит дополнительные трудности при клиническом применении СК.

Дальнейшие широкомасштабные исследования помогут решить основные ключевые проблемы, превратить СК-терапию в рутинную процедуру и при этом избежать необоснованного или неэффективного лечения, которое несет риск для пациента и наносит ущерб репутации клеточной терапии. И хотя многое еще предстоит сделать, представляется, что терапия стволовыми клетками имеет значительный потенциал в сокращении летальности и улучшении качества жизни пациентов с тяжелой ишемией нижних конечностей.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 16-15-10432.

6. Булгин О.В., Андреева Д.В. Терапевтический ангиогенез с использованием факторов роста и клеток костного мозга: биологические основы и перспективы клинического применения. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2015; 17(3): 89-111.

7. Белевитин А.Б., Хубулава Г.Г., Сазонов А.Б. и соавт. Использование аутологичных стволовых клеток для стимуляции артериогенеза при критической ишемии нижних конечностей. Вестник Российской Военно-медицинской академии 2008; 3(23): 176-80.

8. Капутин М.Ю., Бурнос С.Н. Применение стволовых клеток для лечения больных с критической ишемией нижних конечностей. Вестник хирургии им. Грекова 2015; 174(1): 103-8.

9. Каргин В.Д., Бессмельцев С.С., Солдатенков В.Е. и др. Терапевтический ангиогенез в лечении хронической ишемии конечностей, http://www.medline.ru/public/pdf/14_011.pdf.

10. Демидова О.А., Бокерия Л.А., Еремеева М.В. и др. Индуцированный ангиогенез у больных с хронической критической ишемией нижних

конечностей. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН Сердечно-сосудистые заболевания 2015; 16(S6): 246.

11. Каргин В.Д., Солдатенков В.Е., Бессмельцев С.С. и др. Эффективность применения аутологической трансплантации стволовых клеток периферической крови при хронической ишемии нижних конечностей, http://www.medline.ru/public/pdf/15_040.pdf.

12. Корымасов Е.А., Тюмина О.В., Казанцев А.В. и др. Результаты рандомизированного двойного слепого плацебо контролируемого исследования эффективности лечения аутогенными прогениторными клетками костного мозга больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; III(3): 57-62.

13. Bare P., Skora J., Pupka A. et al. Bone-marrow cells in therapy of critical limb ischaemia of lower extremitiesdown experience. Acta Angiol. 2006; 12: 155-66.

14. Dash N.R., Dash S.N., Routray P. et al. Targeting nonhealing ulcers of lower extremity in human through autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Rejuvenation Res. 2009; 12: 359-66.

15. Lawall H., Bramlage P., Amann B. Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal. Thromb. Haemost. 2010; 103: 696-709.

16. Gupta R., Losordo D.W. Cell Therapy for Critical Limb Ischemia. Moving Forward One Step at a Time. Circulation: Cardiovascular Interventions 2011; 4: 2-5.

17. Travlos G.S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol. Pathol. 2006; 34(5): 548-65.

18. Alvarez-Viejo M., Menendez-Menendez Y., BlancoGelaz M.A. et al. Quantifying mesenchymal stem cells in the mononuclear cell fraction of bone marrow samples obtained for cell therapy. Transplant. Proc. 2013; 45(1): 434-9.

19. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoi-etic tissues. Science 1997; 276(5309): 71-4.

20. Alhadlaq A., Mao J.J. Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells and Development 2004; 13(4): 436-48.

21. Pittenger M.F. Mesenchymal stem cells from adult bone marrow. Methods Molecular Biology 2008; 449: 27-44.

22. Astori G., Soncin S., Lo Cicero V. et al. Bone marrow derived stem cells in regenerative medicine as advanced therapy medicinal products. Am. J. Transl. Res. 2010; 2(3): 285-95.

23. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004; 36: 568-84.

24. Lian Q., Zhang Y., Zhang J. et al. Functional mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells attenuate limb ischemia in mice. Circulation 2010; 121: 1113-23.

25. Kim Y., Kim H., Cho H. et al. Direct comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissues and bone marrow in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Cell. Physiol. Biochem. 2007; 20: 867-76.

26. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I. et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation 1968; 6: 230-47.

27. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7: 211-28.

28. Williams J.T., Southerland S.S., Souza J. et al. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am. Surg. 1999; 65: 22-6.

29. Gronthos S., Arthur A., Bartold P.M. et al. A method to isolate and culture expand human dental pulp stem cells. J. Methods Mol. Biol. 2011; 698: 107-21.

30. Bianco P., Robey P.G., Simmons P.J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell 2008; 2: 313-9.

31. Rebelatto C.K., Aguiar A.M., Moretao M.P. et al. Dissimilar differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue. Exp. Biol. Med. 2008; 233: 901-13.

32. Iso Y., Spees J.L., Serrano C. et al. Multipotent human stromal cells improve cardiac function after myocardial infarction in mice without long-term engraftment. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 354(3): 700-6.

33. Lim S.Y., Kim Y.S., Ahn Y. et al. The effects of mesenchymal stem cells transduced with Akt in a porcine myocardial infarction model. Cardio-vasc. Res. 2006; 70(3): 530-42.

34. Amado L.C., Saliaris A.P., Schuleri K.H. et al. Cardiac repair with in-tramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocar-dial infarction. PNAS USA 2005; 102(32): 11474-9.

35. Si Y.L., Zhao Y.L., Hao H.J. et al. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res. Rev. 2011; 10: 93-103.

36. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J. Nippon Med. Sch. 2009; 76: 56-66.

37. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell 2002; 13: 4279-95.

38. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006; 24: 1294-301.

39. Powell R.J., Comerota A.J., Berceli S.A. et al. Interim analysis results from the RESTORE-CLI, a randomized, double-blind multicenter phase II trial

comparing expanded autologous bone marrow-derived tissue repair cells and placebo in patients with critical limb ischemia. J. Vasc. Surg. 2011; 54: 1032-41.

40. Gruber R., Kandler B., Holzmann P. et al. Bone marrow stromal cells can provide a local environment that favors migration and formation of tubular structures of endothelial cells. Tissue Eng. 2005; 11: 896-903.

41. Wang C.Y., Yang H.B., Hsu H.S. et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium facilitates angiogenesis and fracture healing in diabetic rats. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2012; 6(7): 559-69.

42. Chapel A., Bertho J.M., Bensiodhoum M. et al. Mesenchymal stem cells home to injured tissues when co-infused with hematopoietic cells to treat a radiation-induced multi organ failure syndrome. J. Gene Med. 2003; 5: 1028-38.

43. Chavakis E., Urbich C., Dimmeler S. Homing and engraftment of progenitor cells: a prerequisite for cell therapy. J. Mol. Cell. Cardiol. 2008; 45: 514-22.

44. Kang Y., Park C., Kim D. et al. Unsorted human adipose tissue-derived stem cells promote angiogenesis and myogenesis in murine ischemic hindlimb model. Microvasc. Res. 2010; 80: 310-6.

45. Zhang P., Baxter J., Vinod K. et al. Endothelial differentiation of amniotic fluid-derived stem cells: synergism of biochemical and shear force stimuli. Stem Cells Dev. 2009; 18: 1299-308.

46. Marchionni C., Bonsi L., Alviano F. et al. Angiogenic potential of human dental pulp stromal (stem) cells. Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2009; 22: 699-706.

47. Duffy G.P., Ahsan T., O'Brien T. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells promote angiogenic processes in a time- and dose-dependent manner in vitro. Tissue Eng. Part A 2009; 15: 2459-70.

48. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S. et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation 2004; 109: 1543-9.

49. De la Garza-Rodea A.S., Van der Velde-van Dijke I., Boersma H. et al. Myogenic properties of human mesenchymal stem cells derived from three different sources. Cell Transplant. 2012; 21: 153-73.

50. Leroux L., Descamps B., Tojais N.F. et al. Hypoxia preconditioned mesenchymal stem cells improve vascular and skeletal muscle fiber regeneration after ischemia through a Wnt4-dependent pathway. Mol. Ther. 2010; 18: 1545-52.

51. O'Brien L.T. Therapeutic potential for mesenchymal stem cell transplantation in critical limb ischemia. Stem Cell Res. Ther. 2012; 3: 28.

52. Burns T.C., Verfaillie C.M., Low W.C. Stem cells for ischemic brain injury: a critical review. J. Comp. Neurol. 2009; 515: 125-44.

53. Lindvall O., Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature 2006; 441: 1094-6.

54. Altaner C., Altanerova V., Cihova M. et al. Characterization of Mes-enchymal Stem Cells of "No-Options" Patients with Critical Limb Ischemia Treated by Autologous Bone Marrow Mononuclear Cells. PLOS ONE 2013; 8(9): e73722.

55. Sugihara S., Yamamoto Y., Matsuura T. et al. Age-related BM-MNC dysfunction hampers neovascularization. Mech. Ageing Dev. 2007; 128(9): 511-6.

56. Stolzing A., Jones E., McGonagle D. et al. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mech. Ageing Dev. 2008; 129(3): 163-73.

57. Nauta A.J., Fibbe W.E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. Blood 2007; 110: 3499-506.

58. Oh J.Y., Kim M.K., Shin M.S. et al. The anti-inflammatory and antian-giogenic role of mesenchymal stem cells in corneal wound healing following chemical injury. Stem Cells 2008; 26: 1047-55.

59. Ankrum J., Karp J.M. Mesenchymal stem cell therapy: two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 2010; 16(5): 203-9.

60. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S. et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. Circ. Res. 2004; 94: 678-85.

61. Chen L., Tredget E.E., Wu P.Y. et al. Paracrine factors of mesen-chymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing. PLOS ONE 2008; 3: e1886.

62. Bouffi C., Bony C., Courties G. et al. IL-6- dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLOS ONE 2010; 5: e14247.

63. DiPietro L.A., Burdick M., Low Q.E. et al. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1693-8.

64. Boomsma R.A., Geenen D.L. Mesenchymal stem cells secrete multiple cytokines that promote angiogenesis and have contrasting effects on chemotaxis and apoptosis. PLOS ONE 2012; 7: e35685.

65. Krasnodembskaya A., Song Y., Fang X. et al. Antibacterial effect of human mesenchymal stem cells is mediated in part from secretion of the antimicrobial peptide LL-37. Stem Cells 2010; 28: 2229-38.

66. Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. Secretion of angiogenic and antiapop-totic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004; 109: 1292-8.

67. Iwase T., Nagaya N., Fujii T. et al. Comparison of angiogenic potency between mesenchymal stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb ischemia. Cardiovasc. Res. 2005; 66: 543-51.

68. Hoffmann J., Glassford A.J., Doyle T.C. et al. Angiogenic effects despite limited cell survival of bone marrow-derived mesenchymal stem cells under ischemia. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2010; 58: 136-42.

69. Schwarz T.M., Leicht S.F., Radic T. et al. Vascular incorporation of endothelial colony-forming cells is essential for functional recovery of murine ischemic tissue following cell therapy. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2012; 32: e13-e21.

70. Ryu J.C., Davidson B.P., Xie A. et al. Molecular imaging of the paracrine proangiogenic effects of progenitor cell therapy in limb ischemia. Circulation 2013; 127: 710-9.

71. Liao W., Zhong J., Yu J. et al. Therapeutic benefit of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells in intracerebral hemorrhage rat: implications of antiinflammation and angiogenesis. Cell. Physiol. Biochem. 2009; 24: 307-16.

72. Ishikane S., Ohnishi S., Yamahara K. et al. Allogeneic injection of fetal membrane-derived mesenchymal stem cells induces therapeutic angiogen-esis in a rat model of hindlimb ischemia. Stem Cells 2008; 26: 2625-33.

73. Le Blanc K., Ringden O. Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J. Intern. Med. 2007; 262: 509-25.

74. Puissant B., Barreau C., Bourin P. et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cell: comparison with bone mar-rowmesenchymal stem cells. Brit. J. Haematol. 2005; 129(1): 118-29.

75. Jones S., Horwood N., Cope A. et al. The antiproliferative effect of mesenchymal stem cells is a fundamental property shared by all stromal cells. J. Immunol. 2007; 179: 2824-31.

76. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E. et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. Blood 2006; 107: 367-72.

77. Bonfield T.L., Nolan Koloze M.T., Lennon D.P. et al. Defining human mesenchymal stem cell efficacy in vivo. J. Inflamm. (Lond.) 2010; 7: 51.

78. Meirelles Lda S., Fontes A.M., Covas D.T. et al. Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells. Cytokine Growth Factor Rev. 2009; 20: 419-27.

79. Fiorina P., Jurewicz M., Augello A. et al. Immunomodulatory function of bone marrow derived mesenchymal stem cells in experimental autoimmune type 1 diabetes. J. Immunol. 2009; 183: 993-1004.

80. Bouffi C., Djouad, F., Mathieu M. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells and rheumatoid arthritis: risk or benefit? Rheumatology 2009; 48: 1185-9.

81. Wakitani S., Okabe T., Horibe S. et al. Safety of autologous bone marrow- derived mesenchymal stem cell transplantation for cartilage repair in 41 patients with 45 joints followed for up to 11 years and 5 months. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2011; 5: 146-50.

82. Van Tongeren R.B., Hamming J.F., Fibbe W.E. et al. Intramuscular or combined intramuscular/intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells: a clinical trial in patients with advanced limb ischemia. J. Cardiovasc. Surg. (Torino) 2008; 49: 51-8.

83. Matoba S., Tatsumi T., Murohara T. et al. TACT Follow-up Study Investigators. Long-term clinical outcome after intramuscular implantation of bone marrow mononuclear cells (Therapeutic Angiogenesis by Cell Transplantation [TACT] trial) in patients with chronic limb ischemia. Am. Heart J. 2008; 156: 1010-8.

84. Amann B., Luedemann C., Ratei R. et al. Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transplant. 2009; 18: 371-80.

85. Lara-Hernandez R., Lozano-Vilardell P., Blanes P. et al. Safety and efficacy of therapeutic angiogenesis as a novel treatment in patients with critical limb ischemia. Ann. Vasc. Surg. 2010; 24: 287-94.

86. Idei N., Soga J., Hata T. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation reduces long-term major amputation risk in patients with critical limb ischemia: a comparison of atherosclerotic peripheral arterial disease and Buerger disease. Circ. Cardiovasc. Interv. 2011; 4: 15-25.

87. Walter D.H., Krankenberg H., Balzer J.O. et al. Intraarterial administration of bone marrow mononuclear cells in patients with critical limb ischemia: a randomized-start, placebo-controlled pilot trial (PROVASA). Circ. Cardiovasc. Interv. 2011; 4: 26-37.

88. Schiavetta A., Maione C., Botti C. et al. A phase II trial of autologous transplantation of bone marrow stem cells for critical limb ischemia: results of the Naples and Pietra Ligure Evaluation of Stem Cells study. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1: 572-8.

89. Benoit E., O'Donnell T.F. Jr., Patel A.N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: a systematic review of the literature. Cell Transplant. 2013; 22: 545-62.

90. Lu D., Chen B., Liang Z. et al. Comparison of bone marrow mesen-chymal stem cells with bone marrow-derived mononuclear cells for treatment of diabetic critical limb ischemia and foot ulcer: a double-blind, randomized, controlled trial. Diabetes Res. Clin. Pract. 2011; 92: 26-36.

91. Peeters Weem S.M., Teraa M., de Borst G.J. et al. Bone Marrow derived Cell Therapy in Critical Limb Ischemia: A Meta-analysis of Randomized Placebo Controlled Trials. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2015; 50: 775-83.

92. Liang T.W., Jester A., Motaganahalli R.L. et al. Autologous bone marrow mononuclear cell therapy for critical limb ischemia is effective and durable. J. Vasc. Surg. 2016; 63(6): 1541-5.

93. Jonsson T.B., Larzon T., Arfvidsson B. et al. Adverse events during treatment of critical limb ischemia with autologous peripheral blood mononuclear cell implant. Int. Angiol. 2012; 31(1): 77-84.

94. Lasala G.P., Silva J.A., Gardner P.A. et al. Combination stem cell therapy for the treatment of severe limb ischemia: safety and efficacy analysis. Angiology 2010; 61: 551-6.

95. Lasala G.P., Silva J.A., Minguell J.J. Therapeutic angiogenesis in patients with severe limb ischemia by transplantation of a combination stem cell product. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2012; 144(2): 377-82.

96. Sprengers R.W., Lips D.J., Moll F.L. et al. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Ann. Surg. 2008; 247: 411-20.

97. Kajiguchi M., Kondo T., Izawa H. et al. Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplantation for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Circ. J. 2007; 71: 196-201.

98. Fadini G.P., Agostini C., Avogaro A. Autologous stem cell therapy for peripheral arterial disease meta-analysis and systematic review of the literature. Atherosclerosis 2010; 209(1): 10-7.

99. Tang Y., Cui Y.C., Wang X.J. et al. Neural progenitor cells derived from adult bone marrow mesenchymal stem cells promote neuronal regeneration. Life Sci. 2012; 91: 951-8.

100. Liu F., Dong J., Sun S. et al. Autologous bone marrow stem cell transplantation in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized controlled trials. Chin. Med. J. 2012; 125(23): 4296-300.

101. Teraa M., Sprengers R.W., van der Graaf Y. et al. Autologous bone marrow-derived cell therapy in patients with critical limb ischemia: a meta- analysis of randomized controlled clinical trials. Ann. Surg. 2013; 258: 922-9.

102. Li M., Zhou H., Jin X. et al. Autologous bone marrow mononuclear cells transplant in patients with critical leg ischemia: preliminary clinical results. Exp. Clin. Transpl. 2013; 11: 435-9.

103. Gupta P.K., Chullikana A., Parakh R. et al. A double blind randomized placebo controlled phase I/II study assessing the safety and efficacy of allogeneic bone marrow derived mesenchymal stem cell in critical limb ischemia. J. Transl. Med. 2013; 11: 143.

104. Raval A.N., Schmuck E.G., Tefera G. et al. Bilateral administration of autologous CD133 cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double blind, placebo controlled trial. Cytotherapy 2014; 16: 1720-32.

105. Teraa M., Sprengers R.W., Schutgens R. et al. Effect of repetitive intra-arterial infusion of bone marrow mononuclear cells in patients with no-option limb ischemia: the randomized, double blind, placebo controlled JU-VENTAS Trial. Circulation 2015; 131: 851-60.

106. Losordo D.W., Kibbe M.R., Mendelsohn F. et al. A randomized, controlled pilot study of autologous CD34 cell therapy for critical limb ischemia. Circ. Cardiovasc. Interv. 2012; 5: 821-30.

107. Ai M., Yan C.F., Xia F.C. et al. Safety and efficacy of cell-based therapy on critical limb ischemia: A meta-analysis. Cytotherapy 2016; 18(6): 712-24.

108. Huang P., Li S., Han M. et al. Autologous transplantation of granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood mononuclear cells impuroves critical limb ischemia in diabetes. Diabetes Care 2005; 28: 2155-60.

109. Tongers J., Roncalli J.G., Losordo D.W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation 2008; 118: 9-16.

110. Murphy M.P., Lawson J.H., Rapp B.M. et al. Autologous bone marrow mononuclear cell therapy is safe and promotes amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. J. Vasc. Surg. 2011; 53: 1565-74.

111. Klepanec A., Mistrik M., Altaner C. et al. No Difference in Intra-Arterial and Intramuscular Delivery of Autologous Bone Marrow Cells in Patients With Advanced Critical Limb Ischemia. Cell Transplantation 2012; 21: 1909-18.

112. Van Tongeren R.B., Hamming J.F., le Cessie S. et al. Limited value of digital subtraction angiography in the evaluation of cell-based therapy in patients with limb ischemia. Int. J. Cardiovasc. Imaging 2010; 26: 19-25.

113. Toma C., Wagner W.R., Bowry S. et al. Fate of cultured-expanded mesenchymal stem cells in the microvasculature: in vivo observations of cell kinetics. Circ. Res. 2009; 104(3): 398-402.

114. Furlani D., Ugurlucan M., Ong L. et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 2009; 77(3): 370-6.

115. Konoplyannikov A.G., Petriev V.M., Konoplyannikova O.A. Effects of (60) Co whole-body gamma-irradiation in different doses on the distribution of (188) Re-labeled autologous mesenchymal stem cells in Wistar rats after intravenous (systemic) transplantation during different periods after exposure. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(4): 520-5.

116. Gruenloh W., Kambal A., Sondergaard C. et al. Characterization and in vivo testing of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells. Tissue Eng. Part A 2011; 17: 1517-25.

117. Lee R.H., Pulin A.A., Seo M.J. et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell 2009; 5: 54-63.

118. Amann B., Ludemann C., Ruckert R. et al. Design and rationale of a randomized, double-blind, placebo-controlled phase III study for autologous bone marrow cell transplantation in critical limb ischemia: The Bone Marrow Outcomes Trial in Critical Limb Ischemia (BONMOT-CLI). J. Vasc. Dis. 2008; 37: 319-25.

119. Ruiz-Salmeron R., de la Cuesta-Diaz A., Constantino-Bermejo M. et al. Angiographic demonstration of neoangiogenesis after intraarterial infusion of autologous bone marrow mononuclear cells in diabetic patients with critical limb ischemia. Cell Transplant. 2011; 20: 1629-39.

120. Lenk K., Adams V., Lurz P. et al. Therapeutical potential of blood-derived progenitor cells in patients with peripheral arterial occlusive disease and critical limb ischemia. Eur. Heart J. 2005; 26: 1903-9.

121. Cobellis G., Silvestroni A., Lillo S. et al. Long-term effects of repeated autologous transplantation of bone marrow cells in patients affected by peripheral arterial disease. Bone Marrow Transplant. 2008; 42: 667-72.

122. Bartsch T., Brehm M., Zeus T. et al. Autologous mononuclear stem cell transplantation in patients with peripheral occlusive arterial disease. J. Cardiovasc. Nurs. 2006; 21: 430-2.

123. Chavakis E., Aicher A., Heeschen C. et al. Role of beta2-integrins for homing and neovascularization capacity of endothelial progenitor cells. J. Exp. Med. 2005; 201: 63-72.

124. Gu Y.Q., Zhang J., Guo L.R. et al. Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia. Chin. Med. J. 2008; 121: 963-7.

125. Lenk K., Adams V., Lurz P. et al. Therapeutical potential of blood-derived progenitor cells in patients with peripheral arterial occlusive disease and critical limb ischaemia. Eur. Heart J. 2005; 26: 1903-9.

126. Chochola M., Pytlík R., Kobylka P. et al. Autologous intra-arterial infusion of bone marrow mononuclear cells in patients with critical limb ischemia. Int. Angiol. 2008; 27: 281-90.

127. Li S.H., Lai T.Y. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous and intramyocardial delivery. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2009; 137(5): 1225-33.

128. Романов Ю.А., Смирнов В.Н. Мезенхимальные стволовые клетки: биология и перспективы клинического применения. В: Пальцев М.А., редактор. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. В 2-х томах. Москва: Медицина; 2009. т. 1: 193-205.

129. Калашникова М.В., Брутер А.В., Белявский А.В. Оценка выживания мезенхимальных стволовых клеток при разных способах введения. В: Стволовые клетки и регенеративная медицина. Материалы V Всероссийской научно-практическай конференции; 2013, 18-21 ноября; Москва, Россия; 2013: 30.

130. Hare J.M., Traverse J.H., Henry T.D. et al. A randomized, doubleblind, placebo controlled dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (Prochymal ™ ) following acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 2009; 54: 2277-86.

131. Zhou B., Poon M.C., Pu W.T. et al. Therapeutic neovascularization for peripheral arterial diseases: advances and perspectives. Histol. Histo-pathol. 2007; 22: 677-86.

132. Procházka V., Gumulec J., Jaluvka, F. et al. Cell therapy, a new standard in management of chronic critical limb ischemia and foot ulcer. Cell Transplant. 2010; 19: 1413-24.

133. Molavi B., Zafarghandi M.R., Aminizadeh E. et al. Safety and Efficacy of Repeated Bone Marrow Mononuclear Cell Therapy in Patients with Critical Limb Ischemia in a Pilot Randomized Controlled Trial. Arch. Iran Med. 2016; 19(6): 388-96.

134. Bartsch T., Brehm M., Zeus T. et al. Transplantation of autologous mononuclear bone marrow stem cells in patients with peripheral arterial disease (the TAM-PAD study). Clin. Res. Cardiol. 2007; 96: 891-9.

135. Franz R.W., Parks A., Shah K.J. et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. J. Vasc. Surg. 2009; 50: 1378-90.

136. Franz R.W., Shah K.J., Johnson J.D. et al. Short to mid-term results using autologous bone-marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Vasc. Endovascular Surg. 2011; 45: 398-406.

137. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913-8.

138. Yoshida M., Horimoto H., Mieno S. Intra-arterial bone marrow cell transplantation induces angiogenesis in rat hindlimb ischemia. Eur. Surg. Res. 2003; 35: 86-91.

139. Van Royen N., Schirmer S.H., Atasever B. et al. START Trial: a pilot study on stimulation of arteriogenesis using subcutaneous application of granulocytemacrophage colony-stimulating factor as a new treatment for peripheral vascular disease. Circulation 2005; 112: 1040-6.

140. Lee H.C., An S.G., Lee H.W. et al. Safety and effect of adipose tissue- derived stem cell implantation in patients with critical limb ischemia. Circ. J. 2012; 76(7): 1750-60.

141. Suzuki H., Iso Y. Clinical Application of Vascular Regenerative Therapy for Peripheral Artery Disease. BioMed Research International, http://dx.doi.org/10.1155/2013/179730.

142. Compagna R., Amato B., Massa S. et al. Cell Therapy in Patients with Critical Limb Ischemia. Review Article. Stem Cells International, http:// dx.doi.org/10.1155/2015/931420.

143. Nishioka K., Hidaka T., Kihara Y. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation reduces longterm major amputation risk in patients with critical limb ischemia: a comparison of atherosclerotic peripheral arterial disease and Buerger disease. Circ. Cardiovasc. Interv. 2011; 4: 15-25.

144. Saigawa T., Kato K., Ozawa T. et al. Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans, and the association between efficacy and the number of implanted bone marrow cells. Circ. J. 2004; 68: 1189-93.

145. Vasa M., Fichtlscherer S., Aicher A. et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 2001; 89: E1-7.

146. Heeschen C., Lehmann R., Honold J. et al. Profoundly reduced neovascular-ization capacity of bone marrow mononuclear cells derived from patients with chronic ischemic heart disease. Circulation 2004; 109: 1615-22.

147. Dimmeler S., Leri A. Aging and disease as modifiers of efficacy of cell therapy. Circ. Res. 2008; 102: 1319-30.

148. Heiss C., Keymel S., Niesler U. et al. Impaired progenitor cell activity in age-related endothelial dysfunction. J. Am. Coll. Cardiol. 2005; 45: 1441-8.

149. Mamidi M.K., Pal R., Dey S. et al. Cell therapy in critical limb ischemia: current developments and future progress. Cytotherapy 2012; 14: 902.

150. Sprengers R.W., Verhaar M.C., Moll F.L. Growth factor and cell therapy in patients with critical limb ischemia. In: Bosiers M., Schneider P., editors. Critical limb ischemia. New York: Informa Healthcare USA Inc.; 2009. p. 302-20.

151. Hozo S.P., Djulbegovic B., Hozo I. Estimating the mean and variance from the median, range, and the size of a sample. BMC Med. Res. Meth-odol. 2005; 5: 13.

152. Conte M.S. Understanding objective performance goals for critical limb ischemia trials. Semin. Vasc. Surg. 2010; 23: 129-37.

Поступила: 06.062017