CC BY
40
DOI: 10.23868/201808015
стволовыЕ и (или) прогениторные клетки щитовидной железы и возможности их использования в тканевой инженерии
Н.С. Сергеева1, 2, Ю.Д. Хесуани3, А.П. Поляков1, В.А. Миронов3, А.Д. Каприн1
1 Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал Национального медицинского исследовательского центра радиологии, Москва, Россия
2 Российский национальный исследовательский медицинский Университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
3 30-Биопринтинг Солюшенс, Москва, Россия
stem (progenitor) THYRoiD cELLs AND THEiR pRoBABLE applications IN TissUE ENGENiRiNG
N.S. Sergeeva1 2, Yu.D. Hesuani3, A.P. Poljakov1, V.A. Mironov3, A.D. Kaprin1
1 PA. Herzen Moscow Oncology Research Institute — a branch of National Medical Research Center of Radiology, Moscow, Russia
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
3 3D-bioprinting solutions, Moscow, Russia
e-mail: prognoz.01@mail.ru
В обзоре представлены данные литературы, касающиеся эмбриогенеза, физиологической и репаративной регенерации щитовидной железы (ЩЖ) в постнатальном периоде в аспекте обоснования наличия в ее тканях стволовых и(или) прогенитор-ных клеток. Систематизированы данные, касающиеся генетических и белковых маркеров стволовых клеток ЩЖ, а также маркеров их тиреодифференцировки. Обсуждаются нерешенные проблемы и перспективы использования стволовых и(или) прогениторных клеток ЩЖ в тканевой инженерии.
ключевые слова: щитовидная железа, стволовые клетки, физиологическая и репаративная регенерация.
К наиболее распространенным заболеваниям щитовидной железы (ЩЖ), компрометирующим ее функцию, относят зоб, аденомы, а также аутоиммунные процессы. В схему лечения больных с этими заболеваниями входит заместительная гормонотерапия. Альтернативой заместительной гормонотерапии могли бы стать новые, более физиологичные биомедицинские стратегии восстановления ее функции, и, в частности, клеточная терапия и тканевая инженерия [1, 2]. Однако сегодня биофабрикация эндокринных желез пока находится на самых ранних этапах становления, являясь, в то же время, одним из наиболее активно развивающихся сегментов биоинженерии органов [2-5].
Обоснованием реальности такого биотехнологического подхода к использованию ЩЖ явились результаты исследований механизмов физиологической и репара-тивной регенерации ЩЖ и гиперпластических процессов в этом органе.
Так, было установлено, что в норме клетки ЩЖ за жизнь индивидуума обновляются около 5 раз [6, 7]. При резекции ЩЖ, она, как и печень, в ряде случаев регенерирует до исходного объема [8]. При гемитире-оидэктомии остаточная ЩЖ гипертрофируется по механизму обратной связи [9]. Свидетельством способности ЩЖ к обновлению являются гиперпластические и гипертрофические процессы в этом органе, например, при зобе [10]. Эти факты закономерно привели к предположению о наличии в структуре ЩЖ стволовых клеток (СК), а, следовательно, создали предпосылки к возможности биоинжениринга ЩЖ.
Фундаментом этого направления стали эмбриологические исследования, систематизированные в ряде обзоров. В частности, T.F. Davis и соавт. (2011) представили клеточные и молекулярные механизмы, обеспечивающие развитие ЩЖ мыши и человека [2]. Значимость этих исследований в аспекте
The review presents literature data on embryogenesis, physiological and reparative thyroid gland (TG) regeneration in the postnatal period in terms of substantiating the presence of stem/progenitor cells in its tissue. The data concerning genetic and protein markers of thyroid stem cells, as well as markers of their thyroid differentiation, are systematized. Unresolved problems and perspectives of the use of thyroid stem/progenitor cells in tissue engineering are discussed.
Keywords: thyroid gland, stem cells, physiological and repara-tive regeneration.
биоинжениринга состоит в создании основ для понимания того, как из СК ЩЖ in vitro получить дифференцированные тиреоциты (ТЦ) и функционально полноценные тиреоидные фолликулы (ТФ). На основе накопленных знаний авторами сформирована схема последовательной экспрессии в ранних клетках зародыша ряда транскрипционных факторов, обеспечивающих миграцию, активацию дифференцировки и функционализацию потомков эмбриональных СК (ЭСК) — то есть каскада событий, приводящих в эмбриогенезе к формированию фолликулов ЩЖ.
Так, миграцию и пролиферацию прогениторов, согласно этой схеме, обеспечивает экспрессия Hhex, Titf 1, Foxe-1 и Pax8. Активация рецептора (r) тиреотропного гормона гипофиза (гТТГ) индуцируется экспрессией транскрипционного фактора NIS (sodium iodide symporter). A присоединение ТТГ к активному рецептору на поверхности прогениторов приводит к активации синтеза тиреоидной пероксидазы (ТП), тиреоглобулина (ТГ), и, как следствие — к появлению у дифференцирующихся клеток способности захватывать йод и синтезировать тиреоидные гормоны. Эти процессы сопровождаются формированием фолликулов и дозреванием в них прогениторов до ТЦ. Автор полагает, что часть ЭСК остается в сформированной в эмбриогенезе ЩЖ в так называемых «гнездах» — небольших скоплениях тиреоцито-подобных клеток между ТФ [2].
В 2012-2013 гг. нескольким группам ученых [1, 11-13] из ЭСК мыши и далее из ЭСК человека in vitro удалось получить ТЦ и ТФ. Протоколы дифференцировки ЭСК, использованные в обоих случаях, были сходными. Так, R. Ma и соавт. (2013) [12] показано, что для диф-ференцировки ЭСК мыши в тиреоидном направлении необходимы 2 транскрипционных фактора — NKX2-1 (он же TF-1- тиреотропный фактор-1) и Рах8 (paired box gene), которые были описаны группой под руководством P. Cruss (1998) [14]. Данные гены синергично
ОБЗОРЫ
23
активируются с генами NIS, гТТГ, ТГ и ТП, если при индукции тиреодифференцировки использовали активин А и ТТГ. Экспрессия генов ТЦ в ЭСК начиналась после их трансфекции Рах8 и NKX2-1. При 3D культивировании ТЦ спонтанно формировали фолликулы [12]. Однако функциональность этих фолликулов доказана не была.
В сходных условиях из ЭСК человека удалось получить in vitro ТФ, в клетках которых были экспрессирова-ны гены ТГ, ТП и гТТГ [11, 15-22]. Позднее с помощью трансфекций генетических конструкций было доказано, что и для тиреоидной дифференцировки человеческих ЭСК необходима активация тех же транскрипционных факторов Рах8 и NKX2-1. Авторы показали, что в клетках сформированных ТФ экспрессирован и NIS, что в сочетании с экспрессией ТГ и ТП косвенно свидетельствует об активации йод-захватывающего каскада.
Данные об эмбриогенезе ЩЖ в сочетании с данными о возможности ex vivo дифференцировать ЭСК в тиреоидном направлении, а также клинические наблюдения физиологической и репаративной регенерации ЩЖ закономерно привели к поиску резидентных СК ЩЖ человека как возможному биоматериалу для ее биофабрикации.
Идентификация тиреоидных СК была почти одновременно осуществлена несколькими группами ученых [1, 23-25]. Источником клеток служила ткань ЩЖ, полученная после оперативных вмешательств по поводу зоба Хашимото или гипертиреозов. Общими генетическими маркерами этих клеток были Oct4, Рах8, Sox2 и NANOG, а дополнительными — GATA-4, HNF4a (энтодермаль-ные маркеры комитированных СК] и АВС-транспортеры (в частности, ABCG2], то есть все те же гены и транскрипционные факторы, которые активированы в ЭСК и в индуцированных плюрипотентных клетках. По иммунофено-типу СК ЩЖ характеризовались логичным сочетанием признаков — CD34+CD45-. Уникальных (для ЩЖ] маркеров СК пока не найдено.
Доля СК в ЩЖ составляет примерно 1/1000 [6]. Считается, что для них могут быть установлены, по крайней мере, три направления дифференцировки [26, 27]. В соответствующих индуцирующих «коктейлях» они способны дифференцироваться не только в «тиреоидном», но и «в адипогенном» направлении, экспрессируя соответствующие маркеры. А при культивировании с клетками нейробластомы в СК из ЩЖ экспрессировался р-тубулин, что косвенно свидетельствует о возможности их нейрональной дифференцировки. Таким образом «стволовость» этих клеток была подтверждена не только экспрессией ансамбля соответствующих генов, но и их пластичностью — способностью давать несколько клеточных линий.
Популяция СК ЩЖ, как и многих других тканей, оказалась фенотипически неоднородной. Так, N. Hoshi и соавт. (2007] в соответствии с экспрессией гена стволовых клеток Sca 1 разделили ее на 2 субпопуляции — CD45-, сК^-, Oct4+, Sca1 + и CD45-, сК^, Oct4+, Sca1- [28]. Обе эти субпопуляции не экспрессировали маркеры тиреоидной дифференциров-ки ТГ, гТТГ и транскрипционные факторы ТФ-1 и Рах8.
Кроме того, среди СК ЩЖ была выделена минорная популяция клеток -SP (side population], присутствующая среди резидентных СК ЩЖ во многих тканях, и не превышающая 0,3-1,4 % всех клеток ЩЖ [3, 28-30]. SP-клетки в ЩЖ, как и общая популяция СК, подразделялась на 2 субпопуляции — Sca1+ и Sca1-[19, 20]. Отличительной чертой SP клеток является способность выводить прижизненный краситель Hoechst 33342 [28, 30-33], что обусловлено экспрессией в этих клетках кассеты АВС-транспортеров, и, в частности, АВСG2 [28, 34].
При 3й-культивировании в коллагене [3], на де-целлюляризированном матриксе [5], в матригеле [28] или на оригинальном матриксе с повторяющимися полостями при задаваемом механическом векторе [5] СК ЩЖ формируют сфероидные колонии, которые после индукции тиреоидной дифференцировки реаранжи-руются в фолликулоподобные структуры, клетки которых позитивны по ТГ, ТП и гТТГ, перестают экспрессиро-вать гены СК и начинают захватывать I125. По мнению S. Kimura (2014) тиреосферы формируют вокруг себя нишу, в которой СК дифференцируются в ТЦ [3].
Эта сформированная СК in vitro ниша является аналогом естественных ниш СК ЩЖ в межфолликулярном пространстве [3, 30]. Данные об участии SP-клеток в морфогенезе in vitro противоречивы: одни авторы отводят им ведущую роль [3], другие считают, что SP-клетки не участвуют в образовании фолликулов, оставаясь в межфолликулярных территориях [6].
В моделях гипотиреоза, вызванного химическими агентами, облучением, резекцией ЩЖ или аутоиммуни-зацией [3, 30], «помощь» в восстановлении фолликулов из СК в ЩЖ оказывают и ММСК, также находящиеся в межфолликулярной территории, и, кроме того, возможно, мигрирующие в ЩЖ из костного мозга.
Работы в области молекулярной биологии и биомоделирования с использованием стволовых и (или) прогени-торных клеток ЩЖ закономерно привели к обсуждению проблемы биобезопасности. Ряд важных, накопленных к этому времени сведений, представлены ниже.
В СК ЩЖ, в том числе в SP-клетках экспрессирован ряд общих со стволовыми опухолевыми клетками (СОК) маркеров: Sca1, Oct4, p63 [35-40]. И в СК ЩЖ и в СОК ЩЖ активированы сходные сигнальные пути, в частности, p-катенин-ассоциированный Wnt сигнальный путь [40]. В SP-клетках ЩЖ экспрессирован STC (стагниокальцин), активированный и в опухолевых клетках ЩЖ [29].
Введение животным после тиреоидэктомии первичной культуры клеток из ЩЖ приводило к формированию новых фолликулов, количество которых было пропорционально количеству имплантированных клеток, а также зависело от уровней Т3, Т4 и ТТГ [41-43]. Однако в отдельных случаях в графтах развивались аденомы и недифференцированные раки ЩЖ. Таким образом, было сделано заключение, что СОК ЩЖ (как и СОК новообразований других органов) происходят из резидентных СК ЩЖ [1].
В целом не вызывает сомнений, что физиологическая и репаративная регенерация ЩЖ — это реальные процессы, обеспечивающиеся наличием в ткани ЩЖ резидентных стволовых и(или) прогениторных клеток. Это открывает перспективы клеточной терапии и тканевой инженерии ЩЖ. В то же время многие авторы отмечают, что для трансляции экспериментальных достижений в клиническую практику нужно решить ряд проблем: создать приемлемые пошаговые (step-by-step) протоколы масштабирования стволовых и(или) прогениторных клеток ЩЖ ex vivo и их дифференцировки, формирования тиреосфер и тире-оидных фолликулов, контроля их пролиферации и оценки их функциональности, включая способность захватывать йод и синтезировать гормоны [1,4, 5]. Не подобраны пока и органотипические скаффолды, обеспечивающие формирование в биореакторах или при 3й-биопринтинге тканевых эквивалентов ЩЖ. Открытым остается вопрос об аллотрансплантациях, требующих иммуносупрессивной поддержки в аспекте обеспечения длительного фукциони-рования тканевых эквивалентов ЩЖ в организме реципиента. И, наконец, протоколы биоинжениринга должны исключать или минимизировать риск злокачественной трансформации клеток на этапах ex vivo.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Fierabracci A. Identifying thyroid stem/progenitor cells: advances and limitations. J. Endocrinol. 2012; 213(1): 1-13.
2. Davies T.F., Latif R., Minshy N.C. et al. The Emerging Cell Biology of Thyroid Stem Cells. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011; 96(9): 2692-702.
3. Kimura S. Thyroid Regeneration: How Stem Cells Play a Role? Front. Endocrinol. (Lausanne) 2014; 5: 55.
4. Lin R.Y. New insights into thyroid stem cells. Thyroid 2007; 17(10): 1019-23.
5. Toni R., Tampieri A., Zini N. et al. Ex situ bioengineering of bioartificial endocrine glands: a new frontier in regenerative medicine of soft tissue organs. Ann. Anat. 2011; 193(5): 381-94.
6. Dumont J.E., Lamy F., Roger P. et al Physiological and pathological regulation of thyroid cell proliferation and differentiation by thyrotropin and other factors. Physiol. Rev. 1992; 72(3): 667-97.
7. Coclet J., Foureau F., Ketelbant P. et al. Cell population kinetics in dog and human adult thyroid. Clin. Endocrinol. (Oxf.) 1989; 31(6): 655-65.
8. Johansen R., Gardner R.E., Galante M. et al. An experimental study of thyroid regeneration following subtotal thyroidectomy. Surg. Gynecol. Obstet. 1951; 93(3): 303-9.
9. Clark O.H., Lambert W.R., Cavalieri R.R. et al. Compensatory thyroid hypertrophy after hemithyroidectomy in rats. Endocrinology 1976; 99(4): 988-95.
10. Gibelli B., El-Fattah A., Giugliano G. et al. Thyroid stem cells-danger or resource? Acta Otorhinolaryngol. Ital. 2009; 29(6): 290-5.
11. Antonica F., Kasprzyk D.F., Opitz R. et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature 2012; 491(7422): 66-71.
12. Ma R., Latif R., Davies T.F. Thyroid follicle formation and thyroglobulin expression in multipotent endodermal stem cells. Thyroid 2013; 23(4): 385-91.
13. Ma R., Latif R., Davies T.F. Human embryonic stem cells form functional thyroid follicles. Thyroid 2015; 25(4): 455-61.
14. Mansouri A., Chowdhury K., Cruss P. Follicular cells of the thyroid gland require Pax8 gene function. Nature Genetics 1998; 19: 87-90.
15. Kikkawa F., Gonzalez F.J., Kimura S. Characterization of a thyroid-specific enhancer located 5.5 kilobase pairs upstream of the human thyroid peroxidase gene. Mol. Cell. Biol. 1990; 10(12): 6216-24.
16. Mizuno K., Gonzalez F.J., Kimura S. Thyroid-specific enhancer-binding protein (T/EBP): cDNA cloning, functional characterization, and structural identity with thyroid transcription factor TTF-1. Mol. Cell. Biol. 1991; 11(10): 4927-33.
17. Francis-Lang H., Price M., Polycarpou-Schwarz M. et al. Cell-type-specific expression of the rat thyroperoxidase promoter indicates common mechanisms for thyroid-specific gene expression. Mol. Cell. Biol. 1992; 12(2): 576-88.
18. Civitareale D., Castelli M.P., Falasca P. et al. Thyroid transcription factor 1 activates the promoter of the thyrotropin recept orgene. Mol. Endocrinol. 1993; 7(12): 1589-95.
19. Civitareale D., Lonigro R., Sinclair A.J. et al. A thyroid-specific nuclear protein essential for tissue-specific expression of the thyroglobulin promoter. EMBO J. 1989; 8(9): 2537-42.
20. Shimura H., Okajima F., Ikuyama S. et al. Thyroid-specific expression and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate autoregulation of the thyrotropin receptor gene involves thyroid transcription factor-1. Mol. Endocrinol.1994; 8(8): 1049-69.
21. Endo T., Kaneshige M., Nakazato M. et al. Thyroid transcription fac-tor-1 activates the promoter activity of rat thyroid Na+/I-symporter gene. Mol. Endocrinol. 1997; 11(11): 1747-55.
22. Damante G., Tell G., DiLauro R. A unique combination of transcription factors controls differentiation of thyroid cells. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001; 66: 307-56.
23. Thomas T., Nowka K., Lan L. et al. Expression of endoderm stem cell markers: evidence for the presence of adult stem cells in human thyroid glands. Thyroid 2006; 16: 537-44.
24. Lan L., Cui D., Nowka K. et al. Stem cells derived from goiters in adults form spheres in response to intense growth stimulation and require thyrotropin for differentiation into thyrocytes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2007; 92: 3681-8.
25. Fierabracci A., Puglisi M.A., Giuliani L. et al. Identification of an adult stem/progenitor cell-like population in the human thyroid. J. Endocrinol. 2008; 198: 471-87.
26. Pasca di Magliano M., Di Lauro R., Zannini M. Pax8 has a key role in thyroid cell differentiation. PNAS USA 2000; 97(24): 13144-9.
27. Fierabracci A., Puglisi M.A., Giuliani L. et al. Identification of an adult stem/progenitor cell-like population in the human thyroid. J. Endocrinol. 2008; 198(3): 471-87.
28. Hoshi N., Kusakabe T., Taylor B.J. et al. Side population cells in the mouse thyroid exhibit stem/progenitor cell-like characteristics. Endocrinology 2007; 148(9): 4251-8.
29. Hayase S., Sasaki Y., Matsubara T. et al. Expression of stanniocal-cin 1 in thyroid side population cells and thyroid cancer cells. Thyroid 2015; 25(4): 425-36.
30. Okamoto M., Hayase S., Miyakoshi M. et al. Stem cell antigen 1-posi-tive mesenchymal cells are the origin of follicular cells during thyroid regeneration. PLoS One 2013; 8(11): e80801.
31. Goodell M.A., Brose K., Paradis G. et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 1996; 183(4): 1797-806.
32. Zhou S., Schuetz J.D., Bunting K.D. et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat. Med. 2001; 7(9): 1028-34.
33. Golebiewska A., Brons N.H., Bjerkvig R. et al. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell 2011; 8(2): 136-47.
34. Hoshi N., Kusakabe T., Taylor B.J. et al. Side population cells in the mouse thyroid exhibit stem/progenitor cell-like characteristics. Endocrinology 2007; 148(9): 4251-8.
35. Thomas D., Friedman S., Lin R.Y. Thyroid stem cells: lessons from normal development and thyroid cancer. Endocr. Relat. Cancer 2008; 15(1): 51-8.
36. Welm B.E., Tepera S.B., Venezia T.G. et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev. Biol. 2002; 245: 42-56.
37. Burger P.E., Xiong X., Coetzee S. et al. Sca-1 expression identifies stem cells in the proximal region of prostatic ducts with high capacity to reconstitute prostatic tissue. PNAS USA 2005; 102: 7180-5.
38. Xin L., Lawson D.A., Witte O.N. The Sca-1 cell surface marker enriches for a prostate-regenerating cell subpopulation that can initiate prostate tumorigenesis. PNAS USA 2005; 102: 6942-7.
39. Oh H., Bradfute S.B., Gallardo T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS USA 2003; 100: 12313-8.
40. Gibelli B., El-Fattah A.M.A., Giugliano G. et al. Thyroid stem cells — danger or resource? ACTA Otorhinolaryngologica Italica 2009; 29: 290-5.
41. Clifton K.H., DeMott R.K., Mulcahy R.T. et al. Thyroid gland formation from inocula of monodispersed cells: early results on quantitation, function, neoplasia and radiation effects. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1978; 4(11-12): 987-90.
42. Mulcahy R.T., Rose D.P., Mitchen J.M. et al. Hormonal effects on the quantitative transplantation of monodispersed rat thyroid cells. Endocrinology 1980; 106(6): 1769-75.
43. Domann F.E., Mitchen J.M., Clifton K.H. Restoration of thyroid function after total thyroidectomy and quantitative thyroid cell transplantation. Endocrinology 1990; 127(6): 2673-8.
Поступила: 22.022018
