CC BY
37
УДК 616.91:616.831.4-092.4
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЛЕГКИХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ
ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА
© Смирнов А.В., Быхалов Л.С., 'Бутенко А.М., **Ларичев В.Ф., Почепцов А.Я., **Хуторецкая Н.В.
Кафедра патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета, Волгоград; лаборатория морфологии и иммуногистохимии Волгоградского научного центра РАМН, Волгоград; лаборатория арбовирусных инфекций НИИ вирусологии РАМН им. Д.И. Ивановского, Москва
E-mail: [email protected]
При экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила в период развернутых клинических проявлений менингоэнцефалита (седьмые сутки эксперимента) в легких мышей обнаружены структурные признаки повреждения респираторных эпителиоцитов и эндотелиоцитов капилляров межальвеолярных перегородок. Выраженные ультраструктурные изменения сохранялись в респираторных эпителиоцитах на 14-е сутки эксперимента, что, по-видимому, обусловлено не только прямым цитопатическим действием вируса Западного Нила, но и цитотоксическими влияниями активированных альвеолярных макрофагов.
Ключевые слова: лихорадка Западного Нила, ультраструктура, легкие.
STRUCTURAL ALTERATIONS OF LUNGS IN EXPERIMENTAL MODELING WEST NILE FEVER Smirnov A. V., Bykhalov L.S., Butenko A.M., Larichev V.F., Pocheptsov A. Ya., Khutoretskaya N. V.
Pathanatomy Department of the Volgograd State Medical University, Volgograd;
Morphology & Immunohistochemistry Laboratory of the Volgograd Scientific Centre RAMS, Volgograd;
Arbovirology Infections Laboratory of the D.I. Ivanovskiy Virology SRI, Moscow Structural injuries of respiratory epitheliocytes and capillary endothelial cells of interalveolar septae were revealed at dromal period (7 day) of experimental modeling West Nile fever on mice. The prominent ultrastructural alterations were found in respiratory epitheliocytes of interalveolar septae for the 14-th day of experiment, and, obviously, mediated by direct cyto-pathic action of West Nile virus and cytotoxic influence of activated alveolar macrophages.
Keywords: West Nile fever, ultrastructure, lungs.
В последние годы отмечено существенное увеличение заболеваемости лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) в Волгоградской области, что связано с обострением эпидемической ситуации на юге России [1]. По результатам мониторинга наиболее опасными в отношении вируса Западного Нила и других арбовирусов являются территории юга России [5]. На юге Волгоградской области в 1999 г. возникла крупная эпидемическая вспышка ЛЗН [1]. Обнаружено около 400 только лабораторно подтвержденных случаев заболевания, смертность достигала 9,9-10% [6]. Считается, что истинное число больных со слабовыра-женной клинической симптоматикой ЛЗН по результатам серологического обследования населения до и после эпидемической вспышки было в 3-10 раз больше, а число инфицированных превысило 200 тыс. человек [2]. По данным В.А. Петрова [1], примерно каждый четвертый случай ЛЗН протекает без поражения ЦНС под маской острого лихорадочного состояния с общим интоксикационным синдромом и/или респираторной вирусной инфекции, однако у пациентов с синдромами иммунного дефицита, при иммуно-супрессорной терапии, а также у пожилых людей отмечена манифестация заболевания с высокой
летальностью [4]. Антигены вируса Западного Нила (ВЗН) помимо ЦНС часто выявляются в легких и некоторых других внутренних органах [3]. Интересным является тот факт, что в легких пациентов при иммуносупрессии не отмечено признаков воспаления в отличие от ЦНС [7].
Накопленные клинические материалы свидетельствуют о возможных различиях в морфогенезе воспалительного процесса в различных органах и об актуальности изучения повреждения органов дыхательной системы при инфицировании вирусом Западного Нила (ВЗН) [8].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование лихорадки Западного Нила (ЛЗН) производилось в лаборатории арбовирус-ных инфекций (зав. лаб. проф. А.М. Бутенко) ГУ НИИ вирусологии РАМН им. Д.И. Ивановского (директор, академик РАМН Д.К. Львов). В работе использовали белых мышей-самцов массой 10±2 г в возрасте 30 суток, которые были заражены вирусом Западного Нила (ЗН), астраханский штамм (Астр 901), подкожно в разведении 10-2 0,3 мл (10 животных). Заболевших животных с клинической
симптоматикой ЛЗН выводили из эксперимента на седьмые сутки (10 животных) и 14-е сутки (10 животных) под эфирным наркозом в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Контролем служили ложноинфицированные мыши-самцы (10 животных), которым подкожно вводили 0,3 мл 0,9% раствора хлорида натрия.
Срезы ткани легкого толщиной 5-7 мкм фиксировали в 10% нейтральном формалине, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Производили окрашивание срезов гематоксилином и эозином. Фиксацию кусочков легкого для электронномикроскопического исследования размером до 1 мм3 проводили в течение 12 часов в 4% растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН = 7,4) при температуре +4°С. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультра-тонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50° этаноле в течение 40 минут и 0,3% растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопластинок "Для ядерных исследований". Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге "Унибром 160 БП".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На седьмые сутки эксперимента у животных обнаруживаются клинические признаки западнонильского менингоэнцефалита в виде парезов, параличей, гипертермии. В легких наблюдается умеренное расширение части альвеол, резко выраженное полнокровие капилляров межальвео-лярных перегородок и других сосудов микроцир-куляторного русла. Обнаруживаются очаговые диапедезные кровоизлияния с выходом эритроцитов в просвет альвеол, сладж-феномен, в некоторых случаях наблюдаются изменения по типу геморрагического отёка. Выявляется утолщение цитоплазмы эндотелиоциов капилляров межаль-веолярных перегородок за счет отека и увеличения количества выпячиваний складок люминаль-ной поверхности (рис. 1). В цитоплазме обнаруживаются многочисленные пиноцитозные вези-
кулы. Наблюдается набухание части митохондрий с очаговым лизисом крист. Отмечаются небольшие участки инвагинаций ядерной оболочки. Ядрышко, как правило, не визуализируется. Базальная мембрана местами разрыхлена и фрагментирована. Имеются признаки интерстициального отека.
На 14-е сутки эксперимента у животных обнаруживается постепенное снижение выраженности неврологической симптоматики. В легких большинства животных наблюдается резко выраженное полнокровие капилляров межальвеоляр-ных перегородок, диапедез эритроцитов в стенки и просвет альвеол. Часть альвеол эмфизематозно расширена. В некоторых альвеолах наблюдаются слущенные эпителиальные клетки. В трети случаев обнаруживается наличие значительного количества серозного экссудата в альвеолах, который заполняет более 50% воздушного пространства альвеол. Кроме того, серозный экссудат определяется в части мелких бронхов и бронхиол, в стенках которых появляются единичные скопления лимфоцитов. Обнаруживаются очаговые лимфоидные инфильтраты в периваскулярных отделах.
Обнаруживается мозаичное повреждение эн-дотелиоцитов в различных участках легких. В части клеток сохраняются глубокие складки лю-минальной поверхности. В других эндотелиоци-тах в цитоплазме выявляются многочисленные везикулы с содержимым низкой электронной плотности за счет резко выраженного расширения цистерн эндоплазматической сети. Сохраняется утолщение цитоплазмы эндотелиоцитов капилляров межальвеолярных перегородок за счет отека. Обнаруживается набухание части митохондрий с очаговым лизисом крист. Базальная мембрана местами утолщена, в других участках обнаруживается её разрыхление и фрагментация.
В респираторных эпителиоцитах на седьмые сутки эксперимента отмечается образование множества цитоплазматических отростков в просвет альвеол, в их цитоплазме выявляются многочисленные мелкие ограниченные мембраной везикулы с содержимым низкой электронной плотности. В митохондриях обнаруживаются признаки слабовыраженного отека. Наблюдается наличие большого количества эндосом, сконцентрированных в люминальной части цитоплазмы. Обнаруживается дегрануляция пластинчатых телец в отдельных больших эпителиоцитах в просвет альвеол. Часть осмиофильного материала в пластинчатых тельцах отличается повышенной электронной плотностью, их ламеллы подвергаются разволокнению и гомогенизации. В цитоплазме наблюдается образование единичных ва-
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2010, № 1 куолей с содержимым низкой электронной плот- ности. От-
Рис. 1. Ультраструктура межальвеолярной перегородки мыши в период разгара ЛЗН (седьмые сутки). Электронная микрофотограмма. Ув. х10 000.
Рис. 2. Ультраструктура межальвеолярной перегородки мыши в период реконвалесценции (14-е сутки). Электронная микрофотограмма. Ув. х10 000.
мечается наличие крупных митохондрий с признаками отёка и очаговым лизисом крист. Часть микроворсинок, располагающихся на люминаль-ной поверхности, фрагментирована. К 14-м суткам эксперимента ультраструктурные изменения в респираторных эпителиоцитах нарастают, отмечаются выраженные признаки повреждения
плазматической мембраны и мембранных орга-нелл. Цитоплазма таких клеток выглядит резко отечной, в ядре увеличивается количество гетерохроматина (рис. 2).
На седьмые сутки эксперимента в межальвео-лярных перегородках и в просветах альвеол выявляются альвеолярные макрофаги, в цитоплазме
которых обнаруживается большое число фагосом и остаточных телец. В некоторых участках ме-жальвеолярных перегородок обнаруживается близкое расположение альвеолярных макрофагов и поврежденных эндотелиоцитов. В области контакта отмечается очаговая деструкция базальной мембраны, резко выраженный отек цитоплазмы эндотелиоцитов со смещением органелл в периферические и центральные отделы клетки. Подобные изменения, в виде выраженного отека в цитоплазме, сопровождающихся смещением ор-ганелл, очагового повреждения плазматической мембраны и органелл, сохраняются к 14-м суткам эксперимента, обнаруживаются и в прилежащих к макрофагам респираторных эпителиоцитах (рис. 2).
Таким образом, при экспериментальном воспроизведении ЛЗН, в период развернутых клинических проявлений менингоэнцефалита, в легких мышей обнаружены признаки повреждения различных компонентов аэрогематического барьера, которые сохраняются до 14-х суток, несмотря на уменьшение выраженности клинической симптоматики ЛЗН. Наблюдаемые изменения косвенно подтверждаются наличием смешанного серозногеморрагического экссудата у лиц, умерших в дромальный период ЛЗН [1]. Наиболее выраженные ультраструктурные изменения отмечаются в эндотелиоцитах капилляров межальвеолярных перегородок и респираторных эпителиоцитах, которые, по-видимому, обусловлены не только прямым цитопатическим действием ВЗН, но и цитотоксическими влияниями активированных альвеолярных макрофагов. Подобная точка зрения основывается на способности вирусов активировать альвеолярные макрофаги, которые оказывают повреждающее действие на клетки эндотелия сосудов и респираторного эпителия за счет выработки протеаз и оксидантов [5].
На основании проведённого исследования можно сделать следующие выводы.
1. Обнаружены структурные изменения в респираторных отделах легких при моделировании ЛЗН на 7-е сутки и 14-е сутки эксперимента, свидетельствующие о повреждении элементов аэро-
гематического барьера в различные периоды заболевания.
2. Выявленные в изучаемые сроки эксперимента ультраструктурные изменения в эндотелии капилляров межальвеолярных перегородок и респираторных эпителиоцитах связаны с цитопати-ческим действием вируса Западного Нила и повреждающим воздействием альвеолярных макрофагов, способствующим усилению экссудативных явлений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А., Григорьева Н.В. Лихорадка Западного Нила: по материалам вспышек в Волгоградской области в 19992002 гг. - Волгоград, 2004. - 104 с.
2. Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и др. Эпидемиологическая ситуация и прогноз заболеваемости лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып. 95. - С. 10-12.
3. Armah H.B., Wang G., Omalu B.I. et al. Systemic distribution of West Nile virus infection: postmortem immunohistochemical study of six cases // Brain Pathol. - 2007. - Vol. 17, N 4. - P. 354-362.
4. Diamond M.S., Mehlhop E., Oliphant T., Samuel M.A. The host immunologic response to West Nile encephalitis virus // Front Biosci. - 2009. - Vol. 14, N 1. - P. 3024-3034.
5. Farley K.S., Wang L., Mehta S. Septic pulmonary mi-crovascular endothelial cell injury: role of alveolar macrophage NADPH oxidase // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. - 2009. - Vol. 296, N 3. - P. 480488.
6. Murray K.O., Baraniuk S., Resnick M. et al. Clinical investigation of hospitalized human cases of West Nile virus infection in Houston, Texas, 2002-2004 // Vector Borne Zoonotic Dis. - 2008. - Vol. 8, N 2. -Р. 167-174.
7. Shrestha B., Zhang B., Purtha W.E. et al. Tumor necrosis factor alpha protects against lethal West Nile virus infection by promoting trafficking of mononuclear leukocytes into the central nervous system // J Virol. - 2008. - Vol. 82, N 18. - Р. 8956-8964.
8. Traineau R., Elghouzzi M.H., Bierling P. Update on infectious risks associated with blood products // Rev Prat. - 2009. - Vol. 59, N 1. - Р. 86-89.
