CC BY
67
УДК 618.145-002-022-097-06:618.39
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭНДОМЕТРИЯ У ЖЕНЩИН С НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ГЕНЕЗА
E. Л. Казачков, Е. Е. Воропаева, Э. А. Казачкова, О. А. Алимова, И. Г. Хелашвили
«Челябинская государственная медицинская академия», г. Челябинск
Одной из главных составляющих репродуктивных потерь является невынашивание беременности (НБ). Около 80% самопроизвольных выкидышей (СВ) происходит до 12 недель беременности. Частота привычных ранних потерь беременности в популяции достигает 3—5%. Риск потери желанной беременности возрастает с увеличением числа неудач и достигает 25% после двух предшествующих СВ и 30—45% после трех СВ [7—10].
НБ влечет за собой не только снижение рождаемости, но и оказывает отрицательное влияние на репродуктивное здоровье женщины [2].
Ведущими в генезе НБ среди большого количества экзо- и эндогенных причин являются инфекционно-воспалительные заболевания эндометрия, а своевременное квалифицированное морфологическое исследование слизистой оболочки матки имеет решающее значение для выяснения механизмов развития НБ и восстановления возможных нарушений репродуктивного здоровья [1, 4].
Цель исследования — изучение морфо-функциональных и молекулярно-биологи-ческих особенностей эндометрия у пациенток с синдромом первичной и привычной потери беременности инфекционно-воспа-лительного генеза.
Материал и методы
исследования
Проведено патогистологическое и мор-фометрическое изучение биоптатов слизистой оболочки матки от 102 пациенток репродуктивного возраста, страдающих НБ ранних сроков инфекционно-воспалитель-ного генеза. 1-ю группу составили 66 женщин, имеющих один СВ на сроке беременности до 12 недель инфекционно-воспали-тельного генеза. Во 2-ю группу вошли 36 пациенток с двумя и более СВ на сроке беременности до 12 недель инфекционно-воспалительного генеза.
Критериями исключения явились другие причины НБ, прием гормональных препаратов в течение последних двух месяцев перед исследованием.
Все женщины дали информированное согласие на участие в исследовании и открытую публикацию его результатов.
Обследование пациенток проводили по единой схеме, включающей анализ жалоб, анамнеза, общепринятые клинические и лабораторные, а также специальные методы исследования. Последние включали комплекс методов диагностики генитальной инфекции (ИФА, ПЦР, микроскопия, культураль-ный метод), морфологические методы исследования эндометрия, полученного путем
пайпель-биопсии на 20—22-й день менструального цикла через 3—4 месяца после СВ.
Гистологическое изучение парафиновых срезов эндометрия проводили при окраске материала гематоксилином и эозином, пик-рофуксином по Ван-Гизону и метиловым зеленым пиронином по Браше. Для объективного суждения о степени выраженности хронического эндометрита (ХЭ) применяли полуколичественный метод оценки интенсивности лимфоцитарной инфильтрации, плазматизации и фибротизации стромы эндометрия в биопсийном материале, разработанный Э. А. Казачковой [3] и в дальнейшем нами модифицированный для анализа степени активности воспаления [6].
Тканевые образцы для иммуногисто-химического исследования готовили по общепринятой методике. Используемые моно-клональные (МКАТ) или поликлональные антитела (ПКАТ) производства фирмы «Novocastra» (UK) были предназначены для работы с парафиновыми срезами. Для визуализации антигенреактивных клеток использовали тест-систему «Novostain Universal Detection Kit» («Novocastra», UK). После окончания инкубации с первичными антителами препараты тщательно отмывали, обрабатывали сначала вторичными биотинилирован-ными, затем третичными стрептавидиновы-ми антителами. По окончании 30-минутной инкубации при температуре 37°С и тщательной отмывки антигенреактивные клетки визуализировали с помощью 3,3-диаминобен-зидина тетрахлорида в буферном растворе. Препараты докрашивали водным раствором гематоксилина в течение 30 секунд. После редегидратации в спиртах препараты осветляли в двух объемах ксилола и заключали в канадский бальзам. При просмотре препаратов на светооптическом уровне антигенпо-зитивные клетки идентифицировали по их коричневому окрашиванию. Использование каждого вида МКАТ и ПКАТ сопровождалось постановкой реакций положительного конт-
роля на тех же самых срезах согласно оригинальным инструкциям по их использованию.
Для оценки пролиферативной активности эпителиоцитов эндометрия учитывали интенсивность экспрессии маркера Ki-67 (clone MM1, 1:100). Активность апоптоза изучали с помощью исследования экспрессии СРР32 (clone JHM62, 1:50). Клетки воспалительного инфильтрата иммунофенотипиро-вали с использованием МКАТ к CD4- (clone 4B12, r.t.u.), CD8- (clone 4B11, r.t.u.) и ПКАТ к IgA- (polyclonal, 1:200), Ig№- (polyclonal, 1:200) и IgG- (polyclonal, 1:200) антигенам. Анализ интенсивности и направленности процессов ремоделирования слизистой оболочки матки проводили с помощью МКАТ к MMP-2 (clone 17B11, 1:60), MMP-9 (clone 15W2, 1:30) и TIMP-1 (clone 6F6a, 1:150).
Для маркеров CD4, CD8, IgA, ^М и IgG, Ki-67, CPP32, а также рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов (ER; clone 6F11, r.t.u.) и прогестерона (PR; clone 1A6, r.t.u.), в 10 полях зрения (площадь поля зрения при об. 90 и ок. 8 составляет 994,5 мкм2) подсчитывали количество клеток, дающих интенсивное связывание пероксидазы в 1 мм2. Морфометрические исследования проводили с помощью программы анализа изображений Диа-Морф_Cito_W (Россия). Результаты реакций с маркерами к MMP-2, MMP-9 и TIMP-1 оценивали в баллах (полуколичественный метод с учетом процента окрашенных клеток: 2 балла — менее 20% маркированных клеток; 4 балла — 20—50%; 6 баллов — более 50% клеток).
Для гистохимических и иммуноморфо-логических исследований эндометрия контролем служили биоптаты слизистой оболочки матки от 15 соматически и гинекологически здоровых женщин репродуктивного возраста, обратившихся для обследования перед планированием беременности или контрацепции (группа контроля).
Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли при оптимальном увеличении на микроскопе «Axioplan 2» («Carl Zeiss Jena», Germany) с использованием цифровой фотокамеры («Carl Zeiss Jena», Germany).
Для выявления взаимосвязей между изучаемыми факторами был использован комплексный статистический анализ полученных количественных и порядковых величин. Применялись методы вариационного анализа (определение средней арифметической, ее стандартной ошибки, среднего квадрати-ческого отклонения, оценка распределения величин), корреляционного анализа (определение коэффициента линейной и нелинейной корреляции), регрессионного анализа. Пороговая величина вероятности ошибки устанавливалась традиционно на уровне, равном 0,05. Достоверность различий величин в группах по изучаемым факторам оценивали по критериям Стьюдента (различие средних) и Фишера (различие дисперсий), критерию согласия Пирсона, с использованием точного метода Фишера и линейного дискриминантного анализа [5]. Расчеты выполнены с помощью персонального компьютера с использованием программы «Биостатистика» и статистического пакета «Microsoft Excel-97» для операционной системы «Windows-98».
Результаты
Группы обследованных женщин были сопоставимы по характеру менструальной функции, сексуальному дебюту, количеству родов и абортов, характеру контрацептивного поведения.
Каждая третья пациентка в 1-й группе и каждая вторая во 2-й группе имели те или иные гинекологические заболевания в анамнезе, преимущественно осложненную эктопию цилиндрического эпителия шейки матки и хронический цервицит, ХЭ и сальпинго-
офорит, инфекции, передающиеся половым путем (ИППП). Следует отметить, что при привычном НБ в 2 раза чаще, чем у пациенток 1-й группы, встречались ХЭ и ИППП, а гиперпластические процессы в эндометрии, миома матки и кисты яичников регистрировались во 2-й группе в 3 раза чаще.
При исследовании характера микрофлоры влагалища и цервикального канала у 18,2% женщин 1-й группы и у 16,7% 2-й группы выявлен бактериальный вагиноз, у 15,2 и 13,9% соответственно — генитальный кандидоз. Неспецифический кольпит и цервицит, вызванный стрептококками, энтерококками, кишечной палочкой, зарегистрированы у 12,1% женщин 1-й группы и у 5,6% 2-й группы. Спектр ИППП в цервикальном канале был представлен в анализируемых группах следующим образом: хламидии — 18,2 и 13,9%, уреаплазмы — 19,7 и 19,4%, микоплаз-мы — 18,2 и 19,4%, ВПГ I и II серотипов — 19,7 и 16,7%, ЦМВ — 16,7 и 19,4%, ВПЧ1618шп — 12,1 и 11,1% соответственно. У всех этих пациенток при расширенной кольпоскопии обнаружен хронический цер-вицит.
При исследовании ткани эндометрия наличие различных микроорганизмов выявлено в 100% случаев в обеих группах. При этом не было зарегистрировано достоверных отличий в группах по характеру микрофлоры. Так, хламидийная инфекция выделена в эндометрии у 19,7% в 1-й группе и у 19,4% во 2-й, уреаплазменная и микоплазменная инфекция — у 50 и 52,8% соответственно, вирусная инфекция — у 50 и 47,2%. Следует отметить, что в эндометрии микроорганизмы выявлялись чаще, чем в цервикальном канале, что свидетельствует о необходимости идентификации возбудителей непосредственно в слизистой оболочке матки. Моноинфекция в эндометрии была зарегистрирована у 42,4% женщин 1-й группы и у 41,6% 2-й группы.
Морфологическое исследование биопта-тов эндометрия показало, что у всех женщин имеются структурные изменения слизистой оболочки матки, характерные для ХЭ. При этом обнаружена примерно одинаковая степень активности воспалительного процесса в группах, чаще — низкая либо умеренная. Однако в биоптатах женщин 2-й группы отмечены достоверно более выраженные явления фибробластической трансформации клеток стромы эндометрия, ее значительного фиброза и атрофии, отсутствие адекватных секреторных преобразований желез слизистой оболочки матки в связи с повреждением рецепторного аппарата гландулоци-тов, существенное угнетение тканевых про-тективных иммунных реакций.
У женщин 1-й и 2-й групп отмечено однонаправленное перераспределение желати-наз и их ингибитора во внеклеточном мат-риксе эндометрия, выраженное, однако, в большей степени при привычном СВ. Уровень экспонирования MMP-9 эпителиоцита-ми желез и клетками стромы был в 1,5 раза ниже значения данного параметра в группе контроля: в покровных эпителиоцитах и гландулоцитах желез — в среднем 1,6 балла (1,2—2,0), в базальной мембране и клетках воспалительного инфильтрата — 1,9 балла (1,4—2,5). Уровень экспрессии MMP-2 был примерно в 2 раза ниже одноименных показателей контрольной группы: в эпителиальных структурах эндометрия — в среднем 1,0 балла, в базальной мембране и клетках воспалительного инфильтрата — 1,2 балла. При сравнении экспонирования ММР-2 и ММР-9 в слизистой оболочке матки в обеих группах на фоне общего снижения уровня их экспрессии отмечены более высокие значения исследуемых маркеров в базальном слое эндометрия, чем в функциональном. При этом выявлена прямая сильная корреляционная связь анализируемых параметров со степенью активности воспаления в слизистой оболочке матки. Распределение TIMP-1 в ци-
топлазме поверхностных эпителиоцитов и гландулоцитов желез было неравномерным (в среднем 2,0 балла) и несколько превышало уровни MMP-9 и MMP-2. Экспрессия метки TIMP-1 отмечена и в клетках воспалительного инфильтрата (макрофаги, нейтрофильные гранулоциты) (в среднем 2,2 балла).
Нами обнаружены патоморфологические и молекулярно-биологические особенности воспалительного процесса в эндометрии в зависимости от идентифицированных возбудителей. Так, морфологическими компонентами ХЭ бактериальной этиологии являлись значительные дистрофические изменения покровных эпителиоцитов и клеток желез, различно выраженная полиморфно-клеточная инфильтрация слизистой оболочки матки со снижением значения иммуноре-гуляторного индекса (CD4+/CD8+), а также фибробластическая перестройка стромы и сосудов со снижением объемной плотности покровного эпителия эндометрия, относительного объема желез и повышением уровня относительного объема соединительной ткани. Зарегистрировано уменьшение количества плазмоцитов, продуцирующих ^ (р<0,05), а также повышение значения представительства (р<0,01) и ^-синтезирующих клеток (р>0,05). Как правило, эти изменения соответствовали высокой степени активности воспалительного процесса. При этом уровень ММР-2, ММР-9 и TIMP-1 был значительно выше, чем при ХЭ иной этиологии, хотя и не достигал контрольных значений. Пролиферативная активность покровных эпителиоцитов и гландулоцитов желез оказалась ниже нормальных показателей (р<0,01), однако экспрессия СРР32 была выше контрольного параметра. При этом отмечалось умеренное повышение интенсивности экспрессии ER и падение уровня экспрессии PR (р<0,05) как в эпителиальных, так и в стромальных клетках эндометрия. Таким образом, структурными особенностями клеточного обновления и рецепции, характерными
для ХЭ бактериальной природы, были интенсивные процессы апоптоза на фоне слабой пролиферативной активности и относительно высоком уровне металлопротеиназ, что обусловливало атрофию желез эндометрия и клеток стромы и, на наш взгляд, могло явиться причиной формирования синдрома потери плода.
При ХЭ уреаплазменно-микоплазменной этиологии в эндометрии выявлялись мозаичные слабо или умеренно выраженные воспалительные изменения с превалированием лимфогистиоцитарной реакции и формированием в отдельных полях зрения продуктивных васкулитов. Отмечены плазматическое пропитывание стенок сосудов базального слоя эндометрия, их очаговый фибриноид-ный некроз, разновеликие кровоизлияния в строму, фибротизация последней. При относительной сохранности представительства ^-продуцирующих плазмоцитов классов А, М и G зафиксировано выраженное снижение уровня CD4+-лимфоцитов и в меньшей степени — СD8+-клеток со значительным уменьшением отношения CD4+/СD8+. Пролифе-ративная активность клеток покровного эпителия и эпителиоцитов желез была низкой (уровень Ю-67 в 1,2 раза ниже показателя нормы; р<0,05). Вместе с тем, отмечена повышенная экспрессия СРР32, что, наряду с измененной пролиферативной активностью эпителиоцитов, обусловливало более или менее выраженную атрофию паренхиматозных и стромальных компартментов эндометрия. Особенностью рецепции половых стероидных гормонов явилась выраженная экспрессия ЕЙ (р<0,01) и тенденция к снижению экспрессии РИ. Все это обусловило частую регистрацию у пациенток данной подгруппы мозаичных картин строения слизистой оболочки матки с чередованием очагов фиброза, атрофии и полипоза эндометрия.
При хламидийной этиологии ХЭ отмечали значительные альтеративные и дистрофические изменения покровного эпителия, гландулоцитов маточных желез, а также вы-
раженную фибробластическую перестройку элементов стромы. Отмечены явления маль-формации эндометриальных сосудов (прека-пилляров, венул, лимфатических коммуникаций) со структурными признаками лимфо-стаза, плазмо- и лимфоррагии и очагами миксоидизации стромы. Среди элементов необильной воспалительно-клеточной инфильтрации преобладали лимфоциты и макрофаги, иногда с построением периваскуляр-ных лимфоцитарных «муфточек», наличием плазмоцитов (по 4—6 клеток в поле зрения), фибробластов, единичных нейтрофильных гранулоцитов. При этом отмечено падение уровня CD4+-лимфоцитов при относительно сохранном содержании СD8+-клеток и уменьшении по сравнению с контролем показателя иммунорегуляторного индекса. Установлено увеличение количества ^М-продуцирующих плазматических клеток при незначительном росте уровня и снижении числа ^-плазмоцитов (р>0,05). При ХЭ хламидийной этиологии отмечены самые низкие показатели ММР-2 и ММР-9. Кроме того, выявлено достоверное повышение в эндометрии экспрессии ЕЙ и пролифе-ративной активности гландулоцитов желез (значения К1-67 в 3,2 раза выше контрольного параметра; р<0,01) при практически неизменной интенсивности экспрессии РИ и СРР32.
При ХЭ вирусной природы в базальном эндометрии обнаруживали очаговый продуктивный васкулит, иногда с выраженными дистрофическими изменениями эндотелио-цитов вплоть до их некроза, явления тромбо-васкулита с организацией тромбов и облитерацией сосудов. Поверхностные эпителио-циты и клетки маточных желез выглядели умеренно атрофичными, имели различные проявления дистрофических расстройств. Воспалительно-клеточная инфильтрация была скудной, представлена в основном лимфо-гистиоцитарными элементами, располагающимися в виде мелких скоплений в фибрози-рованной строме. Среди лимфоцитов отме-
чено резкое падение уровня Т-клеток популяций CD4+ и СD8+ с практически не отличающимся от нормы показателем имму-норегуляторного индекса. В группе ^-проду-цирующих плазмоцитов отмечен некоторый рост популяции IgM- и ^-лимфоцитов, а также падение уровня ^-синтезирующих клеток. Экспрессия ER клетками желез и стро-мы достоверно превышала нормальный показатель, а уровень экспрессируемых PR не достигал контрольного параметра, особенно в клетках стромального компартмента (р<0,05). При вирусной этиологии ХЭ про-лиферативная активность эпителиоцитов слизистой оболочки матки была высока (уровень Ю-67 в 2,1 раза превысил норматив; р<0,05), интенсивность апоптоза по сравнению с контрольной группой несколько замедлена (р>0,05). Вероятно, в связи с этим у каждой пятой пациентки из этой подгруппы наряду с ХЭ выявлялась простая очаговая гиперплазия эндометрия.
Вывод
При НБ ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза имеет место ХЭ, преимущественно уреаплазменно-микоплаз-менной либо вирусной этиологии, часто встречаются микробные ассоциации. При этом морфофункциональными особенностями эндометрия являются мозаичность воспалительно-дисрегенераторных изменений, перестройка паренхиматозно-стромаль-ных отношений и отсутствие адекватных секреторных преобразований компонентов слизистой оболочки матки. При синдроме привычной потери беременности достоверно более выражены явления фиброза и атрофии стромы эндометрия, повреждение ре-цепторного аппарата, угнетение тканевых протективных иммунных реакций, снижение уровня экспрессии ММР-9 и ММР-2, а также повышение значений Т1МР-1 как своеобразного «противовеса» системе желатиназ. Это служит причиной ремоделирования слизи-
стой оболочки матки с прогрессированием коллагеногенеза и атрофии железистого аппарата на фоне персистенции возбудителя, что может явиться одним из факторов в гене-зе НБ. Патоморфологические и молекуляр-но-биологические особенности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки в зависимости от характера патогена диктуют необходимость не только эффективной элиминации инфекционного агента, но и проведения комплекса реабилитационных мероприятий, направленных на восстановление структурно-функциональных характеристик эндометрия.
Библиографический список
1. Глуховец Б. И. Патоморфологическая диагностика ранних самопроизвольных выкидышей/Б. И. Глуховец, Н. Г. Глуховец.— СПб.: Грааль, 1999.— 230 с.
2. Доброхотова Ю. Э. Реабилитация репродуктивной функции у женщин с неразвивающейся беременностью в анамнезе/ Ю. Э. Доброхотова, Т. А. Чернышенко, А. А. Аушева///Журнал акуш. и жен. болезней.— 2006.— Т. IV.— № 1.— С. 91—94.
3. Казачкова Э. А. Введение лекарственных препаратов в слизистую оболочку матки при хронических неспецифических эндометритах и сальпингоофоритах: дис. ... канд. мед. наук/Э. А. Казачкова.— Челябинск, 1984.— 196 с.
4. Овчинникова В. В. Оптимизация преграви-дарной подготовки женщин с невынашиванием беременности на фоне хронического эндометрита: автореф. дис. . канд. мед. наук/В. В. Овчинникова.— М., 2006.— 20 с.
5. Платонов А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы/ А. Е. Платонов.— М.: Издательство РАМН, 2000.— 52 с.
6. Полуколичественная морфологическая оценка активности воспалительного процесса при хроническом эндометрите/
О. А Алимова, Е. Е. Воропаева, Э. А. Казач-кова, Е. Л. Казачков///Матер. Всерос. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы пато-логоанатомической службы муниципальных учреждений здравоохранения».— Челябинск, 2008.- С. 198—201.
7. Сидельникова В. М. Привычная потеря беременности/В. М. Сидельникова— М.: Триада-Х, 2002—304 с.
8. Сидельникова В. М. Проблема ранних потерь беременности/В. М. Сидельникова// VIII Всерос. науч. форум «Мать и дитя».— М., 2006.— С. 239—240.
9. Тетруашвили Н. К. Клинико-патогенети-ческое обоснование использования различных методов иммунотерапии при привычном выкидыше/Н. К Тетруашви-ли//Акушерство и гинекология.— 2008.— № 5.— С. 7—12.
10. Sheinera E. Pregnancy outcome following recurrent spontaneous abortions/E. Sheinera, A. Levy//Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.— 2005.— Vol. 118.— № 10.— Р. 61— 65.
E. L. Kazachkov, E. E. Voropaevu, E. A. Kazachkova, O. A. Alimova, I. G. Khelashvili
STRUCTURAL CHANGES IN ENDOMETRIUM AMONG WOMEN WITH EARLY MISCARRIAGE OF INFECTIOUS INFLAMMATORY GENESIS
The aim of investigation was to study morphofunctional and molecular-biological peculiarities of endometrium in patients with the syndrome of primary and habitual loss of early pregnancy of infectious inflammatory
genesis. Pathohistological and morphometric investigation of uterine mucosa bioptate taken from 102 patients of reproductive age suffering from early miscarriage of infectious inflammatory genesis was performed. The first group included 66 women having one spontaneous miscarriage of infectious inflammatory genesis at the term of pregnancy up to 12 weeks. The second group included 36 female patients with two or more spontaneous miscarriages of infectious inflammatory genesis at the term of pregnancy up to 12 weeks. The complex of diagnostic methods of genital infections as well as histological, histochemical, morpho-metric, statistical methods of investigation were used in the present work. In 100% of cases, chronic endometritis, predominantly of ureaplasmomycoplasmal and viral and often of mixed etiology was registered in women of both groups. Among the patients of the second group, phenomena of fibrosis and stroma atrophy of endometrium as well as lesion of receptor apparatus, suppression of tissue protective immune reactions, lowering of gelatinase levels in extracellular matrix of uterine mucosa were reliably more pronounced.
Keywords: miscarriage, chronic endometri-tis, morphological and molecular-biological peculiarities.
Контактная информация: Казачков Евгений Леонидович, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической анатомии с секционным курсом Челябинской государственной медицинской академии, 454052, г. Челябинск, ул. П. Калмыкова, а/я 6123, тел. 8 (351) 232-01-50
Материал поступил в редакцию 25.02.2009
