CC BY
92
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, №3-5 ©2004, СП6Р0РААКИ
СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
Суслов А.П., Третьяков О.Ю., Коноплева М.В.
ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия Ключевые слова: МІГ, подавление миграции, таутомераза
ВВЕДЕНИЕ
Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF, macrophage migration inhibition factor), был открыт среди первых цитокинов в 1966 г. [5]. Некоторые особенности MIF позволяют предполагать, что он является фундаментальным и полифункциональ-ным общебиологическим регулятором, обеспечивающим мобилизацию клеточного и организменного защитного потенциала.
MIF обладает многочисленными функциями про-воспалительного цитокина, регулирующего миграцию и активацию макрофагов, продукцию провоспалитель-ных цитокинов (TNFa, IL-1, IL-6, y-IFN и др.), выступает в качестве естественного гормона-контррегулятора для противовоспалительной активности глюкокор-тикоидов, является контррегулятором экспрессии р53 и противоаптотическим фактором со свойствами ростового цитокина для макрофагов/моноцитов, а также опухолевых клеток [4,26,19]. MIF обладает ангиоген-ными функциями в условиях воспаления или развития опухолей. Кроме того, MIF имеет ферментативные активности разных классов (изомеразную/таутомераз-ную и оксидоредуктазную), однако физиологический субстрат для него не установлен и поэтому значение ферментативных активностей для проявления функций MIF in vivo не известно. Предполагается, в частности, что MIF может играть важную роль в обмене глюкозы. Так, MIF может осуществлять специфическое восстановление дисульфидных связей в молекуле инсулина, используя различные субстраты, например,
Адрес для переписки:
Суслов Анатолий Петрович 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18,
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН,
лаборатория эффекторов и медиаторов
иммунитета
Тел.: (095) 193-61-31
Факс: (095) 193-43-50
E-mail: anatoly.suslov@nearmedic.ru
глутатион или дигидролипоамид [12, 34]. Использование этих субстратов позволяет также сделать предположение, что MIF может участвовать в регуляции клеточного потенциала [12]. Кроме того, возможно, что благодаря тиоредуктазной активности MIF, совместно с HLA класса II, участвует в презентации антигена (например, HBsAg) [27].
Основными источниками MIF являются клетки головного мозга, печени, активированные макрофаги и Т-лимфоциты. В то же время, в условиях мобилизации защитных функций, по-видимому, практически все клетки в организме способны к продукции MIF [4].
MIF может быть не только важным компонентом системы мобилизации защитных функций организма, но и ключевым патофизиологическим фактором при развитии ряда тяжелых патологий, таких как септический шок, ревматоидный артрит, острые пневмонии, гломерулонефрит, ишемическая болезнь сердца, аллергические и онкологические заболевания [26]. Поэтому проводится интенсивный поиск нейтрализующих MIF веществ, являющихся контррегуляторами его активности. Элиминация MIF моноклональными анти-MIF антителами приводила к выраженным терапевтическим эффектам при гломе-рулонефрите, сепсисе, ревматоидном артрите, злокачественных опухолях, инфаркте миокарда и других заболеваниях [4, 26]. Обнаружены искусственные соединения, которые блокируют ряд активностей MIF in vitro [25, 28]. Имеются работы, по большей части ранние, которые указывают на возможность блокирования активности MIF веществами углеводной или гликолипидной природы, входящими, по предположению авторов, в состав клеточного рецептора для MIF [2, 11]. Однако механизмы естественной регуляции MIF остаются неизученными, а его естественные контррегуляторы — неидентифи-цироваными.
Структура молекулы MIF имеет некоторые особенные черты. Наиболее значимы следующие его характеристики. MIF является одним из самых кон-
сервативных белков [26, 33]. Хотя MIF - это секре-тируемый белок, однако, он не имеет обычной, характерной для секретируемых белков, N-концевой лидерной последовательности, что указывает на особый, неклассический, путь секреции этого фактора [7, 26]. Крайне редкой отличительной чертой MIF является обязательное присутствие пролина на 1 позиции, который, к тому же, может существовать в двух конформациях: цис- и транс- [33]. Предполагается, что MIF может подвергаться посттрансляци-онным модификациям, которые, в свою очередь, могут приводить к приобретению им новых функциональных активностей. Например, цистеинилирова-ние MIF в позиции Cys60 приводит к появлению у молекулы активности GIF (glycosilation inhibiting factor) [36]. Посттрансляционной модификации (фосфорилирование) может также подвергаться остаток Ser81, однако это происходит реже, чем цисте-инилирование Cys60 [36]. Следует также отметить, что у MIF имеется два потенциальных сайта глико-зилирования [3]. Функциональное разнообразие MIF может быть связано не только с посттрансля-ционными модификациями его молекулы, но также и с формой олигомеризации [27], или в результате образования комплекса с каким-либо регулятором.
Поскольку функции MIF многообразны, то представляется важным и необходимым провести тщательное исследование структуры MIF и ее взаимосвязи с его ключевыми активностями MIF: регуляции функции макрофагов и ферментативной активности.
Настоящая работа посвящена сравнительным структурным и функциональным исследованиям природного MIF, полученного из головного мозга человека, быка и мыши, а также разных форм рекомбинантного MIF с целью получения новой информации о природе гетерогенности MIF и ее связи с двумя разными активностями этого вещества: тау-томеразной активностью и способностью ингибировать миграцию. Кроме того, с целью поиска естественных ингибиторов или регуляторов функции MIF, изучали возможность блокирования или модификации ферментативной активности MIF при связывании этого фактора с веществами различной природы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение MIF
MIF выделяли из мозга человека, мыши и быка. Мозг гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере из расчета 40 мл буфера на 10 г ткани. Гомогенат центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин. К супернатанту добавляли сульфат аммония до концентрации 30% от насыщения. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 15 мин. К супернатанту добавляли сульфат
аммония до концентрации 60% от насыщения и оставляли при температуре 4°С на 18 ч для полного образования осадка. Сульфатаммонийную фракцию белков 30-60 % центрифугировали при 15000 g в течение 10 мин, отбрасывали супернатант и растворяли осадок в фосфатно-солевом буфере. Раствор белков прогревали при 56°С в течение 10 мин. Денатурировавшие белки отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант наносили на колонку Fractogel HW55 1,0x90 см, уравновешенную фосфатно-солевым буфером. Хроматографию вели со скоростью 12 мл/ч, контролируя выход MIF по таутомеразной активности.
Рекомбинантный MIF
Рекомбинантные MIF различного дизайна были произведены совместно с компаниями «ПИННИ» и «Синтол» (Москва). В работе использовали три вида рекомбинантного MIF: rMIF23, представляющий собой MIF человека с His-tag на С-конце, rMIF15 (MIF человека с His-tag на N-конце) и rMIF32 - N-концевой фьюжен-белок MIF человека (His-tag-тиоредоксин-тромбиновый сайт-сайт для энтерокиназы-MIF человека).
Экспрессию проводил следующим образом: компетентные клетки E.coli, штамм BL21(DE3)pLysS, трансформировали плазмидами рЕТ15Ь, рЕТ23 и рЕТ32 по стандартной методике. Клоны инокулиро-валив 100 мл среды ТВ и выращивали до OD600 1,0-1,2 при 37 еС. При достижении указанной оптической плотности добавляли IPTG до 0,1 мМ и инкубировали 16-18 ч при 30 еС.
Клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буфера с добавлением 20% глицерина и 10 мМ имидазола. Суспензию обрабатывали ультразвуком: три импульса по 15 с. Суспензию центрифугировали в течение 1 ч при 45 000 g. Далее белок очищали методом аффинной хроматографии на колонке HisTrap (Amersham).
Реагенты
В работе был использован HBsAg двух видов очистки: методом аффинной хроматографии (ИМБИО, Нижний Новгород) и выделение из преципитатов с поликлональными кроличьими антителами (по модифицированной методике [39]).
В работе также исследовали гентамицин (ОАО «Дальхимфарм», Россия) и аффинно очищенные (по стандартной методике) кроличьи антитела против IgG человека.
Определение ферментативной активности MIF
Определение таутомеразной активности MIF проводили спектрофотометрически. В качестве субстрата использовали р-гидроксифенилпируват. К 2 мл 0,435 М натрий-боратного буфера добавляли 100 мкл 5 мМ р-гидроксифенилпирувата (конечная концентрация в реакционной смеси - 235 цМ), затем исследуемое вещество (или натрий-боратный буфер,
в случае контрольных измерений), а в последнюю очередь - 20 мкл rMIF23 (конечная концентрация в реакционной смеси - 28 пМ). Увеличение оптической плотности регистрировали при длине волны 330 нм в течение 3 мин. По каждому исследованию измерение проводили трижды.
Определение физиологической активности MIF Ингибирование миграции макрофагов препаратами MIF изучали по стандартной методике к прибору «МигроСкрин» (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС»), разработанной на основе скринингового теста клеточной миграции in vitro [42].
Электрофорез и изофокусирование Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли [13]. Электрофорез в неденатурирующих условиях и изофокусирование проводили по стандартной методике [40, 41]. В качестве амфолинов использовали Servalyt AG 2-11 («Serva», Германия). Окрашивание белка серебром проводили по методике [21].
Определение N-концевой аминокислотной последовательности
N-концевую аминокислотную последовательность определяли методом деградации по Эдману.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Был разработан эффективный метод выделения нативного MIF из мозга человека, мыши и быка с помощью фракционирования гомогенатов мозга на колонке Fractogel HW55. Степень очистки по данным электрофореза составляла более 95%, при этом эффективность выделения была исключительно высокой: около 1 мг на 10 г массы ткани мозга. В результате проведенных исследований было показано, что мономерный MIF, выделенный из вышеуказанных источников, имел соответствующую литературным данным [8, 23, 33] молекулярную массу около 12,5 kDa (табл. 1). Подтверждением того, что был выделен именно MIF, послужило определение N-концевой аминокислотной последовательности, а также наличие у всех выделенных белков таутомераз-ной активности и функции ингибирования миграции макрофагов (табл. 1).
К,„ для каталитической таутомеразной активности MIF с гидроксифенилпируватом в качестве субстрата для всех выделенных белков различался незначительно (табл. 1).
По данным электрофореза в неденатурирующих условиях, MIF, выделенный из всех трех источников, имел форму тримера. Анализ методом изоэлектрофокусирования выявил гетерогенность молекулы MIF: белок человека и мыши имел три изоформы, а бычий - две изоформы (табл. 1).
Из рекомбинантных MIF только rMIF23, со свободным N-концевым Pro-1, обладал ферментативной таутомеразной активностью, тогда как rMIF15 и
rMIF32, у которых N-концевой Pro1 заблокирован, были не активны. По данным электрофореза в неденатурирующих условиях, rMIF23 был гетерогенен (имел форму тримера, тетрамера и пентамера), тогда как rMIF32 представлял собой мономер (рис. 2). Анализ методом изоэлектрофокусирования также выявил гетерогенность и rMIF23, и rMIF32 (табл. 1 и рис. 1).
Поскольку ранее было показано, что активность MIF по ингибированию миграции макрофагов может быть подавлена L-фукозой [14, 20, 35], мы изучали влияние L-фукозы на проявление таутомеразной активности rMIF23. Полученные нами данные показывают, что L-фукоза в концентрациях 10-20 мМ, в которых она отменяла функцию ингибирования миграции [35], не оказывает никакого влияния на таутомеразную активность rMIF23 (табл. 2).
Напротив, аффинно очищенный HBsAg подавлял ферментативную активность (табл. 2). HBsAg был выбран нами как объект исследования, так как ранее было продемонстрировано прямое связывание MIF с пептидом этого антигена [27]. В то же время, HBsAg, выделенный из преципитата по методу [39], не только не ингибировал, но значительно усиливал ферментативную активность rMIF23. Различие между HBsAg, выделенным аффинно и HBsAg, полученным из преципитата HBsAg с кроличьми анти-HBsAg антителами, могло быть обусловлено присутствием в преципитатном варианте HBsAg иммунных комплексов. Однако нами не было обнаружено стимулирующего действия иммуноглобулинов кролика на таутомеразную активность MIF (см. табл. 2). Действие других, не анти-HBsAg, иммунных комплексов исследуется.
Возможность значительного усиления таутомеразной активности MIF была показана нами при взаимодействии этого фактора с аминогликозидным антибиотиком гентамицином (табл. 2). Гентамицин резко (в 2-3 раза) усиливал ферментативную активность MIF. Более того, гентамицин полностью отменял угнетающее действие HBsAg на таутомеразную активность MIF, что указывает на то, что эти два вещества разной природы, по-видимому, конкурируют за одни и те же места связывания с MIF.
Обсуждение
Разработанный нами высокоэффективный метод получения чистого MIF из головного мозга, помимо практического приложения, вскрывает важный теоретический аспект. Содержание MIF в общей массе ткани головного мозга, как мы показали, в норме составляет огромное количество (не менее 0,1%). В ткани передней доли гипофиза, где MIF продуцируется как гормон, его содержание составляет около
0,05% [26]. Для сравнения, содержание АСТН и про-лактина в аденогипофизе составляет 0,2% и 0,8% со-
Рис. 2. Электрофорез в неденатурирующих условиях
1 - ГМІР23,2 - гМ1Р32,3 - белковые стандарты
1 - гМ1Р23,2 - гМ1Р32, 3 - белковые стандарты
ТАБЛИЦА 1. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА М1Р, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА, МЫШИ И БЫКА
М№ Человек Мышь Бык гМІР23 гМ№32
!Ч-концевая последовательность РМРІУ Н.д.* РМБУУ МРМБІ НІ56- РМБІУ
М.\¥. (мономера), Ша 12,5 12,5 12,5 13,0 40,0
Нативная форма тример тример тример тример, тетрамер, пентамер мономер
РІ 6,5; 7,0; 8,5 7,5; 7,8; 9,0 7,5; 8,5 7,2; 7,25; 7,3; 7,35; 7,4 7,0; 6,9; 5,6
Мин. концентрация для подавления миграции (нг/мл) 2-5 2-5 2-5 Н.д. Н.д.
Таутомеразная активность, Кт для гидроксифенилпирувата 450 цМ 510 дМ 390 /іМ 400 /хМ Не активен
Чистота по данным БОБ-фореза >95% >95% >95% >99% >99%
ТАБЛИЦА 2. КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТАУТОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ гМ1Р23 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ р-ГИДРОКСИФЕНИЛПИРУВАТА В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА
№ Концентрация в реакционной смеси ДАззо по отношению к контролю, %
Ь-фукоза, мМ Г ентамицин, г/мл НВ5А§ прец., г/мл HBsAg афф., г/мл ЧС, г/мл
1 - 75 - - - + 170
2 - - - 28 - -68
3 - 75 - 0,28 - + 101
4 - - 0,08 - - +71
5 - 75 0,08 - - + 124
6 - - - - 17 +4
7 20 - - - - -4
ответственно [26]. Полученные нами данные о больших количествах МІР в головном мозге хорошо согласуются с ранее установленным фактом, что во всех отделах головного мозга взрослого человека имеется исключительно высокий уровень экспрессии мРНК МІР [16]. Авторы вышеуказанной работы, исходя из того, что ряд катехоламинов имеет сходство по структуре с дофахромом, а МІР обладает активностью дофахромтаутомеразы, предположили, что МІР участвует в катализе катехоламинов, а именно, в детоксикации катехол-производных хино-нов. Это предположение получило в их работе экспериментальное подтверждение. Таким образом, МІР находится в головном мозге в больших количествах и потенциально может играть важную защитную роль для нервной ткани от катехол-зависимой клеточной смерти [16].
Практически все ранние работы по биохимической характеристике МІР указывали на его гетерогенность по молекулярной массе и заряду [37]. Позже было обнаружено, что некоторые другие вещества (например, ТОТР), обладают М1Р-подобной активностью, поэтому полной уверенности в том, что авторы изучали гетерогенность МІР/СІР нет. В настоящее время появились публикации, демонстрирующие гетерогенность именно МІР, поскольку уникальность его была подтверждена аминокислотной последовательностью [8, 9, 15, 22].
Ряд современных работ свидетельствует, что существует гетерогенность МІР по заряду. Так, например, для МІР печени, ткани рака молочной железы человека, Т-клеточной линии, а также в препаратах рекомбинантного МІР человека, экспрессированного в Е.соїі, было обнаружено две основные изоформы МІР (рі 7,8 и 6,98) и одна минорная (р16,23). Авторы сделали предположение, что такая гетерогенность по заряду является результатом посттрансляционных модификаций МІР, не требующих участия ферментов, специфичных для эукариот [15]. Другие авторы также сообщали о выделении разных изоформ МІР из мозга быка [8, 9, 22], например, изоформы МІР с р19,5 [9] или изоформы с модифицированным 1Ч-концом [22]. Неоднократно удавалось выделить МІР не только в виде мономера, но также в виде димера [23, 6].
Полученные нами данные подтверждают, что МІР, независимо от того, был ли он выделен из природного источника (головного мозга) или получен в рекомбинантной форме, гетерогенен по заряду. Хотя все изоформы МІР были обнаружены при изоэлект-рическом фокусировании в одной области (щелочной), разброс по заряду значителен. Выявленная гетерогенность природного и рекомбинантного МІР может быть связана либо с посттрансляционными модификациями, либо с аффинным присоединением каких-то регуляторов.
Проведенные нами исследования ферментативной таутомеразной активности МІР подтверждаются ли-
тературными данными. Известно, что при ферментативном катализе D-дофахрома, важную роль может играть Lys32 [29], но именно Pro1 определяет необычный каталитический механизм MIF как фермента, относящегося к особой группе таутомераз: перенос протона осуществляется в условиях необычайно низкого рКа (характерного для Pro1 MIF) и определяется не зарядом, а гидрофобностью активного центра [1, 30,31]. Из трех исследованных нами рекомбинантных молекул MIF активным был именно тот, у которого N-конец молекулы свободен (rMIF23), причем Кт практически не отличался от Km нативного MIF, очищенного из мозга. Два другие рекомбинантные MIF (rMIF15 и rMIF32), имеющие закрытый N-ico-нец, как и ожидалось, были ферментативно неактивными.
Некоторые авторы отмечают, что в основе разнообразия биологических функций, осуществляемых MIF, наряду с разной ферментативной активностью MIF, может лежать различие форм олигомеризации его молекулы. Методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР [32] было показано, что MIF представляет собой гомотример в форме бочонка с каналом, доступным для растворителя. На входе в канал располагается активный центр с Pro1. Однако, в физиологических условиях MIF существует, главным образом, как мономер (44%) и димер (33%), и только наименьшая фракция (23%) формирует тример [18,
23, 27, 38], причем есть данные, что активностью обладают именно мономеры или димеры. Так, восстановление дисульфидных связей в молекуле инсулина за счет тиолоксидоредуктазной активности MIF может быть связано с работой димера (или мономера) MIF, но не его тримера, поскольку молекула инсулина слишком велика для проникновения в канал, образуемый тримером MIF [27].
Представляют интерес исследования связи олигомерной формы MIF с его таутомеразной активностью и выполняемой биологической функцией. Важность этого направления исследований обусловлена тем, что консервативный остаток Pro1 является ключевым звеном в формировании активного центра не только для таутомеразной активности, но и для функции активации нейтрофилов, а также контрре-гулирующего влияния MIF на супрессивное действие глюкокортикоидов на продукцию TNFa [1,28, 33].
Нами было показано, что все формы MIF, обладающие таутомеразной активностью (нативный MIF мыши, быка и человека, а также rMIF23) при электрофорезе в неденатурирующих условиях, имели молекулярную массу, соответствующей тримеру, однако rMIF23 характеризовался большей гетерогенностью, поскольку был выявлен не только в форме тримера, но и в виде тетра- и пентамера. Поскольку для олигомеризации MIF существенен С-конец молекулы [17], можно предположить, что наличие тетра- и
пентамеров в белке гМ1Р23 может быть связано с изменениями, вызванными С-концевыми His6-tag в ре-комбинантой молекуле. В отличие от нативных белков и гМ1Р23, ферментативно неактивный фьюжен-белок М1Б с тиоредоксином на И-конце (гМ1Р32) представлял собой мономер. Это позволяет высказать предположение, что для таутомеразной активности М1Б важно, чтобы белок имел форму тримера. Кроме того, возможно, что Ы-концевая область молекулы М1Б также играет определенную роль в образовании олигомеров.
Вероятно, что на биологическую функцию МГБ, помимо посттрансляционных модификаций и формы олигомеризации, может оказывать влияние и связывание каких-либо веществ-регуляторов. Было показано, например, что Ь-фукоза отменяет ингибирование миграции фагоцитов, вызванное М1Б [14, 20, 35]. Кроме того, было показано модулирующее влияние на активность М1Р ганглиозидов и жирных кислот [2, И]. Известно также, что у М1Р имеется два потенциальных сайта гликозилирования. Показано, что М1Б может связываться с Ь-фукозой [6], инсулином или HBsAg [12, 27]. Предположительно, связывание М1Р с HBsAg в комплексе с НЬА класса
II существенно для презентации антигена на поверхности лимфоцитов и опосредуется тиоредуктазной активностью М1Р [27].
Предположение о том, что связывание некоторых определенных молекул может влиять на ферментативную активность МЩ было проверено нами в нескольких модельных экспериментах.
Полученные нами данные показывают, что Ь-фу-коза в концентрациях 10-20 мМ, в которых она отменяла ингибирующую мигацию фагоцитов функцию М1Р [35], не оказывает никакого влияния на таутомеразную активность М1Р. Вероятно, что механизм регулирующего действия Ь-фукозы на М1Р связан с каким-то другим механизмом.
Поскольку установлено, что М1Р связывается с пептидным участком HBsAg вируса гепатита В, была исследовано возможное влияние такого присоединения на таутомеразную активность М1Р. Оказалось, что аффинноочищенный на колонке с aнти-HBsAg антителами HBsAg ингибировал активность гМ1Р23. Неожиданно оказалось, что HBsAg, полученный другим методом (из преципитата), не только не ингибировал, но значимо усиливал таутомеразную активность гМ1Р23.
Еще более неожиданным было обнаруженное нами резкое (в 2-3 раза) усиление активности гМ1Р23 в присутствии аминогликозидного антибиотика гентамицина. В литературе нами не было найдено факта столь сильного увеличения активности не только М1Р-таутомеразы, но и других таутомераз человека при каком-либо взаимодействии с лигандом. Более того, гентамицин отменял ингибирующее действие аффинноочищенного HBsAg на таутоме-
разную активность MIF, возможно путем конкуренции и вытеснения антигена из места связывания с MIF. Хотя ранее было показано, что MIF связывается с ганглиозидами и различными углеводами, остается непонятным механизм взаимодействия гентамицина с rMIF23. Мы можем предположить, что связывание гентамицина с каким-то дистантным по отношению к N-концу сайтом молекулы MIF приводит к конформационным изменениям, сопровождающимся уменьшением Кш и/или возрастанием Vmax, связанными с активным центром, локализованным в области Pro1. Возможно, именно такого рода взаимодействия регулируют функции MIF и приводят к его молекулярной гетерогенности. Дальнейшие исследования будут посвящены подтверждению или опровержению данной гипотезы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bendrat К., Al-Abed Y., Callaway D.J., Peng Т., Calandra Т., Metz C.N., Bucala R. Biochemical and mutational investigations of the enzymatic activity of macrophage migration inhibitory factor // Biochemistry
- 1997. - Vol.36, No.49. - P.15356-15362.
2. Berenson C.S., Patterson M.A., Pattoli M.A., Murphy T.F. A monoclonal antibody to human macrophage gangliosides inhibits macrophage migration //J. Leukoc. Biol. - 1996. - Vol.59, No.3. - P.371-379.
3. BernhagenJ., Mitchell R.A., Calandra Т., Voelter W., Cerami A. Bucala R. Purification, bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor (MIF) // Biochemistry -1994. — Vol.33, No.47. — P. 14144-14155.
4. Bucala R. Neuroimmunomodulation by macrophage migration inhibitory factor (MIF)//Ann. NY AS. -1998.
- Vol. 840, No. 1. - P.74-82.
5. David J. Delayed hypersensitivity in vitro: its mediation by cell free substances formed by lymphoid cell-antigen interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1966. - Vol.56.- P.72-77.
6. Fahlbusch B., Schumann I. Inhibition of macrophage migration by a factor from ascites fluids of ovarian cancer patients. III. Generation of monoclonal antibody specific for human MIF // Biomed. Biochim. Acta - 1987. — Vol.46, No.5. - P.397-406.
7. Flieger 0., Engling A., Bucala R., Lue H., Nickel W., Bernhagen J. Regulated secretion of macrophage migration inhibitory factor is mediated by a non-classical pathway involving an ABC transporter // FEBS Lett.
- 2003. - Vol.551. - P.78-86.
8. Galat A., Riviere S., Bouet F. Purification of macrophage migration inhibitory factor (MIF) from bovine brain cytosol // FEBS Lett. - 1993. — V.319, No.3. - P.233-236.
9. Galat A.,Riviere S., Bouet F., Menez A. A diversified family of 12-kDa proteins with a high amino
acid sequence similarity to macrophage migration inhibitory factor (MIF) // Eur. J. Biochem. - 1994. — Vol.224, No.2. - P.417-421.
10. Hamel J., Rola-Pleszczynski M. Physicochemical characterization of human fibroblast migration inhibitory factor // Cell Immunol. - 1985. — Vol.96, No.2. -P.301-311.
11. Higgins T.J., Liu D.Y., Remold H.G., David J.R. Further characterization of the putative glycolipid receptor for MIF: role of fucose associated with an acidic glycolipid // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1980.
- Vol.93, No.4. - P.1259-1265.
12. Kleemann R., Mischke R., Kapurniotu A., Brunner H., Bernhagen J. Specific reduction of insuline disulfides by macrophage migration inhibitory factor (MIF) with glutathione and dihyrolypoamide: potential role in cellular redox processes // FEBS Lett. - 1998.
- Vol.430.-P.191-196.
13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature - 1970. - Vol.227. - P.680-685.
14. MacSween J.M., Rajaraman K., Rajaraman R., Fox R.A. Macrophage migration inhibition factor (MIF): reducing the variables //J. Immunol. Methods
- 1982. - Vol.52, No.l. - P.127-136.
15. Magi B., Bini L., Liberatori S., Marzocchi B., Raggiachi R., Arcuri F., Tripodi S.A., Cintorino M., Tosi P., Pallini V. Charge heterogeneity of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in human liver and breast tissue// Electrophoresis - 1998. — Vol. 19, No.l 1.
- P.2010-2013.
16. Matsunaga J., Sinha D., Panell L., Santis C., Francisco S., Wistow G.J., Hearing V.J. Enzyme activity of macrophage migration inhibitory factor toward oxidized catecholamines // J. Biol. Chem. - 1999. -Vol.274, No.6. - P.3268-3271.
17. Mischke R., Gessner A., Kapurniotu A., Jettner
S., Kleemann R., Brunner H., Bernhagen J. Structure activity studies of cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) reveal a critical role for its carboxy terminus // FEBS Lett. - 1997. — Vol.414. — P.226-232.
18. Mischke R., Kleemann R., Brunner H., Bernhagen J. Cross-linking and mutational analysis of the oligomerization state of the cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) // FEBS Lett. -1998. - Vol.427. - P.85-90.
19. Mitchel R.A., Liao H., Chesney J., Fingarle-Rowson G., Baugh J., David J., Bucala R. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) sustains macrophage proinflammatory function by inhibiting p53: Regulatory role in the innate immune response // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2002. - Vol.99. - P.345-350.
20. Miura T., Handra S., Yamakawa T. Specific inhibition of macrophage migration inhibitory factor by fucosylated glycolipid RM // J. Biochem. — Vol.86, No.3. - P.773-776.
21. Nesterenko M.V., Tilley M., Upton S.J. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels // J. Biochem. Biophys. Methods - 1994. — Vol.28(3).
- P.239-242.
22. Nishibori M., NakayaN., Mori S., Kawabata M„ Tahara A., Saeki K. Affinity purification of macrophage migration inhibitory factor/glycosylation inhibiting factor (MIF/GIF) from bovine brain by using a peptide ligand derived from novel serpin // Jpn. J. Pharmacol.
- 1996. - Vol.71, No.3. -P.259-262.
23. NishihiraJ., KiriyamaT., Sakai M., Nishi S., Ohki
S., Hikichi K. The structure and physicochemical properties of rat liver macrophage migration inhibitory factor // Biochim. Biophys. Acta - 1995. — Vol.1247, No.l. — P.159-162.
24. NishihiraJ., Kuriyama T., Nishino H., Ishibashi T., Sakai M., Nishi S. Purification and characterization of human macrophage migration inhibitory factor: evidence for specific binding to glutathione and formation of subunit structure // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1993. - Vol.31, No.5. - P.841-850.
25. Orita M., Yamamoto S., Katayama N., Aoki M., Takayama K„ Yamagiwa Y„ Seki N., Suzuki H., Kurihara
H., Sakashita H., Takeuchi M., Fujita S., Yamada T., Tanaka A. Coumarin and chromen-4-one analogues as tautomerase inhibitors of macrophage migration inhibitory factor: discovery and X-ray crystallography //J. Med. Chem. - 2001. — Vol.44, No.4. - P.540-547.
26. Petrovsky N., Bucala R. Macrophage migration inhibitory factor (MIF): a critical neurohumoral mediator // Ann. NYAS. — 2000. — Vol.917, No.l. — P.665-671.
27. Potolicchio I., Santambrogio L., Strominger J.L. Molecular interaction and enzymatic activity of macrophage migration inhibitory factor with immunorelevant peptides //J. Biol. Chem. - 2003. - Vol.278, No.33. - P.30889-30895.
28. Senter P.D., Al-Abed Y., Metz C.N., Benigni F., Mitchell R.A., Chesney J., Han J., Gartner C.G., Nelson
S.D., Todaro G.J., Bucala R. Inhibition of macrophage migration inhibitory factor (MIF) tautomerase and biological activities by acetaminophen metabolites // PNAS - 2002. - Vol.99, No.l. - P.144-149.
29. Soares T., Goodsell D., Ferreira R., Olson A.J., Briggs J.M. Ionization state and molecular docking studies for the macrophage migration inhibitory factor: role of lysine 32 in the catalytic mechanism //J. Mol. Recognit. - 2000. — Vol.13, No.3. — P.146-156.
30. Soares T.A., Lins R.D., Straatsma T.P., Briggs J.M. Internal dynamics and ionization states of the macrophage migration inhibitory factor: comparison between wild-type and mutant forms // Biopolymers -2002. - Vol.65, No.4. - P.313-323.
31. Stamps S.L., Fitzgerald M.C., Whitman C.P. Characterization of the role of the amino-terminal praline in the enzymatic activity catalysed by macrophage
migration inhibitory factor // Biochemistry - 1998. — Vol.37, No.28. - P.10195-10202.
32. Sugimoto H., Suzuki M., Nakagawa A., Tanaka
I., Nishihira J. Crystal structure of macrophage migration inhibitory factor from human lymphocyte at 2.1 E resolution // FEBS Lett. - 1996. — V.389. — P.145-148.
33. Swope M., Sun H. — W„ Blake P.R., Lolis E. Direct link between cytokine activity and a catalytic site for macrophage migration inhibitory factor // EMBO J. - 1998. - Vol.17, No.13. - P.3534-3541.
34. Swope M.D., Sun FI. — W., Klockow B., Blake P., Lolis E. Macrophage migration inhibitory factor interactions with glutathione and S-glutathione //J. Biol. Chem. - 1998. - Vol.273, No.24. - P.14877-14884.
35. Takata I., Chida K., Gordon M.R., Myrvik Q.N., Ricardo M.J. Jr., Kucera L.S. L-fucose, D-mannose, L-galactose, and their BSA conjugates stimulate macrophage migration //J. Leukoc. Biol. — 1987. — Vol.41, No.3. — P.248-256.
36. Watarai H., Nozawa R., Tokunaga A., YuyamaN., Tomas M., Hinohara A., Ishizaka K., Ishii Y.
Posttranslation modification of the glycosylation inhibiting factor (GIF) gene product generates bioactive GIF// PNAS - 2000. - Vol.97, No.24. - P. 13251 -13256.
37. Weiser W.Y., Greineder D.K., Remold H.G., David J.R. Studies on human migration inhibitory factor: characterization of three molecular species //J. Immunol. - 1981. - Vol.126, No.5. - P.1958-1962.
38. Tierovnik E., Janjic V., Francky A., Mozetic-Francky B. Equilibrium and transient intermediates in folding of human macrophage migration inhibitory factor // Eur. J. Biochem. - 1999. - Vol.260. - P.609-618.
39. Иммунохимический анализ / Под ред. Л.А. Зильбера. - М.: Медицина, 1968.
40. Л .А. Остерман. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - М.: Наука, 1983.
41. Практическая химия белка / Под ред. А. Дар-бре.-М.: Мир, 1989.-С.17.
42. А.П. Суслов, В.П. Головин, В.Т. Скворцов, Т.А Коронцвит. Скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) из микрокультур in vitro. Иммунология -1989. - No. 2. - с. 73-76.
