CC BY
87
Экспериментальная медицина
УДК 576.57.043:537.5
СТРУКТУРНЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИЗЛУЧЕНИЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЫ
С.В. Трофимова, И.П. Иванова, М.Л. Бугрова,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Иванова Ирина Павловна - e-mail: [email protected]
Цель исследования: оценка структурных и биохимических изменений в прокариотических клетках под действием излучения низкотемпературной плазмы. Эксперимент проведен на бактериальные штаммах антибиотикорезистентных грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus 5913 и грамотрицательных микроорганизмов Escherichia coli 775-3. Опытные группы облучались в течение 5-600 секунд с помошью экспериментального устройства «ПИЛИМИН» серии ИР-10. Биоиидный эффект излучения плазмы оценивали по количеству колониеобразуюших единиц, морфологические изменения в клетках - с использованием электронной микроскопии. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по относительной концентрации диеновых коныюгатов, триеновых коныюгатов и оснований Шиффа, определяли уровень обших липидов. Окислительную модификацию белков оценивали по флуоресценции битирозина, гликозилированных белков и триптофана. Концентрацию обшего белка определяли биуретовым методом. Показано, что излучение плазмы искрового разряда обладает бактерицидным действием и обработка в течение 60 секунд приводит к 100%-му ингибированию роста как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Выявлено, что под действием излучения плазмы происходит набухание клеток, наблюдается отслоение клеточной стенки, происходит деградация нуклеоида. Наблюдается снижение относительной концентрации молекулярных продуктов ПОЛ в суспензиях обоих штаммов бактериальных клеток. Основными механизмами цитотоксического действия излучения плазмы является деградация клеточной стенки и ДНК.
Ключевые слова: антибиотикорезистентные микроорганизмы, излучения низкотемпературной
плазмы, перекисное окисление липидов.
The purpose of the investigation was to assess structural and biochemical changes in prokaryotic cells under exposure to low-temperature plasma radiation. Experiment was carried out on bacterial strains of antibiotic-resistant gram-positive microorganisms Staphylococcus aureus 5913 and gram-negative microorganisms Escherichia coli 775-3. Experimental groups were radiated within 5-600 seconds with the aid of experimental device «PILIMIN» series IR-10. The biocidal effect of plasma radiation was assessed as per the number of colony-forming units and morphological changes were determined by using electronic microscopy. Lipide peroxidation (LPO) was assed as per relative concentration of diene conjugates, triene conjugates and Schiff's bases, total lipides contents were studied. Protein oxidative modification was assessed as per bitirozin fluorescence, glycated proteins and tryptophan. The total protein concentration was determined by biuretal method. It was shown that the spark discharge plasma radiation had a bactericidal effect and the treatment within 60 seconds resulted in 100% inhibition of the growth of both gram-positive and gram-negative microorganisms. It was revealed that under the exposure to plasma radiation the cell swelling occurred, cell wall disruption was observed, the nucleoid degradation occurred. The reduction of relative concentration of LPO molecular products was observed in suspensions of the both strains of bacterial cells. The main mechanisms of cytotoxic effect of plasma radiation were the degradation of cell wall and DNA.
Key words: antibiotic-resistant microorganisms, low-temperature plasma radiation, lipide peroxidation
Введение
Вопрос о применении газоразрядной холодной плазмы в биологии и медицине обсуждается около 20 лет, с тех пор как ученым стали доступны устройства, генерирующие плазму в условиях лаборатории. К настоящему моменту установлены бактерицидный и цитотоксический эффекты низкотемпературной плазмы [1], однако механизмы действия до конца не изучены. В связи с этим целью исследования явилась оценка структурных и биохимических изменений в прокариотических клетках под действием излучения низкотемпературной плазмы.
Материалы и методы
Эксперимент проведен на бактериальных штаммах антибиотико-резистентных грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus 5913 и грамотрицательных микроорганизмов Escherichia coli 775-3. Бактериальные
штаммы получены из музея кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА. Для анализов предварительно готовили суточную культуру микроорганизмов. Затем бактериальные клетки ресуспендировали в растворе Хенкса до концентрации 10-15Х106 клеток в 1 мл. Контрольная группа не подвергалась воздействию, опытные группы облучались в течение 5-600 секунд. Формирование импульсного искрового разряда, генерирующего излучение низкотемпературной плазмы, осуществляли с помощью экспериментального устройства «ПИЛИМИН» серии ИР-10. Устройство разработано в НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ имени М.В. Ломоносова в 2011 году. Характеристики используемого разряда: емкость импульсного конденсатора С=3,3 нФ, балластное сопротивление R=10 МОм, напряжение источника питания иип=11 кВ, частота повторения импульсов - 10 Гц. Биоцидный эффект
Экспериментальная медицина
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
излучения плазмы оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ). Морфологические изменения в клетках под действием плазмы оценивали с использованием электронной микроскопии [2]. Интенсивность перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по относительной концентрации диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ) [3-5]. Уровень общих липидов определяли с помощью набора TOTAL LIPIDS BIO-LACHEMA-TEST (PLIVA-Lachema Diagnostica, Чехия) спектрофотометрически, при длине волны 540 нм. Уровень диеновых и триеновых конъюгатов, оснований Шиффа относили к количеству липидов и выражали в относительных единицах. Окислительную модификацию белков оценивали по флуоресценции битирозина (Хвозб. 325 нм, Хисп. 416 нм), гликозилированных белков (Хвозб 370 нм, Хисп. 445 нм) и триптофана (Хвозб 297 нм, Хисп. 336 нм) [6-7]. Концентрацию общего белка определяли биуретовым методом с помощью набора TOTAL PROTEIN «FL-Е» (VITAL DIAGNOSTICS, Санкт-Петербург). Уровень триптофана, битирозина и гликозилированных белков относили к количеству общего белка и выражали в относительных единицах. Электронно-микроскопический анализ проводился на электронном микроскопе Morgagni 268D (ф. FEI, Eindhoven, Netherlands). Все спектрофотометрические и флуорометрические измерения проводились на на спектрофлюориметре «Флюорат-02 Панорама» (ф. Люмэкс, Санкт-Петербург, Россия).
Результаты исследования
Показано, что излучение плазмы искрового разряда обладает бактерицидным действием и обработка в течение 60 секунд приводит к 100%-му ингибированию роста как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. При электронно-микроскопическом анализе выявлено, что под действием излучения плазмы происходит набухание клеток, наблюдается отслоение клеточной стенки, происходит деградация нуклеоида. Наблюдается снижение относительной концентрации молекулярных продуктов ПОЛ в суспензиях обоих штаммов бактериальных клеток. При обработке грамположительных бактерий уровень гликозилированных белков возрастал к 60 секундам обработки, уровень флуоресценции триптофана снижался при воздействии в течение 15-30 секунд. Для грамо-трицательных бактерий изменений уровня флуоресценции битирозина показано не было, уровень флуоресценции триптофана при воздействии в течение 15-30 секунд повышался, а уровень флуоресценции гликозилированных белков при тех же временных режимах снижался.
Обсуждение и выводы
Низкотемпературная плазма генерирует большое количество физических и химических активных факторов,
которые при взаимодействии с бактериальной клеткой способны вызывать ее окислительные повреждения и, как следствие, гибель [8]. Клеточная стенка грампозитивных бактерий на 90% состоит из пептидогликана, пронизанного тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами, грамнега-тивных - на 10-20% состоит из пептидогликана, фосфолипидов, липополисахаридов и белков [9]. Вероятно, действию факторов плазмы в первую очередь будет подвергаться клеточная стенка бактерий. Набухание клеток, выявленное при электронно-микроскопическом анализе, вероятнее всего связано с нарушением водно-солевого баланса в клетках под действием плазмы. Из полученных результатов видно, что грамположительные бактерии реагируют на воздействие излучением плазмы более резким снижением интенсивности ПОЛ, чем грамотрица-тельные бактерии, а наиболее выраженную окислительную модификацию претерпевают белки грамположительных бактерий. Можно предположить, что поддержание интенсивности процессов ПОЛ на уровне, необходимом для нормального функционирования клетки у грамотри-цательных бактерий, осуществляется за счет липида А, входящего в состав липополисахарида клеточной стенки и служащего субстратом для окисления. Более интенсивное протекание процессов окисления белков грамположи-тельных бактерий обусловлено пептидогликаном, являющимся основным компонентом клеточной стенки.
Таким образом, основным механизмом цитотоксическо-го действия излучения плазмы является деградация клеточной стенки и ДНК. ДЦ
ЛИТЕРАТУРА
1. Fridman G. Medical applications of Floating Electrode Dielectric Barrier Discharge (FE-DBD). First International Conference on Plasma Medicine (ICPM-1), Corpus Christi, Texas. 2007. Р. 27-32.
2. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. Руководство. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996. 556 с.
3. Folch J., Lees M., Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 1957. № 2. Р. 497-509.
4. Shenstone F.S. Ultraviolet and visible spectroscopy of lipids. N.-Y. 1971. Р. 77-93.
5. Fletcher D.L., Dillared C.J., Tappel A.Y. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues. Analyt. Biochem. 1973. № 52. Р. 497-499.
6. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects. J. Biol. Chem. 1987. № 20. Р. 9895-9901.
7. Munch G., Keis, R., Wessels, A. et al. Determination of advanced glycation end products in serum fluorescence spectroscopy and competitive. ELISA. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1997. № 35. Р. 669-677.
8. Joshi S.G., Cooper M., Yost A. et al. Nonthermal Dielectric-Barrier Discharge Plasma-Induced Inactivation Involves Oxidative DNA Damage and Membrane Lipid Peroxidation in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 2011. № 3. Р. 1053-1062.
9. Медицинская микробиология: учебное пособие /под ред.
В.И. Покровского. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 768 с.
