CC BY
210
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕДИЦИНЫ
Д.В. Залетаев12, В.В. Стрельников1, М.В. Немцова2, О.В. Бабенко1, Е.Б. Кузнецова12, В.В. Землякова12, Т.В. Кекеева2, Д.С. Михайленко1, А.С. Танас1, В.В. Руденко1, А.Ю. Бабаян1, Е.А. Алексеева1, О.А. Симонова1
1 Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Российская Федерация 2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Российская Федерация
Структурно-функциональный анализ опухолевых геномов и разработка тест-систем для ранней диагностики, прогноза течения и оптимизации терапии злокачественных
Рассматриваются результаты структурно-функционального анализа молекулярно-генетических нарушений при различных злокачественных опухолях. Исследования позволили обнаружить более 20 новых маркеров для спорадического рака молочной железы, из которых сформированы тест-системы, позволяющие проводить диагностику со специфичностью 100%. Образование химерного гена TMPRSS2/
ERG4 является частым опухоль-специфическим событием, его экспрессия коррелирует с более агрессивными формами рака предстательной 7
железы, может служить молекулярным маркером андрогенчувствительности опухолевых клеток и оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Разработаны эффективные системы для ранней диагностики рака шейки матки и эндометрия. Мутации гена VHL, делеции хромосомы 3 и метилирование ряда генов позволяют прогнозировать течение и подбор эффективной терапии светлоклеточного рака почки.
Для ранней диагностики, прогноза течения и рецидивирования рака мочевого пузыря определен целый ряд молекулярных маркеров. Для диагностики, прогноза и лечения опухолей мозга разработана эффективная комплексная система маркеров. Протокол молекулярно-генетического исследования позволяет обнаружить причину заболевания более чем у 90% пациентов с ретинобластомой. Для исследования аномального метилирования в опухолевых геномах разработана инновационная технология AFLOAT, позволяющая эффективно выявлять новые маркеры, имеющие диагностическое значение. Тест-системы молекулярно-генетических и эпигенетических маркеров для ранней диагностики, прогноза течения и оптимизации терапии злокачественных новообразований показали свою эффективность, получили разрешение на использование в клинической практике и в настоящее время активно внедряются в практическое здравоохранение.
Ключевые слова: злокачественные новообразования, молекулярно-генетические маркеры, аномальное метилирование, ДНК-диагностика, тест-системы.
(Вестник РАМН. 2013; 9: 7-14)
#
D.V. Zaletaev12, V.V. Strelnikov1, M.V. Nemtsova2, O.V. Babenko1, E.B. Kuznetsova12, V.V. Zemlyakova12, T.V. Kekeeva2, D.S. Mikhaylenko1, A.S. Tanas1, V.V. Rudenko1, A.Yu. Babayan1, E.A. Alekseeva1,
O.A. Simonova1
1 Research Centre for Medical Genetics of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation 2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Russian Federation
Structural and Functional Analysis of Tumor Genomes and the Development of Test Systems for Early Diagnosis, Prognosis
and Cancer Therapy Optimization
The article discusses results of the structural and functional analysis of molecular genetic abnormalities in various malignant tumors. Investigations have discovered more than 20 new markers for sporadic breast cancer. Several of them formed the test system, allowing the diagnosis with a specificity of 100%. Appearance of TMPRSS2/ERG4 chimeric gene is a frequent tumor-specific event, its expression is correlated with more aggressive forms ofprostate cancer, may serve as a molecular marker for tumor cells and androgen assessment of tumor response to hormonal therapy. The effective systems for the early diagnosis of cervix and endometrium cancer were developed as well. Mutations in the VHL, deletions of chromosome 3 and methylation of several genes can predict the course and selection of effective therapy of clear cell kidney cancer. a number of molecular markers were identified for early diagnosis and prognosis of recurrence of bladder cancer. For diagnosis, prognosis and treatment of brain tumors we developed an effective complex system of markers. Protocol of molecular genetics investigation reveals the cause of the disease by more than 90% of patients with retinoblastoma. In order to study abnormal methylation in tumor genomes an innovative technology AFLOAT has been developed that allows to efficiently identify new markers with diagnostic value. Test systems of molecular genetic and epigenetic markers for early diagnosis and prognosis as well as for cancer therapy optimization have shown to be effective, have been approved for use in clinical practice and are being introduced into practical healthcare.
Key words: malignant tumors, molecular genetic markers, abnormal methylation, DNA diagnostics, test-systems.
(Vestnik Rossiiskoi Akademii Meditsinskikh Nauk — Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2013; 9: 7—14)
#
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 9
Введение
Злокачественные новообразования устойчиво занимают 2-е место среди причин смертности населения Российской Федерации. Их удельный вес в общей структуре смертности составляет около 14%. Смертность населения от онкологических заболеваний в России в 2011 г. составила 204,6 на 100 тыс. населения. Более 40% впервые регистрируемых онкологических больных имеют уже III—IV стадию заболевания, что обусловливает высокий показатель одногодичной летальности (27,4%) [1]. В связи с этим исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака является одной из наиболее актуальных задач молекулярной медицины.
Поскольку частота онкопатологии постоянно повышается, а возраст манифестации заболевания уменьшается, большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска. К структурным или генетическим маркерам относят все нарушения, которые изменяют структуру ДНК. В первую очередь, это крупные аномалии, такие как делеции целых хромосомных районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста, и дупликации или амплификации районов, содержащих клеточные протоонкогены, факторы роста 8 и др. К структурным перестройкам относят трансло-
кации и инверсии хромосомного материала, в результате которых могут образовываться химерные гены, имеющие онкогенные функции. К структурным аномалиям относят и различные типы мутаций, которые могут активировать протоонкогены или инактивировать гены-супрессоры.
К функциональным маркерам принадлежат все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям в уровне экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза. Профиль экспрессии генов в опухоли кардинально изменен по сравнению с нормальной тканью, поэтому определенные сочетания генов, теряющих свою экспрессию или, наоборот, гиперэкспрессирующихся в определенном типе опухоли, могут являться диагностическими и прогностическими маркерами. Изменения в экспрессии гена без изменения его нуклеотидной структуры относят к эпигенетической регуляции. Примером служит метилирование регуляторных районов генов, участвующих в апоптозе, ангиогенезе, дифференцировке, репарации ДНК, метастазировании, передаче сигнала, детоксикации, лекарственной резистентности и др. Аномальное метилирование CpG-островков в промоторных районах генов приводит к их инактивации. Таким образом, при отсутствии каких-либо структурных изменений нуклеотидной последовательности гена он теряет свою активность. Определение аномального метилирования генов, отвечающих за общие и частные пути регуляции жизнедеятельности злокачественной клетки, может показать, как далеко зашел опухолевый процесс, насколько интенсивно идет рост опухоли и процесс метастазирования. Идентификация генов, демонстрирующих высокую частоту метилирования в определенном типе опухоли, — это необходимый шаг в ее характеристике: специфические дополнительные регуляторные механизмы нарушаются именно в опухоли определенного типа и позволяют использовать профиль метилирования в сочетании с другими молекулярно-генетическими данными в качестве маркера. Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживают задолго до появления клинических симптомов, позволяет
вовремя провести более тщательную диагностику и превентивную терапию. Современные методы молекулярной биологии дают возможность эффективно выполнять комплексный анализ определенного типа опухоли и ДНК-диагностику для конкретного пациента. Системы молекулярных маркеров позволяют определить начальные стадии, прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать таргетные терапевтические средства. Практической реализацией фундаментальных исследований стала разработка диагностических и лечебных протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях.
Инновационные методы поиска дифференциального (аномального) метилирования в опухолевых геномах
Для скрининга дифференциального метилирования ДНК в научных и диагностических приложениях разработана технология анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique, AFLOAT), — пример сочетания современных методов молекулярно-биологического и математического анализа с возможностями биоинформатики. Для формирования пула анализируемых фрагментов ДНК применен метод амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Однако в отличие от АИМС, использующего радиоавтографию для визуализации дифференциально метилированных фрагментов, мы применили разделение флуоресцентно меченых продуктов амплификации капиллярным электрофорезом. Таким образом, результаты АИМС фактически переходят в плоскость цифровой информации, доступной для компьютерного анализа без предварительной оцифровки сигнала. Для предсказания всех возможных продуктов АИМС разработана компьютерная программа «AIMS in silico», позволяющая осуществлять обоснованный дизайн экспериментов с учетом целей исследований и доступности оборудования и анализировать результаты с учетом геномной локализации дифференциально метилированных фрагментов ДНК [2].
Анализ продуктов AFLOAT на электрофореграммах осуществляется относительно двух референсных систем. Первая представляет собой стандартный набор фрагментов определенной массы ДНК-маркера, традиционно используемый при фрагментном анализе ДНК капиллярным электрофорезом. Второй референс выражается полным набором всех продуктов амплификации, получаемых с геномной ДНК (полная репрезентация). Первая референсная система обеспечивает позиционирование продуктов реакции по длинам в нуклеотидах, вторая дает возможность соотнести аномально метилированные фрагменты ДНК, обнаруженные в анализируемом образце, с конкретными, заранее определенными локусами генома.
На сегодняшний день адаптер-опосредованная ПЦР, в частности в формате AFLOAT, представляет собой оптимальный подход к многолокусному метилчувстви-тельному анализу ДНК, полностью лишенный проблем, связанных с перекрестной гибридизацией обогащенных цитозином и гуанином участков ДНК со сниженной информативностью нуклеотидных последовательностей. Это эффективная и малозатратная технология поиска новых маркеров метилирования [2—4].
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕДИЦИНЫ
Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики и прогноза спорадического рака молочной железы
Первое место в структуре смертности от онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (РМЖ). Он характеризуется крайне разнообразным клиническим течением: от агрессивного до вялотекущего с поздним и редким метастазированием. Выраженная гетерогенность на клиническом, гистопатологическом и молекулярном уровнях обусловила наличие многочисленных маркеров заболевания, которые не всегда обеспечивают достаточный уровень эффективности диагностики. Это объясняет необходимость разработки более современных мультигенных панелей маркеров, в т.ч. и панелей маркеров метилирования. Использование оптимизированого метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов в исследованиях РМЖ привело к выявлению ряда новых маркеров. В частности, нами впервые установлена эпигенетическая инактивация гена калиевого канала семейства Eag 1 (KCNH2) [5] и охарактеризован определенный район CpG-островка гена BIN, подвергающийся метилированию в опухоли [6]. Дифференциальное метилирование при РМЖ впервые показано для 15 генов и четырех межгенных областей на хромосомах 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1. Впервые продемонстрированы ассоциации метилирования CpG-островков генов SH3KBP1, PHF15, GPC2 и LAMB1 с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ (степенью злокачественности, размером и иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов). Определено число маркеров метилирования, необходимое и достаточное с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала. В частности, в системе из 7 маркеров для постановки диагноза «Рак молочной железы» достаточно обнаружения 4 маркеров в метилированном состоянии; наличие 1—3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы не выявляется метилирования ни одного из маркеров системы. Указанные параметры позволяют проводить диагностику со специфичностью 100% [7].
Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики, прогноза и лечения рака предстательной железы
В структуре онкологических заболеваний рак предстательной железы (РПЖ) занимает 2—3-е место после рака легких и желудка. Вместе с тем смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает 3-е место у мужчин после рака легкого и рака толстой кишки. Именно поэтому актуален вопрос раннего обнаружения молекулярных маркеров опухоли, отражающих ее прогрессию, способность к метастазированию и возможности эффективного лечения.
Гомо- и гетерозиготные делеции являются одними их самых частых генетических нарушений при РПЖ, и для их детекции может быть использован микросателлитный анализ потери гетерозиготности (ПГ) и микросателлит-ной нестабильности (МН). Идентификация ПГ/МН эффективна для диагностики и прогноза РПЖ. Нами разработана система молекулярных маркеров для определения ПГ и МН хромосомных районов 13q14 и 16q23 в биопсийных образцах больных с заболеваниями предстательной железы с целью обнаружения пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза гистологически подтвержденного РПЖ. Определены статистически до-
стоверные корреляции аллельных делеций локуса 16q23 в опухолевом эпителии со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы. При исследовании ПГ/МН локуса 13q14 обнаружены достоверные корреляции с более ранними стадиями РПЖ [8, 9].
Особенностью канцерогенеза РПЖ является образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS. Исследования последних лет привели к открытию химерных генов при РПЖ, образованных слиянием 5’-нетраслируемой области гена TMPRSS2 и генов семейства транскрипционных факторов ETS, таких как ERG4, ETV1 и ETV4. Про-статспецифические промоторные элементы химерных онкогенов TMPRSS2/ETS обеспечивают их высокую стойкую экспрессию, запуская процессы пролиферации и трансформации клеток в предстательной железе.
Наши исследования показали, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым опухольспецифическим событием, экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными формами заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ, андрогенчувствительности опухолевых клеток и маркером оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Преимущество данного маркера состоит в возможности работать с образцами опухоли без вы- 9
полнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ. Предложен способ определения экспрессии химерного онкогена TMPRSS2/ERG4 и других методом ОТ-ПЦР [8, 10].
У пациентов с РПЖ обнаружен высокий процент метилирования малигнизированного эпителия. Высокие частоты метилирования установлены для аденокарциномы: Р16 - 50%, GSTP1 - 93%, N33 - 27%. В железах простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени у пациентов с РПЖ частота метилирования изученных генов близка к таковым в железах аденокарциномы: Р16 - 53%; GSTP1 - 73%; N33 - 27%. Молекулярно-генетические изменения при простатической интраэпителиальной неоплазии соответствуют таковым при раннем инвазивном раке, хотя и менее выражены.
Для исследования возможности неинвазивной диагностики проведен анализ метилирования генов Р16,
N33 и GSTP в 112 образцах плазмы крови пациентов с РПЖ и пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, чтобы оценить диагностический потенциал выбранных эпигенетических маркеров.
Образцы крови получены от пациентов с РПЖ до выполнения простатэктомии. Метилирования гена GSTP1 у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы не обнаружено, в то же время для пациентов с аденокарциномой частота метилирования GSTP1 в плазме составила 28%. В плазме пациентов с предраковыми состояниями метилирование Р16 не установлено, тогда как частота его метилирования в плазме пациентов с аденокарциномой составила 19%.
Частота метилирования N33 =30%.
Эффективность любого биологического маркера определяется параметрами чувствительности и специфичности. Эти критерии очень важны при оценке диагностической значимости маркеров для популяционного скрининга данного заболевания или для клинического наблюдения группы повышенного риска. Система молекулярных маркеров, состоящая из 3 генов, обладает 75% чувствительностью и 100% специфичностью. При обнаружении аномального метилирования хотя бы 2 генов делают вывод о наличии заболевания [11].
#
#
10
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 9
Разработка системы ДНК-маркеров для ранней диагностики рака шейки матки и эндометрия
Рак шейки матки (РШМ) — одна из наиболее распространенных форм онкологической патологии у женщин, занимающая 3-е место после рака молочной железы и яичников. Развитию РШМ предшествуют предраковые изменения, которые включают цервикальную интраэпителиальную неоплазию (CIN) I, II и III степени (тяжелая дисплазия и карцинома in situ), поэтому в диагностических и прогностических целях необходимо использовать системы молекулярных маркеров, которые позволяют определить вероятность перерождения дисплазии шейки матки в злокачественную опухоль.
Высокая частота гиперметилирования определена для генов Р16, MLH1, HIC1 и N33 при CIN II—III степени. В образцах ткани шейки матки, смежной с дисплазией, но морфологически не отличающейся от нормы, установлена частота метилирования, близкая к частоте дис-пластических образцов. Высокий уровень метилирования в морфологически не измененной ткани указывает на то, что молекулярные методы являются более строгим контролем наличия или отсутствия злокачественных изменений в тканях, чем цитологические.
Для оценки диагностической значимости маркеров метилирования (Р16, MLH1 и N33) были рассчитаны их чувствительность и специфичность. Наибольшая чувствительность определена для гена Р16 (54%), а наибольшая специфичность — для гена N33 (100%). Аномальное метилирование N33 выявлено только в образцах CIN II—III степени. Система маркеров из 3 генов обладает 85% чувствительностью и специфичностью [12, 13]. Расширение панели маркеров позволило установить, что частота аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста (MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33 и CDH1) возрастает в ряду: доброкачественные процессы шейки матки ^CIN I ^CIN II ^ CIN III ^карцинома in situ [14]. При этом частота аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста (RASSF1, MLH1, Р16, RAR-b, GSTP1, CDX1) при исследовании патологических процессов в эндометрии возрастает в ряду: хронический эндометрит ^простая гиперплазия эндометрия без атипии ^комплексная гиперплазия эндометрия без атипии ^полип эндометрия ^комплексная гиперплазия эндометрии с атипией ^рак эндометрия [15]. Указанные системы маркеров метилирования могут быть эффективно использованы в качестве дополнительного инструмента в предиктивной диагностике злокачественных новообразований женской репродуктивной системы.
почки (СРП) сопряжено с множественными генетическими нарушениями, наиболее характерное из которых — потеря гетерозиготности в областях локализации генов-супрессоров VHL, RASSF1 и FHIT на коротком плече хромосомы 3. Способность опухоли к метастазированию во многом определяется отсутствием контактного торможения, что обусловлено инактивацией гена Е-кадгерина (CDH1). В 60% инактивация CDH1 происходит вследствие аномального метилирования промоторного района гена. Нами показано, что множественные аллельные делеции генов на коротком плече хромосомы 3, вовлекающие 2 и более указанных генов-супрессоров, и метилирование промотора CDH1 ассоциированы с прогрессией первичной опухоли и ее способностью к метастазированию. Наряду с другими тестами исследование необходимо при назначении адъювантной иммунотерапии после органосохраняющих операций при локализованном и местнораспространенном СРП [16, 17].
В последние годы при лечении метастатического рака почки применяют таргетные препараты, представляющие собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста. Наиболее универсальным в классе таргет-ных препаратов является сорафениб, который обладает активностью мультикиназного ингибитора. Ключевые мишени сорафениба (VEGFR 1-го и 2-го типа, PDGFR) гиперэкспрессируются в ответ на инактивацию гена VHL. Белковый продукт гена VHL необходим для сборки убиквитин-лигазного комплекса, в котором осуществляется деградация гипоксией индуцируемого фактора а (HIF-1a). Инактивация VHL приводит к накоплению в клетке HIF-1a. Избыточное количество HIF-1a активирует транскрипцию генов-мишеней (VEGF, PDGFи их рецепторов, TNFа и другие), многие из которых участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации. Инактивация гена VHL встречается только при СРП, на долю которого приходится около 80% случаев рака почки. Нами показано, что биаллельные молекулярногенетические нарушения VHL, приводящие к его инактивации, встречаются в 70% светлоклеточных карцином; чаще всего это комбинации мутации или метилирования с протяженной аллельной делецией (потерей гетерози-готности). Причем мутации и метилирование являются специфическими признаками инактивации гена в СРП. Показано, что более выраженный эффект применения сорафениба достигается у пациентов с мутациями VHL в первичной опухоли по сравнению с больными без мутаций. Таким образом, для пациентов с СРП, у которых имеются мутации и/или метилирование VHL, терапия со-рафенибом представляется оптимальной [16, 18].
#
Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики, прогноза и лечения светлоклеточного рака почки
Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс. новых случаев рака почки и 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии. Несмотря на то, что у 75% больных рак почки выявляют на стадии локализованного опухолевого процесса, в 20% случаев заболевание характеризуется как местно распространенное, и почти у 1/2 пациентов после хирургического лечения впоследствии развиваются метастазы. В связи с этим актуальным является вопрос диагностики молекулярных маркеров первичной опухоли, отражающих ее прогрессию, способность к метастазированию и возможностей эффективного лечения. Развитие светлоклеточного рака
Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики, прогноза и лечения рака мочевого пузыря
Рак мочевого пузыря (РМП) составляет 70% всех опухолей мочевого тракта и 4% случаев всех онкологических заболеваний. Ежегодно в России регистрируют до 13 тыс. новых случаев РМП. На момент установления диагноза у 80% больных имеет место поверхностный рак мочевого пузыря (ПРМП), т.е. рак с инвазией не глубже подслизистого слоя (по классификации опухолей: рТа, рТ1, рТ;8), остальные 20% приходятся на инвазивный рак мочевого пузыря (ИРМП), который имеет различную глубину поражения мышечных слоев стенки мочевого пузыря и прилежащих органов (Т2—Т4). По сравнению с ПРМП ИРМП характеризуется более агрессивным течением и высокой смертностью. Стандартная лечебная
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕДИЦИНЫ
тактика при ПРМП заключается в трансуретральной резекции опухоли и внутрипузырной химио- и иммунопрофилактике. Однако до 85% ПРМП рецидивируют после лечения, причем в 30% развиваются в инвазивные и диссеминированные формы рака, снижается степень дифференцировки опухолевых клеток. Прогнозирование клинического течения ПРМП и его трансформации в инвазивные формы — важная задача клинической и молекулярной онкологии.
С целью определения адекватной тактики лечения ПРМП Европейским обществом по изучению и лечению рака (EORTC) была разработана система балльной оценки рисков рецидивирования и прогрессирования. Однако разделение опухолей по морфологическим характеристикам не полностью отражает клинический потенциал ПРМП, поэтому в последние годы большое внимание уделяют поиску дополнительных факторов прогноза течения заболевания. Выявление молекулярно-генетических изменений и использование их в качестве маркеров, определяющих характер и прогноз заболевания, является оптимальным [19].
Проведено комплексное исследование широкого спектра молекулярно-генетических повреждений на материале от 163 пациентов с установленным диагнозом РМП. В результате определена группа молекулярно-генетических изменений, коррелирующих с фенотипом опухоли и, следовательно, являющихся маркерами течения злокачественного процесса. В частности, делеция локуса 9р21 в клетках первичной уротелиальной карциномы служит маркером высокого рецидивного потенциала со специфичностью 94% и чувствительностью 38%, диагностическая эффективность составляет 0,66. Выявление делеции локусов 17р13 и 9q34 и метилирования гена Р16 у пациентов с ПРМП свидетельствует о высоком инвазивном потенциале опухоли и является маркером крайне неблагоприятного течения заболевания. Объединение этих нарушений в систему позволяет повысить специфичность, чувствительность и диагностическую эффективность системы в целом: специфичность системы маркеров составляет 72%, чувствительность — 71%, диагностическая эффективность — 0,72. Делеции локуса 3р14 и метилирование гена P16 достоверно чаще встречаются в группе опухолей с низкой степенью дифференцировки. В результате специфичность такой системы маркеров составляет 85%, чувствительность — 58%, диагностическая эффективность — 0,72. Мутации в гене FGFR3 являются прогностическим признаком, ассоциированным с более благоприятным течением заболевания. Специфичность маркера составляет 89%, чувствительность — 38%, диагностическая эффективность — 0,64.
При анализе метилирования генов RASSF1A, Р16, Р14, RARp2 и CDH1 установлена статистически достоверно повышенная частота аномального метилирования гена Р16 в ИРМП по сравнению с ПРМП. При оценке частоты метилирования в целом показано, что частота эпигенетических событий в группе ИРМП значительно выше по сравнению с ПРМП. Предложенные ДНК-маркеры могут использоваться в дополнение к применяемым диагностическим методам (гистологическому и биохимическому) [20].
Применение системы молекулярно-генетических маркеров в клинической практике позволит выделить опухоли с различным клиническим течением, отличать опухоли с высоким риском рецидивирования и прогрессирования от менее агрессивных новообразований, персонифицировать прогноз заболевания и применять дифференцированный лечебный подход.
Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики, прогноза и лечения злокачественных опухолей мозга
Частота возникновения глиом, наиболее распространенных первичных опухолей головного мозга, составляет 7—12 случаев на 100 тыс. населения. Согласно классификации экспертов Всемирной организации здравоохранения, выделяют 3 главных гистологических типа опухолей — астроцитомы, олигодендроглиомы и смешанные олигоастроцитомы, каждый из которых имеет свою характерную гистологическую картину. Частота встречаемости каждого из 3 подтипов глиом низкой степени злокачественности точно не известна. За последнее время частота олигодендроглиом постепенно возросла от традиционных 5 до 25—30% среди всех глиальных опухолей и, соответственно, снизилась для астроцитом. Это изменение показывает, что некоторые опухоли, классифицируемые ранее как астроцитомы, сейчас рассматриваются как олигодендроглиомы или смешанные олигоастроцитомы [21]. Современная морфологическая классификация глиом остается неудовлетворительной. Во-первых, анализ био-птата не всегда достоверен из-за гетерогенности опухоли по своему составу, что может привести к диагностически ошибочной пробе и неправильному определению ее типа. Во-вторых, воспроизводимость данных во время и между наблюдениями для дифференцирования астроци-тарных и олигодендроглиальных опухолей или выявления анапластических астроцитом часто неудовлетворительна. Перспектива повышения воспроизводимости лежит в определении облигатных маркеров астроцитарных и олигодендроглиальных линий. В-третьих, опухоли, обладая общими морфологическими чертами, могут отличаться друг от друга на генетическом уровне и иметь различное течение, несмотря на сходство традиционных прогностических факторов. Таким образом, улучшается понимание того, что проведение молекулярно-генетического анализа вскоре станет так же важно, как и определение морфологических критериев, что повысит качество классификации глиом. В связи с этим важным достижением стала генетическая классификация анапластических олигодендроглиом, которые могут быть разделены на подгруппы, значительно отличающиеся друг от друга частотой возникновения, длительностью ответа на химиотерапию, продолжительностью жизни больных, и при этом иметь общую морфологию. В самой благополучной группе (50%) с утратой аллелей 1р и 19q ответ на химиотерапию прокарбазином, ломустином и винкристином приближается к 100% с продолжительностью жизни от постановки диагноза более 10 лет. Такие положительные результаты ставят вопрос об отсроченном проведении лучевой терапии, что позволило бы избежать или задержать развитие побочных эффектов. В группе с наихудшим прогнозом (25%) генетический профиль схож с таковым первичной глиобластомы (амплификация EGFR, делеции 10q и 9p21, мутации PTEN без утраты хромосомы 1р или с мутацией гена ТР53), хотя опухоли соответствуют гистологическим критериям анапластических олигодендроглиом. Такой генетический статус ассоциируется с плохим прогнозом, ответом на химиотерапию в 18% случаев и средней продолжительностью жизни 16 мес. Эта группа, возможно, принадлежит той же категории, что и глиобластомы с олигодендроглиальным компонентом, и требует немедленного проведения лучевой терапии. Таким образом, анапластические олигодендроглиомы — это неоднородная группа опухолей, и их лечение должно проводиться с учетом генетического профиля. Нами разработана панель маркеров для диа-
#
11
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 9
гностики делеций 1p/19q методом анализа потери гете-розиготности микросателлитных маркеров, включающая в себя полиморфные локусы D1S1635, D1S3669, D1S407, D19S562, D19S400 и D19S559 [22].
В настоящее время проводятся исследования по идентификации прогностических маркеров благоприятного ответа опухоли на терапию темозоломидом. Пациенты с глиобластомами, у которых опухолевые клетки имеют метилированный промотор MGMT, лучше отвечают на терапию темозоломидом. По данным литературы, пациенты с мультиформной глиобластомой, получавшие лечение темозоламидом на фоне лучевой терапии, при наличии метилированного промотора MGMT имели общую выживаемость 21,7 мес, а при его отсутствии — 15,3 мес. Ген MGMT, расположенный на хромосоме 10q26.3, кодирует белок репарации ДНК, удаляющий алкильные (метильные) группы из позиции О6 гуанина. Метилирование гуанина в позиции О6 приводит к мутациям типа транзиций, формированию одно- и двунитевых разрывов ДНК и, в конечном счете, к выходу клетки в апоптоз. Репарационная активность каждой молекулы белка MGMT приводит к ее полной инактивации; после акта переноса метильной группы инактивированная молекула MGMT подлежит утилизации в клетке.
Активность MGMT в клетках злокачественных ново-12 образований в значительной степени определяет эффективность лечения алкилирующими агентами: высокая активность MGMT формирует резистентный фенотип опухоли. Метилирование промотора MGMT приводит к инактивации этого гена и повышению чувствительности опухоли к алкилирующим препаратам. Альтернативным механизмом инактивации гена MGMT может служить делеция содержащего его локуса 10q26.3, определяемая как потеря гетерозиготности расположенных в этой области микросателлитных маркеров. Поскольку анализ аллельного состояния локуса 10q26.3 до сих пор не является рутинным тестом для определения чувствительности опухолей головного мозга к темозоломиду ни в России, ни за рубежом, нами разработан эффективный способ сочетанного определения делеций и метилирования гена [23].
Разработка диагностического протокола для ретинобластомы
Ретинобластома (РБ) — опухоль сетчатки глаза, характеризуется высокой степенью злокачественности, ин-вазивностью и способностью быстро метастазировать в соседние органы и ткани. Опухоль возникает внутриутробно или развивается в первые 2—3 года жизни. Наблюдается постоянный рост частоты РБ в популяции, которая в настоящее время составляет 1 случай на 13—15 тыс. живых новорожденных.
Эффективное лечение и сохранение жизни ребенка возможны только при условии ранней диагностики заболевания, поэтому разработка методов, позволяющих
своевременно диагностировать и прогнозировать течение болезни, является важной задачей. Комплексное молекулярно-генетическое исследование молекулярной патологии в гене RB1 у пациентов с различными формами РБ показало, что мутации гена RB1, в т.ч. ранее не описанные, обнаружены в 72% случаев, делеции гена выявлены в 71% опухолей, функциональная патология гена установлена в 27%, а функциональная патология гена Р16, регулирующего активность RB1, — в 17% случаев. Комплексное молекулярное исследование обнаруживает патологические события, приводящие к развитию РБ более чем у 90% пациентов с РБ. ДНК-диагностический протокол для пациентов с РБ включает скрининг мутаций методом прямого секвенирования, поиск делеций методом микросателлитного анализа в гене RB1, исследование статуса метилирования промоторных областей генов RB1 и Р16 методом метилчувствительной ПЦР. Комплексная молекулярная диагностика проведена более чем 240 пациентам и членам их семей. Наследственный характер мутаций подтвержден более чем в 30% случаев, а в 21 случае была проведена успешная пренатальная диагностика [24, 25].
Заключение
Разработка стандартных наборов ДНК-маркеров для наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний позволяет эффективно проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, осуществлять мониторинг заболевания в периоды ремиссий, обнаруживать микрометастазы во время лечения и определять терапевтическую тактику в случае инактивации или гиперэкспрессии генов. Ранняя и эффективная диагностика с использованием систем молекулярных маркеров позволяет избежать инвалидизации, снизить затраты на лечение без снижения результативности. Благодаря подбору систем молекулярных маркеров и оптимизации всех этапов молекулярной диагностики стоимость анализа на практике оказывается более чем на порядок ниже, чем у соответствующих аналогов за рубежом, что особенно существенно для клинического использования. Вместе с тем по простоте и скорости исполнения, чувствительности, достоверности и надежности получаемых результатов предложенные разработки не только не уступают, но превосходят уровень мировых стандартов.
Внедрение в научные исследования современных технологий секвенирования нового поколения и биоинформационного анализа, позволяющих анализировать геном, экзом, метилом, транскриптом опухолевых клеток и клеток микроокружения, даст возможность более эффективно выявлять новые молекулярные маркеры, разрабатывать диагностические системы нового поколения, получать новые знания о патогенезе онкологических заболеваний, что приведет к идентификации новых молекулярных мишеней для разработки таргетных препаратов.
#
ЛИТЕРАТУРА
1. Стратегии развития медицинской науки в Российской Феде- 3. рации на период до 2025 г. Распоряжение Правительства РФ
от 28.12.2012 № 2580-р.
2. Tanas A.S., Shkarupo W, Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V, Strel-nikov YV Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening. Epigenomics. 2010; 2 (2): 325—333.
Руденко В.В., Танас А.С., Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2011/132 от 27.05.2011 г.
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕДИЦИНЫ
Ф
4. Руденко В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК. М. Патент на изобретение № 2472859, приоритет 18 мая 2011 г.
5. Kuznetsova E.B., Kekeeva T.V, Larin S.S., Zemliakova V.V., Babenko O.V., Nemtsova M.V., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Mol. Biol. (Moskva). 2007; 41 (4): 624-633.
6. Kuznetsova E.B., Kekeeva T.V., Larin S.S., Zemlyakova W, Khomyakova A.V., Babenko O.V., Nemtsova M.Y, Zaletayev D.V., Strelnikov V.V J. Carcinogen. 2007; 6: 9.
7. Руденко В.В., Танас А.С., Стрельников В.В. Новые маркеры аномального метилирования ДНК при раке молочной железы. Идентификация методом непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. LAP LAMBERTAcadem. Publish. 2012; 153: ISBN: 978-3-659-25699-8.
8. Kekeeva T.V., Nemtsova M.V., Andreeva Y.Y., Frank G.A., Rusakov I.G., Zaletayev D.V. Molecular genetic alterations in prostate cancer microenvironment. In: Handbook of prostate cancer cell research. A.T. Meridith (ed.). Nova Science Publishers, Inc., NY, United States of America. 2009. P. 411-430. ISBN: 978-1-60741-954-9.
9. Кекеева Т.В., Пальцева Е.М., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомный районов 13q14 и 16q23 у пациентов с подозрением на рак предстательной железы. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2008/151 от 23.07.2008 г.
10. Кекеева Т.В., Пальцева Е.М., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика определения маркера TMPRSS2/ERG4 для диагностики и проведения эффективной гормональной терапии у пациентов с раком предстательной железы. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2008/153 от 23.07.2008.
11. Кекеева Т.В., Немцова М.В., Шегай П.В., Залетаев Д.В. Способ ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы. М. Патент на изобретение № 2405837 от 10.12.2010 г.
12. Кекеева Т.В., Жевлова А.И., Подистов Ю.И., Соловьева Ю.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Молекулярная биология. 2006; 39 (2): 224-230.
13. Кекеева Т.В., Пальцева Е.М., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика для выявления среди пациентов с заболеваниями шейки матки больных с предраковыми (тяжелая дисплазия второй и третьей степени) и онкологическими изменениями. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2008/154 от 23.07.2008 г.
14. Сидорова И.С., Унанян А.Л., Евтина И.П., Залетаев Д.В. Способ прогнозирования рака шейки матки при доброкачественных и предраковых процессах шейки матки у женщин репродуктивного возраста. М. Патент на изобретение № 2466392 от 10.11.2012 г.
15. Сидорова И.С., Унанян А.Л., Власов Р.С., Залетаев Д.В., Вознесенский В.И. Способ прогнозирования развития рака тела матки при патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста. М. Патент на изобретение № 2466390 от 10.11.2012 г.
16. Михайленко Д.С. Молекулярно-генетическая диагностика в онкоурологии. LAP Lambert Academ. Publish. 2013; 72: ISBN: 978-3-659-36373-3.
17. Михайленко Д.С., Пальцева Е.М., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2008/150 от 22.07.2008 г.
18. Михайленко Д.С., Пальцева Е.М., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточном раке почки. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2008/152 от 23.07.2008 г.
19. Бабаян А.Ю., Карякин О.Б., Теплов А.А., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Молекулярная биология. 2011; 45 (6): 1012-1016.
20. Бабаян А.Ю., Пальцева Е.М., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2009/311 от 04.09.2009 г.
21. Стрельников В.В., Землякова В.В., Шубина М.В. Молекулярно-генетическая диагностики опухолей головного мозга. В кн.: Введение в молекулярную диагностику. Т. 2. Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний. Под ред. М.А. Пальцева и Д.В. Залетаева. М.: Медицина. 2011. С. 486-503.
22. Землякова В.В., Стрельников В.В., Пальцева Е.М., Кузнецова Е.Б., Смолин А.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика определения генетического статуса О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы у пациентов со злокачественными опухолями головного мозга для оптимизации терапии темозоломидом. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2009/316 от 4.09.2009 г.
23. Стрельников В.В., Пальцева Е.М., Кузнецова Е.Б., Смолин А.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая методика определения потери гетерозиготности хромосомных районов 1р и 19q у пациентов с анапластической олигодендроглиомой. Новая медицинская ДНК-технология. М. Разрешение ФС № 2009/332 от 5.10.2009 г.
24. Бабенко О.В., Саакян С.В., Бровкина А.Ф., Козлова В.М., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярная медицина. 2003; 2: 48-54.
25. Залетаев Д.В., Бровкина А.Ф., Бабенко О.В., Саакян С.В., Немцова М.В. Проведение молекулярной диагностики при ретинобластоме Пос. для врачей. М.: МЗ РФ. 2003.
13
#
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Залетаев Дмитрий Владимирович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, заведующий лабораторией молекулярной генетики человека Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (985) 991-64-46, e-mail: zalnem@mail.ru
Стрельников Владимир Викторович, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории
эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: vstrel@list.ru
Немцова Марина Вячеславовна, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова
Адрес: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: nemtsova_m_v@mail.ru
#
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 9
14
Бабенко Ольга Владимировна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: polyakk@list.ru
Кузнецова Екатерина Борисовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: kuznetsova.k@bk.ru
Землякова Валерия Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, МЗ РФ
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: valzem@inbox.ru
Кекеева Татьяна Владимировна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова МЗ РФ Адрес: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: kekeeva@mail.ru
Михайленко Дмитрий Сергеевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: dimserg@mail.ru
Танас Александр Сергеевич, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: tanas80@gmail.com
Руденко Виктория Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: shkarupo@mail.ru
Бабаян Анна Юрьевна, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: babayan-a@inbox.ru
Алексеева Екатерина Александровна, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: katrina_5@inbox.ru
Симонова Ольга Анатольевна, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: (495) 622-96-35, e-mail: simonova_o.a@mail.ru
#
#
