CC BY
4УДК 630*165:630*44
Л.В. Можаровская
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛОКУСОВ, КОДИРУЮЩИХ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ СОСНЫ
ОБЫКНОВЕННОЙ
Институт леса НАН Беларуси Республика Беларусь, 246001, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: milamozh@yandex.by
С использованием высокопроизводительного секвенирования транскриптомов проростков сосны обыкновенной идентифицировано четыре, ранее не описанные, экспрессируемые последовательности, детерминирующие антимикробные пептиды (АМП). На основании полученных результатов проведена аннотация и структурно-функциональный анализ выявленных EST-маркеров. Проведенный сравнительный анализ идентифицированных паралогичных АМП-генов выявил высокий уровень их сходства (92-97%).
Ключевые слова: сосна обыкновенная, высокопроизводительное секвенирование, антимикробные пептиды, инфекционное полегание.
Введение
Сосна обыкновенная является главной ле-сообразующей породой Беларуси — долевое участие сосновой формации в лесном фонде республики составляет порядка 50%. Сосновые насаждения имеют важное хозяйственное и средообразующее значение [1]. Ежегодный объем проводимых мероприятий по лесовос-становлению сосняков превышает 16 тыс. га с использованием более 60 млн штук посадочного материала.
Основным негативным фактором при выращивании посадочного материала в условиях лесных питомников являются инфекционные заболевания, среди которых доминируют болезни, вызываемые некротрофными патогенными грибами родов Fusarium, Alternaría, Verticillium, Rhizoctonia, Botrytis, поражающие корневую систему и стебель проростков — инфекционное полегание сеянцев [2]. Одной из стратегий повышения устойчивости лесного посадочного материала является использование при выращивании генотипов растений, характеризующихся наследственно обусловленной резистентностью к фитопатогенным микроорганизмам.
За последние десятилетия, с развитием мо-лекулярно-генетических методов у древесных растений, в том числе и хвойных видов, было описано большое число генов, ассоциированных с устойчивостью к патогенам
^-белки) [3-8]. Одной из основных групп защитных белков, являются антимикробные полипептиды (АМП). АМП растений характеризуются небольшим размером (<100 аминокислот) и большинство из них относятся к цистеин-насыщенным пептидам, в молекулах которых содержится четное число остатков ци-стеина, образующих дисульфидные связи, что придает их молекулам высокую структурную стабильность и предотвращает их денатурацию вне клетки. На основе гомологии аминокислотных последовательностей, а также пространственной структуры, АМП классифицируются на следующие семейства: тионины, дефензины, хитин-подобные белки, гевеино-и нотииноподобные белки, неспецифические липидпереносящие белки, макроциклические пептиды, Snakin/GASA-семейство и др. [9-12].
Экспрессия антимикробных пептидов в растительном организме происходит как конститутивно, так и в ответ на микробное заражение [8]. Механизм физиологического воздействия антимикробных пептидов растений на патогены объясняется моделью Шая-Мацудзаки-Хуанга ^МН) [13-15], в основе которой показано взаимодействие АМП с мембраной патогена и последующим смещением липидов мембраны, изменением ее структуры и, в некоторых случаях, проникновением пептида внутрь микробных клеток.
Основываясь на данной модели, различными авторами предложено несколько гипотез причин гибели патогенного микроорганизма: вследствие деполяризации мембраны; создания механических повреждений; активации процессов разрушающих клеточную стенку, включая индукцию гидролитических ферментов; нарушения распределения липидов мембраны, приводящих к ее функциональному дисбалансу; повреждения органоидов клетки [16-18].
В настоящее время в базе нуклеотидных последовательностей NCBI содержатся в основном фрагментарные, полученные различными авторами и не систематизированные данные структурной организации антимикробных пептидов. Для хвойных видов растений количество аннотированных последовательностей антимикробных пептидов является ограниченным: Pinus montícola (AMP1: JQ771157 - JQ771173; AMP1: AY596276); Pinus pinaster (AMP1: HM210085; AMP2: HM210086); Pinus sylvestris (AMP1: AF410952; AMP2: AF410953; AMP3: AF410954; AMP4: AF410955); Pseudotsuga menziesii (antimicrobial peptide 2-like: KC155997) [4, 5, 7]. В связи с этим исследования, направленные на молекулярно-генетическую идентификацию антимикробных пептидов хвойных видов, представляют особый интерес как в аспекте оценки эволюционного развития иммунной системы растений, так и для выявления устойчивых к инфекционным заболеваниям генотипов.
Исходя из вышесказанного, целью работы являлся поиск наиболее представленных антимикробных пептидов в транскриптоме проростков сосны обыкновенной с последующим их структурно-функциональным анализом.
Материалы и методы
Проростки P sylvestris (n=14), выращивали в лабораторных условиях при температуре воздуха 22 °С и фотопериоде 10 ч в течение 14 суток. Выделение тотальной РНК проводили из корня и гипоктиля проростков набором GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, США) по методике фирмы-производителя. Очистку РНК от примесей геномной ДНК выполняли набором DNase I,
RNase-free (Thermo Scientific, США), а для ин-гибирования рибонуклеаз — RNase Inhibitor (Thermo Scientific, США). Для реакции обратной транскрипции матричной РНК с получением двухцепочечной кДНК использовали набор Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США).
Библиотеки кДНК (размер фрагмента -200 п. н.) готовили с использованием набора Ion Plus Fragment Library Kit (Thermo Scientific, США). Эмульсионную ПЦР проводили с использованием набора Ion PGM Template OT2 200 Kit (Thermo Scientific, США) согласно инструкции компании-производителя, в планшетном амплификаторе Ion One Touch 2 System (Thermo Scientific, США). Этап обогащения микросфер производился с использованием автоматической пробоподготовки Ion OneTouch ES с применением наборов Ion PGM Template OT2 Solutions 200 Kit и Ion PGM Enrichment Beads (Thermo Scientific, США). Реакцию секвениро-вания производили на базе геномного анализатора Ion PGM System (Thermo Scientific, США) с использованием набора Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 и полупроводникового микрочипа Ion 314 Chip v2 (Thermo Scientific, США). Первоначальную обработку данных, поступающих от геномного анализатора, осуществляли в автоматическом режиме при помощи программного обеспечения Ion Torrent Suite v. 4.0 (Thermo Scientific, США). Окончательную обработку информации и сборку транскриптов генов производили с использованием программного обеспечения SeqMan NGen v. 11 (DNASTAR, Израиль).
Для идентификации кодирующих последовательностей антимикробных пептидов использовали ISS-подход (анализ сходства последовательностей) в базе данных нуклео-тидных последовательностей и консервативных доменов GenBank NCBI [19]. Трансляцию нуклеотидных последовательностей с последующим множественным выравниванием проводили с использованием программного пакета CLC Sequence Viewer 6.3 (Qiagen, США). Для кластерного анализа, с построением дендро-грамм генетического сходства, использовали программное обеспечение MEGA 6.0. Оценку воспроизводимости результатов кластеризации проводили с использованием бутстреп-анализа (1000 повторов).
Результаты и обсуждение
По результатам высокопроизводительного секвенирования библиотек кДНК исследуемых проростков P. sylvestris с последующей сборкой, было получено более 28 тыс. последовательностей (контигов). Для контигов (уровень покрытия > 20) № 43, 44, 45, 82 выявлен высокий уровень сходства с генами семейства антимикробных пептидов, содержащих домен MiAMPl, ранее описанный для антимикробного пептида австралийского ореха Macadamia integrifolia [20]. С использованием ISS-подхода для нуклеотидных последовательностей контигов № 43 и 45 было показано сходство с последовательностями генов антимикробного пептида 1 (АМП1) на 99% (ген Sp-AMP1 Pinus sylvestris, депонент GenBank AF410952) и 97% (ген PpAMPl Pinuspinaster, депонент GenBank HM210085), соответственно. Нуклеотидная последовательность контига № 44 на 99% совпадала с последовательностью гена Sp-AMP3 антимикробного пептида 3 (АМП3) Pinus sylvestris (депонент GenBank AF410954). Анализ сходства последовательностей для контига № 82 показал идентичность на 99% с последовательностями генов трех антимикробных пептидов (АМП2, АМП3, АМП4) Pinus sylvestris (депоненты GenBank AF410953, AF410954, AF410955). Также был проведен анализ сходства между нуклеотидными последовательностями новых идентифицированных АМП (контиги № 43, 44, 45, 82), установлен высокий уровень консервативности (сходство 92-97%).
С использованием программы Protein BLAST базы данных GenBank NCBI был проведен поиск гомологов транслируемых аминокислотных последовательностей (АК-последо-вательностей) идентифицированных пептидов с последующей оценкой степени сходства. Для контига № 43 сходство аминокислотной последовательности транслируемого региона с АК-последовательностью кодируемой геном Sp-AMP1 (депонент GenBank AF410952, protein_id AAL05052) составило 97%, наибольшее сходство в 98% наблюдалось с АК-последовательностью PpAMPl (депонент GenBank HM210085, protein_id ADJ53037) с наличием двух несинонимичных замен, выражающихся в изменении полипептидной цепи в положениях L10 ^ M10, R84 ^ G84, и одной
синонимичной, относящейся к позиции A9. Сравнение нуклеотидного и аминокислотного выравниваний показало, что несинонимичные замены вызваны миссенс-мутациями по типу трансверсии в первых позициях кодонов (TTG ^ ATG; CGT GGT), синонимичная замена обеспечена сайленс-мутацией-транзицией в третьей позиции кодона (GCT GCC). Аминокислотная и нуклеотидная последовательности транслируемого региона контига № 44 имела 100% гомологию с последовательностями пептида и гена Sp-AMP3 (депонент GenBank AF410954, protein_id AAL05054). Для контига № 45 сходство АК-последовательности транслируемого региона с АК-последовательностью, кодируемой геном PpAMP1 (депонент GenBank HM210085, protein_id ADJ53037), составило 97%. При сравнении нуклеотидного и аминокислотного выравниваний было выявлено наличие трех несинонимичных замен (V9 ~ M9; M10 ~ L10; A92 ~ D92), вызванных миссенс-мутациями: транзицией в первой позиции кодона (GTG ^ ATG), трансверсиями в первой (ATG ~ CTG) и второй (GCT ~ GAT) позициях кодонов, а также одной синонимичной заменой в 101 позиции (F101) за счет сай-ленс-мутации по типу транзиции в третьей позиции кодона (TTT ^ TTC). Анализ сходства аминокислотной последовательности транслируемого региона контига № 82 показал идентичность на 99% с АК-последовательностями: Sp-AMP2 (депонент GenBank AF410953, protein_id AAL05053), Sp-AMP3 (депонент GenBank AF410954, protein_id AAL05054), Sp-AMP4 (депонент GenBank AF410955, protein_id AAL05055). Для транслируемых аминокислотных последовательностей, кодируемых генами Sp-AMP2 и Sp-AMP4, была установлена 100% гомология (при этом выявлено различие в нетранслируемом регионе). Для нуклеотидной последовательности АМП контига № 82 по отношению к данным последовательностям наблюдалось наличие одной несинонимичной замены, выражающейся в АК-последовательности в положении Q25 ^ E25, вызванной миссенс-мутацией по типу трансверсии в первой позиции кодона (CAG GAG). При сравнении последовательностей АМП контига № 82 с последовательностью Sp-AMP3 выявлена одна несинонимичная замена, выражающаяся в аминокислотной за-
мене (S70 A70), обеспеченная двумя трансверсиями в первом и третьем положении кодо-на (TCT GCG), а также одна синонимичная по типу транзиции в третьем положении кодо-на (ACT ^ ACC), кодирующего аминокислоту треонин в 68 положении.
Для проведения кластерного анализа использовались идентифицированные нами последовательности АМП P. sylvestris, а также ранее известные для хвойных видов, взятые из базы данных GenBank. С использованием программы ORF Finder для нуклеотидных последовательностей анализируемых хвойных растений была идентифицирована открытая рамка считывания длиной 318 нуклеоти-дов (105 аминокислот), содержащая домен пептида MiAMPl и 26 (27 для HM210086) аминокислотных остатков сигнальной последовательности (короткая аминокислотная последовательность белков, которая определяет направление их транспорта в клетке после трансляции и способствует проникновению
молекул сквозь мембраны во внеклеточное пространство) [21]. Ранее в исследовании К. Казана с соавторами было показано, что сигнальная последовательность антимикробного пептида MiAMP1 необходима для экзогенной секреции АМП в межклеточные пространства для ингибирования находящихся в них патогенов [22].
Анализ множественного выравнивания аминокислотных последовательностей данных антимикробных пептидов показал наличие 33 консервативных аминокислот (рис. 1), большая часть из которых (94%) была локализована в функциональном MiAMP1-домене. Характерной особенностью домена являлось обязательное наличие не менее шести цистеиновых остатков, обеспечивающих сохранение стабильности третичной структуры полипептида, необходимой для сохранения функциональной активности.
С помощью алгоритма ближнего соседа (neighbor-joining, NJ) для исследуемых амино-
60 I
PmAMP1-JQ771157 Pm AM Р1 -J Q771161 PimAMP1-AY596276 РрАМР1-НМ2100В5 РрАМР2-НМ2Ю0В6 SP-AMP1-AF410952 S р-AM P2-AF4109 53 S р-AM P3-AF410954 Sp-AMP4-AF410955 PmeAMP2-llke-KC155997 PbI-BT070597 Pgl-BT101327 M i AM P1-CAA71942 Psi-EF676834 Contig 43 Contig 44 Contig 45 Contig 82 Consensus
1W1»
Conservation
PrriAMP1-JQ771157 PmAMP1-JQ771161 P m AM P1 - A Y5962 76 PpAMP1-HM210085 ppAMP2-HM2iooee Sp-AMP1-AF410952 SP-AMP2-AF410953 SP-AMP3-AF410954 S p-AM P4-AF4109 55 P m с AM P2-II kc- K.C 155987 Psl-BT0705S7 Pgl-BT101327 M i AM P1-СЛА71842 Psi-EF67S834 Contig 43 Contig 44 Contig 45 Contig 82 Сопчопяия
Ccnservalion
f vlv s lfl am aqpsea s yf sawagpgcmn
f vlv s lfl am aqpsqa s yf sawî|gpgcmn
f vlv с lfl am aqpsqa s yf sawagpgcmn
f vlv С lfl al aqpsig s yf tawagpgcmn
fvsv С li l as aqpaptggs yf tawesa\|cmn
f vlv с lfl am aqps|g s yf tawagpgcmn
f vlv с lfl am aqpsqg s yf tawagpgcmn
f v lv с lfl am aqpsIg s yf tawagpgcmn
f v lv с lfl am aqpsqq s yf tawagpgcmn
f vlv с lvl ai aqpsIg s yf tawagpgcmn
fl lv с lfl af aqpsqq s yf tawagpgcmn
fl lv с l fl af aqpsqg s yf tawagpgcmn
1 tvmm l iiam а semvnq saf tvwsgpgcmn
flsv с l 1 lvs a|ps|g s yf taweaagcmn
f v lv с lfl am ao ps eg s yf tawagpgcmn
f v lv с lfl am aqpsIg s yf tawagpgcmn
f v lv с lfl al aofs eg s yf tawagpgcmn
f v lv с lfl am aqpsIg s yf tawagpgcmn
ME TKRLAYVM FV LVC L F LAM AQPSEG-SYF TAWAGPGCNN
h m a r y n cgc sn ghnvhgg
hmaryn cgc sn shnvhgg
hnary s cgc sn ghnvhgg
haary s cgc sn gndvhgg
etvry n cwc sn ndkfrgg
haary s cgc sn gnnvhag
haary s cgc sn gnnvhgg
haary s cgc sn gnnvhgg
haary s cgc sn gnnvhgg
haary g cgc sn ggnvhgg
haary s cgc sn ggnvhgg
haary s cgc sn gsdvrag
raeri s cgc sa ho■ - к g g
qsvgys cgc sn ddkfhgg
haary s cgc sn Igndvhgg
haary s cgc sn gnnvhgg
haary s cgc sn gndvhgg
haary s cgc sn 1 gnnvhgg
haarys KCGC sn 1GNNVHGG
yefvyq-gqa 6b y e f v y о - goa 5в yefvyo-gqt 68 yefvyo - gqt 63 yefvnq ■ gq| 69 ^^^tq - gqt 68 q - gqt 68 q - gqt ев q - gqt 68 spgqp 69 q - gqt 68 q - gqt sb t - gqt 66 П-GQS 68 q - gqt ев q - gqt ев q-gqt 68 q - gqt 68 yefvyq-gqt
in ПIII Inl
ЬШО
hi П In
PTA PMA aaa asa aaa asa aaa asa aaa gaa asa asa
aa|
aaa asa asa asa aaa
80
nthnck nthnck ntdnck ntam ck nt el cm n tain ok ntdnck ntdnck ntdnck ntah ck nta n cm ntancn nqagcs ntei cm n tain с к ntdnck ntan ck ntdnck
AHAYNTANCK
gv aqthé s sn
gv aqt f s sn
gv aqt f sss
gv aqt f sgs
gppht f sg -
gv aqt f sgs
gv aqt f sss
gv aqt f sss
gv aqt f sss
gaaht f gss
gv aht f sgs
gv aqt f sgs
gv aht f gs -
gp pht ag|
gv aqt 1 sgs
gv aqt 1f sss
gv aqt sgs
gv aqt 1f sss
gvaqtrfsss
v nqacnn aw svfi qc 105
V nqac sn aw svfi qc 105
v nqacsn gw svfi qc 105
v nqacsg gw sffi qc 105
s vqdcsg gw sffi qc 105
V nqacsg gw sffi qc 105
v nqac s s gw sffi qc 105
v nqac s s gw sffi qc 105
V nqac s s gw sffi qc 105
v nqac sa gw sffi qc 106
v nqacsg gw sffi qc 105
v nqac tg gw sffi qc 105
saracnp gw s 1 f 1 qc 102
3vqdcsg gw sffi qc 105
vnqacsg gw sffi qc 105
v n q a с s s gw sffi qc 105
Inqdcsg gw sffi qc 105
nqac s s gw shl qc 105
VNQAC5GFGW KSFFIQC
In InnППпП nni
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей АМП хвойных видов, а также Macadamia
integrifolia, содержащих домен MiAMP1
кислотных последовательностей АМП (включая AMPI Macadamia integrifolia) проведен кластерный анализ и построена дендрограмма (рис. 2).
Как видно из рис. 2, структура дендрограм-мы представлена двумя основными кластерами с достоверно подтвержденными высокими уровнями значения бутстрепа (730-1000). При этом внутри кластера, сформированного антимикробным пептидом 2 Pinus pinaster и неаннотированным пептидом Picea sitchensis (депоненты GenBank HM210086 и EF676834), наблюдался высокий уровень генетической дифференциации: 0,1287 и 0,1268. Второй обширный кластер был сформирован аминокислотными последовательностями различных АМП хвойных родов Pinus (ранее аннотированных как: АМП1, АМП2, АМП3, АМП4, предшественник АМП), Picea (ранее не аннотированные) и Pseudotsuga (аннотированный как АМП-2-подобный пептид). Кроме того, в структуре дендрограммы АМП-2 видов одного рода P sylvestris (AF410953) и P pinaster (HM210086) вошли в разные кластеры и различия между их аминокислотными структурами были значительно выше, чем между АМП-2 P. sylvestris (AF410953) и АМП-2-подобным пептидом Pseudotsuga
menziesii (KC155997). Также важно отметить, что для антимикробных пептидов P. sylvestris, идентифицированных Ф. Асигбу с соавторами, АМП2 (AF410953) и АМП4 (AF410955) наблюдалась полная идентичность, и они сформировали общую ветвь [6]. Полученные результаты кластеризации, на наш взгляд, свидетельствуют о том, что депонированные различными авторами данные, относительно молекулярной структуры и аннотации антимикробных пептидов хвойных растений, разобщены и требуют дальнейшей систематизации.
Анализ внутривидовой представленности АМП, на примере P. sylvestris, показал широкое разнообразие антимикробных пептидов с низким уровнем структурных различий, что, предположительно, обусловлено общим происхождением и последующей дивергенцией генов-паралогов, кодирующих данные пептиды. Исходя из литературных данных, описывающих особенности коэволюции растений и патогенных микроорганизмов, у древесных растений в ответ на формирование широкого спектра таксонов патогенного микроорганизма наблюдается увеличение разнообразия в геномах растений семейств генов антимикробных пептидов [24, 25].
Рис. 2. Дендрограмма генетического сходства исследуемых аминокислотных последовательностей АМП.
Шкала внизу — генетическое расстояние [23]
Для идентифицированных доменов антимикробных пептидов был проведен молекулярный анализ (in silico) с использованием программы IPC. Прогнозируемая молекулярная масса пептидного региона составила от 8,35 кДа (для контига № 43) до 8,59 (контиг № 44), теоретическая изоэлектрическая точка (pI) также оказалась сходной: 7,25 (для конти-гов № 43 и 45) и 7,53 для контигов № 44 и 82), что указывает на сходство их физико-химических параметров.
Трехмерное моделирование пространственной структуры аминокислотных последовательностей структурных доменов MiAMPl исследуемых АМП проведено на сервере программы SWISS-MODEL. В качестве референс-ной модели использовался домен MiAMPl австралийского ореха Macadamia integrifolia с установленной ранее структурой [20], для которой характерно наличие восьми в-цепей, формирующих две в-складки с топологией «греческого ключа». Аналогичная пространственная организация показана и для доменов антимикробных пептидов, выявленных нами у
сосны обыкновенной (рис. 3). В то же время, исходя из структурного анализа установлено, что электростатический потенциал исследуемых доменов сосны отличался от референс-ного домена MiAMP1, являющегося амфипа-тической молекулой, у которой большая часть положительных зарядов сконцентрировано на одной стороне пептида. Для всех четырех доменов было характерно замещение положительно заряженного аминокислотного остатка Е16 на нейтральный А16, также в положении 65 отрицательно заряженный R замещен на нейтрально заряженный Q. Пары доменов контигов 43/45 и 44/82 характеризовались сходной структурной организацией и электростатическим потенциалом, но для домена контига № 45 наблюдался дополнительный положительный заряд в положении D66. Однако, не смотря на наличие полиморфизма в доменной области, пространственная структура, с присутствием специфичных аминокислот, для всех АМП сохранялась.
Полученные данные кластерного и молеку-лярно-структурного анализа свидетельствуют
Рис. 3. Трехмерная модель доменов М1АМР1 идентифицированных АМП проростков сосны обыкновенной (а — контиг № 43, б — контиг № 44, в — контиг № 45, контиг № 82) на основе референсной модели домена М1АМР1 Macadamia integrifolia с отображенным электростатическим потенциалом, в-цепи обозначены
стрелкой
о наличии структурного разнообразия парало-гичных генов P. sylvestris, кодирующих функционально сходные антимикробные пептиды. На наш взгляд, это может быть обусловлено особенностью таксономического состава патогенной микрофлоры, вызывающей болезни сеянцев сосны обыкновенной. Как отмечалось выше, основными патогенами выступает группа аскомицетных некротрофных грибов со сходными патогенетическими свойствами, что обуславливает выработку у растения тождественных защитных механизмов. В то же время, эффективность действия антимикробных пептидов достигается за счет незначительных изменений в их структуре, обеспечивающих наибольшее сродство к различным видам патогенов. Аналогичные результаты относительно структурно-функционального разнообразия АМП среди хвойных растений были получены в исследованиях для P pinaster и P montícola [5, 7].
Как указывалось ранее и подтверждается результатами наших исследований, антимикробные пептиды являются наиболее широко представленной группой защитных белков (продуктов R-генов) в метаболоме проростков P. sylvestris, что определяет их значимость в качестве объекта исследования для установления механизмов резистентности сосны обыкновенной к различным инфекционным заболеваниям.
Заключение
В результате проведенных исследований для транскриптома проростков сосны обыкновенной идентифицировано четыре ранее не описанных гена, кодирующих антимикробные пептиды, проведен их структурно-функциональный анализ. Установлено, что они являются паралогами и содержат функциональный домен MiAMPl, ассоциированный с устойчивостью растений к патогенным микроорганизмам. Уровень генетического сходства экспрессируемых нуклеотидных последовательностей идентифицированных АМП-генов составил 92-97%, при этом генетические изменения в меньшей степени затрагивали функциональную область (MiAMPl-домен), что указывает на сохранение их антимикробной специфичности. Выявлена относительная консервативность домена MiAMPl, что позво-
ляет использовать его в качестве EST-маркера для идентификации устойчивых генотипов сосны обыкновенной.
Список использованных источников
1. Министерство лесного хозяйства [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.mlh.by/. - Дата доступа: 23.07.2018.
2. Федоров, Н. И. Лесная фитопатология: учебник для студентов специальности «Лесное хозяйство» / Федоров Н. И. // Минск: БГТУ. - 2004. - 462 с.
3. Natural roles of antimicrobial peptides in microbes, plants and animals / G. Maroti [et al.] // Research in microbiology. - 2011. - Vol. 162, № 4. - P. 363-374.
4. Anti-microbial peptide (AMP): nucleotide variation, gene expression, and host resistance in the white pine blister rust (WPBR) pathosystem / J. J. Liu, A. Zamany, R. A. Sniezko // Planta. -2013. - Vol. 237, № 1. - P. 43-54.
5. Cloning and characterization of a putative antifungal peptide gene (Pm-AMP1) in Pinus monticola / A. K. Ekramoddoullah, J. J. Liu, A. Zamani // Phytopathology. - 2006. - Vol. 96 № 2. - P. 164-170.
6. Isolation of a novel antimicrobial peptide gene (Sp-AMP) homologue from Pinus sylvestris (Scots pine) following infection with the root rot fungus Heterobasidion annosum / F. O. Asiegbu [et al.] // FEMS microbiology letters. - 2003. -Vol. 228, № 1. - P. 27-31.
7. Canales, J., Avila C., Canovas F. M. A maritime pine antimicrobial peptide involved in ammonium nutrition / J. Canales, C. Avila, F. M. Canovas // Plant, cell & environment. - 2011. -Vol. 34, № 9. - P. 1443-1453.
8. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. - 2002. - Vol. 415, № 6870. - P. 389.
9. Garcia-Olmedo, F. Plant defense peptides / F. Garcia-Olmedo, A. Molina, J.M. Alamillo // Biopolymers (Peptide Sci.). - 1998. - Vol. 47. -P. 479-491.
10. Tam, J. P. Antimicrobial peptides from plants / J. P. Tam, S. Wang, K. H. Wong // Pharmaceuticals. - 2015. - Vol. 8, № 4. - P. 711-757.
11. Silverstein, K. A. T. et al. Small cys-teine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants /
K. A. T. Silverstein [et al.] //The Plant Journal. -2007. - Vol. 51, № 2. - P. 262-280.
12. Oliveira-Lima, M. Snakin: structure, roles and applications of a plant antimicrobial peptide / M. Oliveira-Lima // Current Protein and Peptide Science. - 2017. - Vol. 18, № 4. - P. 368-374.
13. Matsuzaki, K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes // Bio-chimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomem-branes. - 1999. - Vol. 1462, № 1. - P. 1-10.
14. Yang, L. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin / L. Yang [et al.] // Biophysical Journal. - 2000. -Vol. 79, № 4. - P. 2002-2009.
15. Shai, Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by a-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides // Bio-chimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomem-branes. - 1999. - Vol. 1462, № 1. - P. 55-70.
16. Westerhoff, H. V. Magainins and the disruption of membrane-linked free-energy trans-duction / H. V. Westerhoff // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1989. - Vol. 86, № 17. - P. 6597-6601.
17. Bierbaum, G. Induction of autolysis of staphylococci by the basic peptide antibiotics Pep 5 and nisin and their influence on the activity of autolytic enzymes / G. Bierbaum, H. G. Sahl // Archives of microbiology. - 1985. - Vol. 141, № 3. - P. 249-254.
18. Kragol, G. The antibacterial peptide pyr-rhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein fold-
ing / G. Kragol [et al.] // Biochemistry. - 2001. -Vol. 40, № 10. - P. 3016-3026.
19. Basic local alignment search tool (BLAST NCBI) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi. - Дата доступа: 28.07.2018
20. McManus, A. M. MiAMP1, a novel protein from Macadamia integrifolia adopts a greek key P-barrel fold unique amongst plant antimicrobial proteins 1 / A. M. McManus [et al.] // Journal of molecular biology. - 1999. - Vol. 293, № 3. - P. 629-638.
21. Тарантул В. З. Словарь биотехнологических терминов. // ИНИЦ Роспатента -2005. - 124 с.
22. Kazan, K. Enhanced quantitative resistance to Leptosphaeria maculans conferred by expression of a novel antimicrobial peptide in canola (Brassica napus L.) / К. Kazan [et al.] // Molecular Breeding. - 2002. - Vol. 10, № 1-2. -P. 63-70.
23. Nei, M. Genetic distance between populations / M. Nei // The American Naturalist. -1972. - Vol. 106, № 949. - P. 283-292.
24. Баранов, О. Ю. Генетические механизмы коэволюции в системе «хозяин-паразит» (на примередревесныхрастенийифитопатогенных грибов лесных ценозов Беларуси): диссертация доктора биологических наук: 03.02.07 -генетика: защищена 21.12.2017, утверждена: 16.06.2018. - Гомель, 2017. - с. 208.
25. Stahl, E. A. Plant-pathogen arms races at the molecular level / E. A., Stahl, J. G. Bishop // Current opinion in plant biology. - 2000. - Vol. 3, № 4. - P. 299-304.
L.V. Mozharovskaya
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF LOCI ENCODING ANTIMICROBIAL PEPTIDES OF SCOTS PINE
Institute of Forest, NASB Gomel, 246001, the Republic of Belarus
Using high throughput sequencing of seedling transcriptomes of Scots pine, four expressed sequences (not previously described) determining antimicrobial peptides were identified. Based on the obtained results, the annotation and structural-functional analysis of identified EST-markers were performed. A comparative analysis of identified paralogous AMP genes revealed their high similarity level (92-97%).
Key words: Scots pine, Next-Generation Sequencing, antimicrobial peptide, infectious lodging of seedlings.
Дата поступления статьи: 29 августа 2018 г.
