CC BY
213
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2014. Вып. 1. Ч.1. С. 291-299
Биология
УДК 616.316:613.24
Структурно-функциональные изменения в печени крыс Вистар с экспериментальным ожирением и коррекцией мелатонином
С. В. Мичурина, Д. В. Васендин, И. Ю. Ищенко
Аннотация. Экспериментальное алиментарное ожирение приводит к значительным изменениям структурно-функциональной организации печени, включая нарушения кровообращения и лимфотока, развитию в паренхиме органа жировой дистрофии. Введение таким животным гормона эпифиза мелатонина способствует нормализации микроциркуляторных процессов и восстановлению структурно-функциональной организации печени.
Ключевые слова: печень, ожирение, мелатонин, крысы Вистар.
В последние годы изучение метаболического синдрома в различных аспектах вызывает большой интерес у исследователей и клиницистов [1-3]. Он характеризуется наличием у одного и того же больного нарушения толерантности к глюкозе и/или инсулинорезистентности, а также двух или более из следующих показателей: повышение артериального давления больше 140/90 мм рт. ст., дислипидемия (повышение уровня триглицеридов более или равное 150 мг/дл и/или снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности менее 35 мг/дл у мужчин и менее 39 мг/дл у женщин, центральное (абдоминальное) ожирение и/или индекс массы тела более 30 кг/м2, микроальбуминурия (скорость экскреции альбумина с мочой более или равна 20 мкг/мин или соотношение альбумин/креатинин более или равно 30 мг/кг) [4]. Международный диабетический фонд (IDF) пересмотрел критерии метаболического синдрома. В опубликованном Консенсусе был сделан акцент на центральном ожирении как на ключевой характеристике метаболического синдрома (и были предложены более низкие критерии диагностики центрального ожирения, а также нарушений углеводного обмена) [5]. В целом предпринято множество попыток систематизировать и разработать единые диагностические критерии метаболического синдрома, но все они принимают во внимание центральное, или абдоминальное ожирение как важнейшую характеристику и неотъемлемую часть метаболического симптомокомплекса. Современные взгляды на
этиопатогенез и особенности развития основных проявлений ожирения позволяют рассматривать ожирение как самостоятельное заболевание с характерными проявлениями. Одновременно ожирение относится к важнейшим факторам риска развития инсулиннезависимого сахарного диабета, артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца и других тяжелых заболеваний [6]. Ряд исследователей с абдоминальным ожирением связывают развитие неалкогольной жировой болезни печени [7-9]. Иными словами, ожирение можно рассматривать в качестве патогенного фактора. Степень патогенности ожирения, как и любого повреждающего агента, в значительной степени лимитируется морфофункциональным состоянием печени как уникального органа, в котором перекрещиваются все метаболические пути и осуществляются ключевые обменные процессы, поэтому целью нашего исследования было выявить и оценить особенности морфофункциональных изменений в печени крыс Вистар в модели алиментарного ожирения и при коррекции выявленных нарушений универсальным адаптогеном, иммуномодулятором и мощным антиоксидантом, оказавшимся эффективным и перспективным в лечении целого ряда патологических состояний — гормоном эпифиза мелатонином [10-14], что важно для решения актуальной проблемы профилактики и терапии ожирения и связанных с ним осложнений, так как до настоящего времени не найдено эффективных методов лечения этого многопланового заболевания.
Материал и методы исследования
В эксперименте использовались половозрелые крысы-самки Вистар с исходной массой тела 180-200 г в возрасте 2 месяцев. Было выделено 3 группы животных: контрольная группа (интактные крысы, получавшие стандартный лабораторный пищевой рацион), группа, животным которой создавалась модель алиментарного ожирения путем добавления к стандартному лабораторному рациону без ограничений пищевых жиров животного происхождения в течение 3 месяцев (группа «ожирение») и группа животных с моделью алиментарного ожирения, которым вводили per os мелатонин в дозировке 0,1 г на 100 г массы тела животного в течение 14 суток, причем во время введения препарата животные жиры из рациона не исключались. Крыс забивали под этаминаловым наркозом (40 мг на один килограмм массы тела животного) путем декапитации. Для морфометрического и светооптического исследований (микроскоп LEICA DM 750, камера LEICA ICC 50 HD) патогистологические препараты фиксировали в 10% забуференном формалине и проводили по общепринятой методике. Морфометрическое исследование препаратов печени проводили при увеличении в 1000 раз на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином Майера и эозином, используя метод наложения точечных морфометрических сеток (сетка 256 точек) [15]. Определяли
относительные площади сети синусоидов, ядер и цитоплазмы гепатоцитов, численные плотности синусоидных клеток, гепатоцитов и двуядерных паренхиматозных клеток; рассчитывали ядерно-цитоплазматическое соотношение, отношение численной плотности синусоидных клеток к численной плотности всех гепатоцитов, вычисляли долю диплокариоцитов от общего числа гепатоцитов, рассчитывали коэффициент Vizotto - отношение площади сети синусоидов к площади паренхимы всех гепатоцитов [16]. Статистическую обработку результатов исследования проводили методом вариационной статистики при помощи пакета программ <^а^^са 7.0» с использованием параметрического ^критерия Стьюдента [17]. Различия сравниваемых величин считали статистически значимыми при р<0,05. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для лабораторных или иных целей.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование печени интактных животных и крыс с экспериментальным алиментарным ожирением показало, что абсолютная масса печени животных с ожирением увеличилась по сравнению с группой контроля на 32%. Такой прирост массы тела соответствует 1-й степени ожирения. Также на основании результатов светооптического и морфометрического исследований печени крыс с ожирением нами был выявлен ряд статистически значимых изменений, касающихся, в первую очередь, состояния микроциркуляторного русла, а также морфометрических параметров [18].
Структура органа и балочное строение печеночных долек сохранялись. На светооптическом уровне в паренхиме печени обнаружены обширные области с признаками жировой дистрофии гепатоцитов в виде многочисленных липидных капель различного размера.
Множественные липидные капли имели тенденцию к слиянию и образовывали крупные жировые капли. При жировой дегенерации печени свободные жирные кислоты, холестерин и фосфолипиды накапливаются в лизосомах гепатоцитов. Одной из причин может быть нарушение окислительных процессов в митохондриях. При ожирении подавляется как окислительное фосфорилирование, так и в-окисление жирных кислот в митохондриях, развивается крупнокапельный или спонгиоцитарный (значительно реже) стеатоз [19]. Основным механизмом возникновения стеатоза считают подавление секреции триглицеридов в составе липопротеинов очень низкой плотности клетками, что ведет к их накоплению в гепатоцитах [20, 21]. Выявлены значимые признаки нарушения кровообращения и лимфотока: слабо выражена сеть синусоидных капилляров при неравномерности их кровенаполнения, расширение поддольковых и внутридольковых вен, стаз эритроцитов в венах и артериях портального тракта, дилатация лимфатических
пространств Малла и инфильтрация их клетками лимфоидного ряда, миграция лимфоцитов в паренхиму и перицентральные области и формирование неолимфоидных агрегатов (лимфоидных узелков). Расширение лимфатических пространств Малла — щелей между паренхимой печени и соединительной тканью, окружающей ветви воротной вены, — свидетельствует о напряженном состоянии путей тканевой несосудистой микроциркуляции, затруднении продвижения жидкостных составляющих, отводимых от печеночной дольки. При этом по расширенным тканевым щелям и лимфатическим сосудам происходит интенсивная миграция лимфоидных элементов и макрофагов. Здесь уместно отметить, что именно макрофагам принадлежит определенная роль в формировании метаболического симптомокомплекса и развитии ожирения (точнее — жировой дистрофии гепатоцитов) как его компонента: макрофаги, подвергаясь воздействию модифицированных липопротеинов низкой плотности, экспрессируют на своей поверхности специфические (мусорщики)-рецепторы, которые связывают и усваивают частицы липопротеинов низкой плотности. Макрофаг, по мере того как его цитозоль переполняется холестерином, приобретает гистологические характеристики так называемой пенистой клетки. Последние способны провоцировать и усугублять воспалительный процесс и формирование атеросклеротической бляшки путем продукции матриксных металлопротеиназ, пероксидов и супероксидов, цитокинов и тканевого прокоагулянтного фактора. Наличие и/или прогрессирование воспалительного процесса будет стимулировать развитие стеатогепатита [19]. Пенистые клетки подвергаются апоптозу и некрозу, в конечном счете, способствуя формированию и прогрессированию некротической сердцевины атеросклеротических бляшек [22]. Наблюдается формирование неолимфоидных агрегатов, или лимфоидных узелков, которые рассматриваются как временные скопления лимфоидной ткани, формирующиеся в ответ на повреждение [23], в нашем случае — на избыточное поступление в организм жиров животного происхождения. Внутри печеночных долек отмечено чередование участков расширенных кровеносных синусоидных капилляров с участками их спазмирования. В синусоидах обнаружены картины стаза крови сладжированными эритроцитами (микротромбирование). Закупорка капилляров сладжированными эритроцитами, наряду с выделяемым эндотелиоцитами и клетками Ito эндотелином, вызывающим локальные спазмы синусоидов печени, — одна из основных причин торможения кровотока. Описанные явления могут вносить свой вклад в формирование местной гипоксии.
Морфометрически установлено, что у крыс с моделью алиментарного ожирения структурно-функциональные показатели клеток паренхимы и стромы, а также микроциркуляторного русла, имеют значительные статистически значимые изменения. Обнаружено, что у этих животных относительная площадь паренхимы увеличилась на 12% (таблица), при
этом доля гепатоцитов с признаками жировой дистрофии составила 72% от числа всех паренхиматозных клеток на исследуемой площади, а средний размер гепатоцита возрос на 8,5%. Увеличение относительной площади ядер паренхиматозных клеток (на 54% по сравнению с контролем) превзошло рост относительных размеров их цитоплазмы (на 12% по сравнению с контролем) паренхиматозных клеток и как следствие — значительно повысилось ядерно-цитоплазматическое отношение — почти в 1,5 раза. Нами обнаружено значительное увеличение количества диплокариоцитов и возрастание их доли среди всех гепатоцитов. Наблюдаемые изменения паренхиматозных клеток печени свидетельствуют об активизации обменных процессов как между ядром и цитоплазмой, так и между клеткой и внеклеточной средой, что обычно сопровождается высоким функциональным напряжением капилляро-соединительнотканных структур. В нашем эксперименте у животных с моделью ожирения стуктурно-функциональные перестройки в гепатоцитах проходили на фоне активации стромы органа, что выражалось в возрастании относительной площади синусоидных клеток печени (на 56%) и в увеличении среднего размера «синусоидной клетки» (на 86%). При этом необходимо помнить, что в группу «синусоидных клеток» входят эндотелиальные клетки синусоидных капилляров, клетки Купфера (звездчатые, или перисунусоидальные клетки), клетки Ito (липоциты) и Pit-клетки, или большие гранулосодержащие лимфоциты. Анализ патогистологических препаратов печени крыс с моделью алиментарного ожирения обнаружил уменьшение в 2,2 раза относительной площади сети синусоидных капилляров в промежуточной зоне печеночных долек. Основываясь на снижении (в 2,6 раза) сотношения удельной площади синусоидов к удельной площади гепатоцитов (коэффициента Vizotto), можно предполагать две причины наблюдаемых изменений — либо усиление дренажной функции регионарных лимфатических узлов, либо недостаточность в кровоснабжении при возросших потребностях паренхимы органа. Результаты морфометрического исследования срезов печени крыс приведены в таблице.
Анализ результатов светооптического и морфометрического исследования патогистологических препаратов печени крыс с моделью алиментарного ожирения после введения гормона эпифиза мелатонина показал, что использование данного препарата ускоряет восстановительные и нормализует микроциркуляторные процессы в органе, что в итоге приводит к значительному улучшению структурно-функционального состояния печени. Введение животным гормона мелатонина оказывало выраженное влияние на исследуемые параметры. Примечательно, что все изменения в печени крыс группы «Ожирение + мелатонин» характеризуются статистически значимыми значениями по сравнению с экспериментальными группами «Контроль» и «Ожирение». Введение мелатонина животным с экспериментальным ожирением приводило к исчезновению признаков нарушения кровообращения и лимфотока — так, нами были отмечены
Таблица 1
Результаты морфометрического исследования срезов печени крыс в группе контроля и экспериментальных группах (М ± т), %
Параметр, структура «Контроль» «Ожирение» «Ожирение + мелатонин»
Цитоплазма гепатоцитов 70,84±0,34 73,42±0,29* 69,6±0,4*#
Ядро гепатоцитов 8,92±0,19 13,7±0,28* 10,15±0,29*#
Кровеносные синусоидные капилляры 20,12±0,26 9,0±0,19* 17,44±0,18*#
Общее количество гепатоцитов 51,54±0,94 53,22±0,85 45,38±0,91*#
Количество неизмененных гепатоцитов 51,54±0,94 14,68±0,5* 42,34±0,89*#
Количество дистрофически измененных гепатоцитов 0 38,54±0,78* 3,04±0,27*#
Число двуядерных клеток 1,72±0,15 5,06±0,27* 2,44±0,2*#
Общее число синусоидных клеток 20,4±0,59 17,26±0,57* 24,62±0,62*#
Ядерно-цитоплазматич. отношение 0,13±0,003 0,19±0,004* 0,15±0,005*#
Отношение числа синусоидных клеток к числу всех гепатоцитов 0,4±0,01 0,33±0,01* 0,55±0,02*#
Отношение числа двуядерных гепатоцитов к числу всех гепатоцитов 0,03±0,003 0,1±0,006* 0,06±0,005*#
Отношение числа кровеносных синусоидных капилляров к паренхиме 0,26±0,004 0,1±0,002* 0,22±0,003*#
Примечание: * — отличия достоверны по сравнению с показателями группы «Контроль»; # — отличия достоверны по сравнению с показателями группы
«Ожирение»
сохранность сосудов портального тракта, восстановление архитектоники центральных вен. Большинство участков гемо- и лимфообращения были без признаков нарушений. Значительно менее выражены были выражены мозаичность кровенаполнения сосудов печеночных долек, расширение сосудов портальных трактов и поддольковых вен, стазирование их просветов эритроцитами. Участки с дистрофически измененными гепатоцитами, практически, отсутствовали. Морфометрически установлено увеличение относительной площади сети синусоидных капилляров (почти в 2 раза) и снижение относительных размеров паренхимы по сравнению с группой «Ожирение». Восстановление кровообращения, лимфотока, нормализация состояния путей тканевой несосудистой микроциркуляции способствовало созданию условий для восстановления структурной
организации и нормального функционирования паренхиматозных клеток печени. Введение мелатонина приводило к практически полному исчезновению дистрофически измененных гепатоцитов. При этом отмечалось уменьшение удельной площади ядер и цитоплазмы гепатоцитов и снижение ядерно-цитоплазматического отношения. Однако полного восстановления этих параметров до контрольного уровня не происходило., что может свидетельствовать о глубине и стойкости выявленных нами нарушений. У животных с введением гормона эпифиза мелатонина отмечено снижение числа гепатоцитов и диплокариоцитов среди них по сравнению с группой «Ожирение», но доля двуядерных паренхиматозных клеток все же оставалась выше контрольного показателя (более, чем в 1,5 раза).
Заключение
Таким образом, ожирение приводит к значительным нарушениям кровообращения и лимфотока в печени, развитию в паренхиме органа жировой дистрофии. Введение таким животным гормона эпифиза мелатонина способствует усилению репаративных процессов в печени, нормализации микроциркуляторных процессов, восстановлению структурной и функциональной организации органа.
Список литературы
1. Петрова Ю.Н. Клинико-лабораторная характеристика неалкогольной жировой болезни у больных метаболическим синдромом: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2007. 21 с.
2. Мартемьянова Е.Г. Прогностическое значение оценки морфофункционального состояния печени у пациентов с метаболическим синдромом: автореф. дис. .. .канд. мед. наук. Екатеринбург, 2012. 22 с.
3. Турьева Л.В. Клинико-морфологические особенности жирового перерождения печени у больных старших возрастных групп с атеросклеротическим поражением аорты, коронарных артерий: автореф. дис. . . . канд. мед. наук. СПб., 2011. 28 с.
4. Alberti K., Zimmet P. For the WHO Consultation Group. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and complications. Part 1: Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO consultation // Diabet. Med. 1998. V. 15. P. 539-553.
5. Zimmet P., Alberti G., Shaw J. A new IDF worldwide definition of the metabolic syndrome: the rationale and results // Diabetes Voice. 2005. V. 50. P. 31-33.
6. Ожирение: руководство для врачей / под ред. Н.А. Белякова, В.И. Мазурова. СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2003. 520 c.
7. Day C., Saksena S. Nonalcoholic steatohepatitis: definitions and pathogenesis // J. Gastroenterol. Hepatol. 2002. V. 17. P. 377-384.
8. Nonalcoholic fatty liver disease: a feature of the metabolic syndrome / M. Giulio [et al.] // Diabetes. 2001. V. 50. P. 1844-1850.
9. Luyckx F.H., Lefebre R.J., Scheen A.J. Non-alcoholic steatohepatitis: association with obesity and insulin resistance and influence of weight loss // Diabetes Metab. 2000. V. 26. P. 98-106.
10. Свободнорадикальное окисление и старение / B.X. Xaвинсон [и др.]. СПб.: HayKa, 2003. 327 c.
11. Беспятых А.Ю., Бурлакова О.В., Голиченков Б.А. Мелатонин как антиоксидант: основные функции и свойства // Успехи современной биологии. 2010. T. 130. № 5. C. 487-496.
12. Мелатонин в комплексном лечении гастроэзофагеальной рефлюксной болезни у детей / О.В. Сыресина [и др.]. // Педиатрическая фармакология. 2012. Т. 9. № 1. C. 77-80.
13. Мелатонин при сахарном диабете: от патофизиологии к перспективам лечения / В.И. Коненков [и др.]. // Сахарный диабет. 2013. № 2. C. 11-16.
14. Пикалова Л.В. Генопротективные эффекты мелатонина при химических и радиационных воздействиях: автореф. дис. . . . канд. биол. наук. СПб., 2012. 23 c.
15. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990. 384 c.
16. Characterization by morphometric of liver regeneration in the rat / Vizotto L. [et al.] // The Amer. J. of anatomy. 1989. V. 185. P. 444-454.
17. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, 1970. 367 c.
18. Васендин Д.В., Мичурина С.В., Ищенко И.Ю. Морфологические особенности печени крыс Вистар при экспериментальном ожирении // Здоровье — основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения: тр. VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. C№, 21-23 ноября 2013. Т. 8. Ч. II. C. 663-665.
19. Курганова И.В. Показатели липидного и белкового обмена крови и состояние клеток печени при экспериментальном ожирении: автореф. дис. . . . канд. мед. наук, Новосибирск, 2002. 16 c.
20. Freneaux E., Larrey D., Pessayre D. Steatoses hepatiques medicamenteuses a triglycerides // Rev. Franc. Gastroenterol. 1988. V. 24. № 240. P. 873-878.
21. Manne J., Argeson A.C., Siracusa L.D. Mechabisms for pleiotropic effects of the agouti gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4721-4724.
22. Libby P. Inflammation in atherosclerosis // Nature. 2002. № 420. P. 868-874.
23. Бородин Ю.И. Регионарный лимфатический дренаж и лимфодетоксикация // Морфология. 2005. T. 128. № 4. C. 25-28.
Мичурина Светлана Викторовна ([email protected]), д.м.н., профессор, главный научный сотрудник, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии, Новосибирск.
Васендин Дмитрий Викторович ([email protected]), к.м.н., доцент, кафедра техносферной безопасности, Сибирская государственная геодезическая академия, Новосибирск.
Ищенко Ирина Юрьевна ([email protected]), к.б.н., старший научный сотрудник, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии, Новосибирск.
Structural-functional changes in the liver of Vistar rats with experimental obesity and correction of melatonin
S. V. Michurina, D. V. Vasendin, I. Yu. Ishchenko
Abstract. Experimental alimentary obesity leads to the significant changes of structural-functional organization of the liver, including infringement of blood circulation and lymph flow, the development in the parenchyma of body fat dystrophy. The introduction of such animals of pineal hormone melatonin promotes normalization of microcirculation processes and restoration of structural-functional organization of the liver.
Keywords: liver, obesity, melatonin, Vistar rats.
Michurina Svetlana ([email protected]), doctor of medical sciences, professor, chief researcher, Research Institute of clinical and experimental lymphology, Novosibirsk.
Vasendin Dmitry ([email protected]), candidate of medical sciences, associate professor, department of technospheric security, Siberian State Geodetic Academy, Novosibirsk.
Ishchenko Irina ([email protected]), candidate of biological sciences, senior researcher, Research Institute of clinical and experimental lymphology, Novosibirsk.
Поступила 23.01.2014
