CC BY
12УДК: 159.9:616-018.1-092+616.441.63 DOI: 10.29039/2224-6444-2022-12-4-23-28
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЕЛЫХ КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ СТРЕССА
Зима Д. В., Макалиш Т. П., Непритимова Е. А., Зяблицкая Е. Ю.
Центральная научно-исследовательская лаборатория, Институт «Медицинская академия имени С.И.
Георгиевского», ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», 295051, бульвар
Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Зяблицкая Евгения Юрьевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник
Центральной научно-исследовательской лаборатории, Институт «Медицинская академия имени С. И.
Георгиевского» ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», е-mail: [email protected]
For correspondence: Evgeniia Yu. Ziablitskaia, MD, Leading Researcher at the Central Research Laboratory,
Institute «Medical Academy named after S. I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Zima D. V., http://orcid.org/ 0000-0003-4732-0311
Makalish T. P., http://orcid.org/0000-0003-1884-2620
Nepritimova E. A., http://orcid.org/0000-0001-8989-3615
Zyablitskaya E. Yu., http://orcid.org/0000-0001-8216-4196
РЕЗЮМЕ
В статье представлены результаты экспериментального исследования структурно-функциональных изменений щитовидной железы самцов и самок белых крыс при моделировании иммобилизационного стресса и ограничении питания с дефицитом йода. При помощи исследования лейкоцитарной формулы крови, морфологических методик, иммуноферментного анализа гормонов в сыворотке установлена чувствительность щитовидной железы к действию стрессовых факторов. Отмечена динамика уровня кортизола, кортикостерона, тироксина, трийодтиронина и тиреотропного гормонов, подтверждающая максимальное напряжение щитовидной железы самок при адаптационных реакциях к стрессу. Структурные изменения при хроническом действии стрессовых факторов также зависимы от пола животных. Монофакторный стресс задерживает дифференцировку ткани щитовидной железы крыс, изменяет индекс пролиферации тироцитов: на 7 сутки он растет у самок (от 2,4% до 11,3%) и не меняется у самцов, а к 21-м суткам снижается до 1,3-1,5%, что сопровождается прогрессивным ростом экспрессии маркера апоптоза. Комбинированный стресс вызывает неравномерную дифференцировку щитовидной железы: среди участков незрелой ткани образуются гипертрофические фолликулы, на фоне прогрессивного роста экспрессии маркера апоптоза; у самок объем железы увеличивается на 30,2%.
Ключевые слова: стресс, щитовидная железа, морфология, пролиферация, апоптоз.
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHANGES IN THE THYROID GLAND OF WHITE RATS DURING STRESS MODELING
Zima D. V., Makalish T. P., Nepritimova E. A., Ziablitskaia E. Yu.
Institution «Medical Academy named after S.I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
The article presents the results of an experimental study of structural and functional changes in the thyroid gland of male and female white rats during the simulation of immobilization stress and restriction of nutrition with iodine deficiency. With the help of a study of the leukocyte formula of blood, morphological techniques, and enzyme immunoassay of hormones in serum, the sensitivity of the thyroid gland to the action of stress factors was established. The dynamics of the level of cortisol, corticosterone, thyroxine, triiodothyronine, and thyrotropic hormones were noted, confirming the maximum tension of the thyroid gland of females during adaptive reactions to stress. Structural changes in the chronic action of stress factors also depend on the sex of the animals. Monofactor stress delays the differentiation of thyroid tissue in rats, and changes the thyrocyte proliferation index: on day 7 it grows in females (from 2,4% to 11,3%) and does not change in males, and by day 21 it decreases to 1,3-1,5%, which is accompanied by a progressive increase in the expression of the apoptosis marker. Combined stress causes uneven differentiation of the thyroid gland: hypertrophic follicles are formed among areas of immature tissue, against the background of a progressive increase in the expression of the apoptosis marker; in females, the volume of the gland increases by 30,2%.
Key words: stress, thyroid gland, morphology, proliferation, apoptosis.
Высокая прогрессирующая заболеваемость хирургической патологией щитовидной железы, существенная доля рака среди узловых образований, вероятность техногенных катастроф и
дестабилизация ядерной энергетической отрасли в мире в XXI веке потенцируют дальнейший прирост заболеваемости и делают актуальными исследования патогенеза хирургической пато-
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
логии щитовидной железы. По данным Global Cancer Statistics 2020 рак щитовидной железы находится на первом месте среди опухолей эндокринной системы и у молодых людей его доля составляет 8-12% среди всех злокачественных новообразований [1-5].
Понимание патогенеза развития болезни и знание маркеров ранних патологических изменений дает ключ к профилактической и лечебной тактике врача, оценке риска возникновения патологи и ее прогрессии [6; 7]. Изучению роли стресса в возникновении тиреоидной патологии посвящено много работ, демонстрирующих комбинированное и изолированное действие стрессоров [8]. Показаны изменения структуры щитовидной железы при стрессе, имеющие тяжелые последствия, включая развитие аутоиммунного тиреоидита и рака. Иммуноморфо-логические исследования показывают неоднозначную связь структурных преобразований щитовидной железы при различных формах рака с динамикой пролиферации и апоптоза тироцитов [9]. Многие факторы патогенеза рака щитовидной железы вызывают оксидатив-ный стресс, который инициирует повреждения ДНК, онкотрансформацию тироцитов и поддерживает онкогенез [10]. Однако нет систематизированных данных, обобщающих роль стресса в инициации заболеваний щитовидной железы. Изменения ее структуры и функции при разных видах стресса мало детализированы в зависимости от пола и возраста, динамики клеточных популяций.
Целью нашего исследования являлась оценка структурно-функциональных изменений щитовидной железы белых крыс при моделировании стресса.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на 100 белых крысах линии Wistar, в работу взяли поровну самцов и самок в возрасте ранней половой зрелости с массой тела 150-160 г.
Крыс контрольной группы подвергали хенд-лингу во время ухода и взвешивания.
Для моделирования алиментарного стресса крыс на протяжении трех недель кормили прокаленным зерном и поили дистиллированной водой с добавлением 2 мг/л NaBr, не давая другого корма и воды. Таким образом, животные получали бедный по составу однообразный рацион и воду, бедную йодом и обогащённую его антагонистом бромом. Такой состав воды характерен для грунтовых вод западных районов и открытых источников пресной воды степной части Крыма, где концентрация брома превышает предельно допустимую (0,2 мг/дм3).
Гипокинетический стресс моделировали, помещая животных ежедневно на 20 часов в фиксаторы (animal restrainers) AE1001-R1 (ООО «НПК Открытая Наука», Россия). Данную модель можно назвать и иммобилизационным стрессом.
Комбинированный стресс - это продолжение эксперимента с алиментарным стрессом, когда животных, выдержавших три недели ограничения питания, подвергали фиксации в рестрей-нерах при тех же условиях, что и крыс группы с гипокинезией, не меняя рацион и состав воды.
Длительность острого стресса составила 7 суток, хронического - 21 сутки. На каждом этапе исследовали 10 животных - по 5 самок и 5 самцов. У крыс в динамике (1, 7, 14, 21 день) су-блингвально брали кровь для гематологического исследования и определения уровня гормонов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали анализатор Mythic 18 ("Orphee", Швейцария). На основании критериев Гаркави-Квакиной формула крови подтверждает стадию стресса. Коэффициент л/нс (соотношение лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов) показывает стресс-реакцию (<1), реакцию тренировки (1-2) и активации (2-4).
Для ИФА использовали анализатор Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США), наборы для определения кортизола «Кортизол-ИФА» К210; «Кортикостерон-ИФА» K210R, свободного и общего тироксина «СвТ4-ИФА», «Т4-ИФА», тиреотропного гормона ТТГ «ТТГ-ИФА», производитель ООО «Хема» (Россия).
Для морфологического исследования крыс выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Для гистологии использовано оборудование Leica (Германия, Австрия) и Millestone (Италия) - для преаналитического (вырезная станция, гистопроцессор LOGOS, микротом Leica RM 2255) и аналитического этапов работы (иммуногистостейнер BondMax, Микроскоп MD 2000 с цифровой камерой, сканер Aperio CS2 Leica), использованы расходные материалы Биовитрум (Россия), Leica (Германия). На парафиновых срезах толщиной 4 мкм проводили морфометрические исследования в программе ImageJ.
Динамика клеточной кинетики определена уровнем экспрессии маркера пролиферации Ki-67 (ММ1, Novocastra, Великобритания), мембранного маркера готовности клетки к апопто-зу FAS-R (ab 82419, Abcam, США, разведение 1:200). Оценку экспрессии ядерного маркера Ki-67 проводили методом подсчет всех имму-нопозитивных клеток при увеличении 400х в 10 полях зрения. Оценку маркера FAS-R с мембранной и цитоплазматической локализацией проводили полуколичественным методом.
При анализе количественных показателей использовали «MS Office - Excel», «STATISTICA -10.0», параметрические и непараметрические методы. Определяли форму и меру связи методом Спирмена. Внутригрупповые различия оценивали с помощью критерия Вилкоксона, между группами - Манна-Уитни. Исследования на крысах выполнены с соблюдением биоэтических международных и отечественных требований обращения с лабораторными животными.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показатели крови крыс при гипокинетическом и комбинированном стрессе лабильны, снижение индекса стресса (от 5,5 до 1,1-1,3 единиц) начинается со 2 недели и отражает успешность модели стрессирования животных (табл. 1). На 2-3 неделях показатели достигают значения реакции тренировки и стресс-реакции, изменяется уровень гормонов в крови. Алиментарный стресс не меняет изученные показатели, а эффект 21-дневного воздействия алиментарного стресса отражен в столбце «1 сутки комбинированного стресса». У интактных животных уровень тироксина зависит от пола, у самцов он ниже на 54,0% (табл. 2). При гипокинетиче-
Индекс пролиферации тироцитов имеет в целом отрицательную динамику, за исключением раннего периода гипокинетического стресса у самок, когда он на 7 сутки возрастает (от 2,4% до 11,3, при р<0,05), но в дальнейшем происходи его снижение до 1,3-1,5% при прогрессивном росте экспрессии FAS-R в изолированной и комбинированной модели стресса. Большинство параметров при алиментарном стрессе не меняются, в отличие от иммобилизационного. Изменение показателей индекса Ю-67 и FAS-R у экспериментальных животных указывает на роль стресса в развитии нарушения клеточной кинетики щитовидной железы, показывает механизм трансформации тироцитов преимущественно не за счет увеличения пролифератив-ной активности, свойственной другим видам эпителиальной ткани, а за счет ухода клетки от
ском стрессе у самцов и самок снижается уровень кортизола и повышается уровень кортико-стерона. У самок выявлена тенденция к росту тиреотропного гормона, при этом у самцов его уровень снижается в 2,0-6,0 раз (р<0,05), при этом уровень тироксина сохраняется в пределах контрольных цифр (5,6-12,5 нмоль/л).
В период 3-4 месяцев у крыс происходит дозревание ткани щитовидной железы. Стресс меняет структуру щитовидной железы крыс. На органном уровне у самок на 21 сутки комбинированного стресса выявлено увеличение объема щитовидной железы от 39,6±3,8 мм3 до 56,7±4,0 мм3 (р<0,05). Действие стресса на тканевом уровне проявлено у всех групп животных с 7-14 суток, с максимумом к 21 дню. При алиментарном стрессе органы 110-суточных крыс, выглядят как железы 90-суточных контрольных животных, у самцов задержка дифференцировки ткани щитовидной железы на фоне ограничения питания более выражена. Монофакторное воздействие вызывает задержку дифференцировки ткани, а комбинированный стресс меняет структуру щитовидной железы: вызывает неравномерную пролиферацию, образование фолликулов причудливой формы с изменением высоты тироцитов.
программируемой гибели путем внешней активации апоптоза и от надзора клеточного звена иммунной системы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Иммобилизационный стресс вызывает у крыс реакцию повышенной активации на 14-21 сутки, сопровождающуюся снижением уровня корти-зола в крови в 1,7-5,7 раз (р<0,05) и ростом кор-тикостерона. Комбинированный стресс к 21 дню вызывает стресс-реакцию со снижением уровня кортизола и ростом кортикостерона, сохранением выработки тироксина на уровне контрольных цифр (5,6-12,5 нмоль/л), при этом у самцов уровень тиреотропного гормона снижается в 2,0-6,0 раз (р<0,05), а у самок имеет тенденцию к росту. Монофакторный стресс задерживает диф-ференцировку ткани щитовидной железы крыс,
Таблица 1
Индекс Гаркави-Квакиной у крыс под действием стресса
Группа Исследуемая группа, длительность эксперимента
гипокинетический стресс комбинированный стресс
1 сутки 7 сутки 14 день 21 день 1 сутки 7 сутки 14 день 21 день
самцы 5,5±0,3 7,0±2,9* 2,9±0,5 2,9±1,2* 3,3±0,6 3,1±0,3^ 2,9±0,9 1,3±0,1*
самки 5,5±0,6А 9,4±2,2* 3,8±0,5 2,1±0,2* 4,8±0,3* 4,4±0,3А 2,2±0,2*^ 1,1±0,2*^
Примечания: достоверность при р<0,05: *- по отношению к 1 суткам; • - к группе с изолированным стрессом; ▲ - к группе крыс противоположного пола.
2022 т 12 № 4 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
Таблица 2
Динамика уровня гормонов в сыворотке крови крыс под действием стресса
Показатели (нг/мл) Исследуемая группа, длительность эксперимента
изолированный стресс комбинированный стресс
1 сутки (контроль фон) 7 сутки (острый стресс) 14 день (подострый стресс) 21 день (хронический стресс) 1 сутки (3 недели алимент. стресса) 7 сутки (острый стресс) 14 день (подостр^1й стресс) 21 день (хронический стресс)
самцы^
Кортизол 32,5± 7,4 5,7± 2,9* 10,0± 2,8* 10,9± 2,5* 38,7± 7,5 25,5± 4> 9,7± 2,4* 25,7± 4,1^
Кортико-стерон 213,0± 6,6 441,6± 22,1* 496,0± 35,3* 613,4± 6,1*А 239,4± 20,6 473,6± 10,2* 570± 9,3*А 622,8± 7,1*А
ТТГ 2,2± 0,5 2,1± 0,4 3,0± 0,6 2,8± 0,7 1,1± 0,2^ 1,9± 0,6 0,5± 0,U 1,2± 0,3
Т4 свободный 5,1± 1,5 7,4± 1,1 11,1± 0,9 7,0± 2,1 7,5± 0,9 5,6± 1,2 12,5± 1,8* 10,0± 2,8
Т4 общий 120,0± 7,6 110,12± 7,4 105,4± 8,2 100,4± 7,6 119,4± 5,9 109,9± 7,1 101,9± 5,3 99,3± 4,4
самки9
Кортизол 33,1± 3,4 5,8± 3,0* 19,3± 3,8* 18,0± 2,4* 24,8± 1,2А^ 11,1± 3,5А* 13,5± 2,7* 23,3± 1,4
Кортико-стерон 206,0± 7,15 438,6± 16,7* 472,4± 29,1* 530± 29,5* 208± 6,7 463,3± 8,1* 502± 25,8* 576,2± 10,6*
ТТГ 1,2± 0,3 1,4± 0,3 3,6± 1,4 0,76± 0,1А 2,7± 1,3 0,9± 0,2 1,5± 0,4 2,2± 0,6
Т4 свободный 11,0± 0,8А 11,0± 1,5 11,0± 1,6 11,0± 0,7 7,5± 1,3 9,4± 1,0 11,9± 0,8* 9,4± 2,3
Т4 общий 116,7± 9,8 105,1± 7,8 98,2± 5,7 90,1± 5,26 123,4± 9,1 115,9± 6,2 108,2± 6,1 103,1± 7,8
Примечания: достоверность при р<0,05: *- по отношению к 1 суткам; • - к группе с изолированным стрессом; ▲ - к группе крыс противоположного пола.
изменяет индекс пролиферации тироцитов: на 7 сутки он растет у самок (от 2,4% до 11,3%, р<0,05) и не меняется у самцов, а к 21-м суткам снижается до 1,3-1,5%, что сопровождается прогрессивным ростом экспрессии маркера апоптоза. Комбинированный стресс вызывает неравномерную дифференцировку щитовидной железы: среди участков незрелой ткани образуются гипертрофические фолликулы, на фоне прогрессивного роста экспрессии рецепторов апоптоза; у самок объем железы увеличивается на 30,2% (р<0,05). На наш взгляд это пример зо-бооразования у животных под действием стресса. Данные результаты актуальны для проверки гипотезы изменения исследуемых маркеров в клинике при пролиферативных и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке в рамках государственного задания № FZEG-2020-0060 Минобрнауки России в сфере научной деятельности темы «Алгоритмы молекулярно-генетической диагностики злокачественных новообразований и подходы к их таргетной терапии с применением клеточных и генетических технологий».
Funding. This work was financially supported by state task No FZEG-2020-0060 of the Russian Ministry of Science in the field of scientific research on the topic «Algorithms for molecular-genetic diagnosis of malignant neoplasms and approaches
to their targeted therapy using cellular and genetic technologies».
ЛИТЕРАТУРА
1. Bray F., Laversanne М., Weiderpass Е., Soerjomataram I. The ever-increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide. Cancer. 2021;127(16):3029-3030. doi: 10.1002/cncr.33587
2. World Health Organization (WHO). Global Health Estimates 2020: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2019. - WHO, 2020. Accessed December 11, 2020. - who.int/ data/gho/data/themes/mortality-and-global-health-estimates/ghe-l.
3. Sung H., Ferlay J., Siegel R. L., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A , Bray F. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209-249. doi:10.3322/caac.21660
4. Безруков О. Ф. Узловой зоб в крымском регионе: этиологические проблемы и перспективы диагностики. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2011;3-4:171- 178.
5. Каприн А. Д., Старинский В. В., Шахза-дова А. О. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность). Москва: МНИОИ им. П. А. Герцена -филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. - 252 с.
6. Глушаков Р. И., Козырко Е. В., Соболев И. В., Ермолова С. А., Власьева О. В., Кузин А. А., Тапильская Н. И. Заболевания щитовидной железы и риск возникновения нетиреоидной патологии. Казанский медицинский журнал. 2017;98(1):77-84. doi:10.17750/KMJ2017-7
7. Ромащенко П. Н., Майстренко Н. А., Кри-волапов Д. С., Симонова М. С. Инновационные технологии в диагностике и безопасном хирургическом лечении заболеваний щитовидной железы. Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2022;24(1):9-15. doi: 10.17816/ brmma73249
8. Asif F. Noor-Ul-Amin М., Ahmad M. R. Identification of the risk factors of the thyroid cancer by using logit model in Lahore. Pakistan Journal of Pharmacutical Science. 2018;31(6):2391-2396. doi: 10.7314/APJCP.2015.16.15.6243
9. Cruz A. C., Ramaswamy M., Ouyang C., Klebanoff C.A., Sengupta P., Yamamoto T.N., Meylan F., Thomas S. K., Richoz N., Eil R., Price S., Casellas R., Rao V. K., Lippincott-Schwartz J., Restifo N. P., Siegel R. M. Fas/CD95 prevents autoimmunity independently of lipid raft localization and efficient apoptosis induction.
Nat Commun. 2016;23;7:13895. doi: 10.1038/ ncomms13895.
10. Liu H., Hou C., Zeng Q., Zhao L., Cui Y., Yu L., Wang L., Zhao Y., Nie J., Zhang B., Wang A. Role of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in rat thyroid toxicity caused by excess fluoride and/or iodide. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2016;46: doi: 10.1016/j. etap.2016.08.007277-285.
REFERENCES
1. Bray F., Laversanne M., Weiderpass E., Soerjomataram I. The ever-increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide. Cancer. 2021;127(16):3029-3030. doi: 10.1002/cncr.33587
2. World Health Organization (WHO). Global Health Estimates 2020: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2019. - WHO, 2020. Accessed December 11, 2020. - who.int/ data/gho/data/themes/mortality-and-global-health-estimates/ghe-l.
3. Sung H., Ferlay J., Siegel R. L., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A , Bray F. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209-249. doi:10.3322/caac.21660
4. Bezrukov O. F. Nodular goiter in the Crimean region: etiological problems and diagnostic prospects. Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2011;3-4:171- 178. (In Russ.).
5. Kaprin A. D., Starinsky V. V., Shakhzadova A. O. Malignant neoplasms in Russia in 2020 (morbidity and mortality). Moscow: MNIOI im. P. A. Herzen - branch of the Federal State Budgetary Institution «NMITs Radiology» of the Ministry of Health of Russia, 2021. - 252 c. (In Russ.).
6. Glushakov R. I., Kozyrko E. V., Sobolev I. V., Ermolova S. A., Vlaseva O. V., Kuzin A. A., Tapilskaya N. I. Thyroid diseases and risk of non-thyroidal pathology. Kazan medical journal. 2017;98(1):77-84. (In Russ). doi:10.17750/ KMJ2017-7
7. Romashchenko P. N., Maystrenko N. A., Krivolapov D. S., Simonova M. S. Innovative technologies in the diagnosis and safe surgical treatment of thyroid diseases. Bulletin of the Russian Military Medical Academy. 2022;24(1):9-15. (In Russ.). doi: 10.17816/brmma73249.
8. Asif F. Noor-Ul-Amin M., Ahmad M. R. Identification of the risk factors of the thyroid cancer by using logit model in Lahore. Pakistan Journal of Pharmacutical Science. 2018;31(6):2391-2396. doi: 10.7314/APJCP.2015.16.15.6243.
9. Cruz A. C., Ramaswamy M., Ouyang C., Klebanoff C.A., Sengupta P., Yamamoto T.N.,
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
Meylan F., Thomas S. K., Richoz N., Eil R., Price S., Casellas R., Rao V. K., Lippincott-Schwartz J., Restifo N. P., Siegel R. M. Fas/CD95 prevents autoimmunity independently of lipid raft localization and efficient apoptosis induction. Nat Commun. 2016;23;7:13895. doi: 10.1038/ ncomms13895.
10. Liu H., Hou C., Zeng Q., Zhao L., Cui Y., Yu L., Wang L., Zhao Y., Nie J., Zhang B., Wang A. Role of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in rat thyroid toxicity caused by excess fluoride and/or iodide. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2016;46: doi: 10.1016/j. etap.2016.08.007277-285.
