CC BY
45
ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.35 : 568.6 : 618.2 : 612.015.3
Е. Г. Скуридина, Н. П. Бгатова
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕЧЕНИ ПОТОМСТВА ПРИ ОТСУТСТВИИ БЕЛКА ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В РАЦИОНЕ КРЫС В ПЕРИОД БЕРЕМЕННОСТИ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск
В эксперименте методом электронной микроскопии изучена структурная организация печени крысят в возрасте 2 дней при дефиците белка в рационе беременных самок крыс. Показано, что в печени 2-дневных детенышей наблюдаются структурные изменения, свидетельствующие о снижении интенсивности метаболических процессов: уменьшение объемной и численной плотности клеток кроветворного ряда, снижение объемной и численной плотности митохондрий, численной плотности рибосом в цитоплазме гепатоцитов. Происходит значительное накопление липидов и гликогена, что может в дальнейшем способствовать развитию стеатоза печени.
Ключевые слова: печень, ультраструктура, низкобелковое питание, беременность, метаболический синдром.
Условия протекания беременности могут оказывать влияние не только на внутриутробное развитие, но и на всю постнатальную жизнь потомства. В частности, было отмечено, что повышенный риск развития метаболического синдрома (ожирение, гипертония, сахарный диабет второго типа) у потомства связан с недостатком белка в рационе матери во время беременности [1]. На основе этих наблюдений и экспериментальных данных была предложена гипотеза «экономичного фенотипа» [2, 3], согласно которой при недостатке белка в рационе в период беременности в организме детеныша развиваются адаптивные изменения, приспосабливающие его не только к текущему, но и к последующему дефициту белка, однако «расплатой» за эту адаптацию оказывается метаболический синдром [4]. Исследования на животных подтверждают, что предрасположенность к развитию метаболического синдрома имеет в большей степени фенотипическую, а не генотипическую природу [1, 5]. Известно, что метаболические перестройки в организме плода при дефиците белка в рационе матери связаны с увеличением количества рецепторов к глюко-кортикоидам в печени, почках, легких, стенках кровеносных сосудов. Это может являться причиной развития гипертонии в дальнейшей жизни
[6]. В почках изменяется баланс экспрессии рецепторов различных типов к ангиотензину [7]. В поджелудочной железе снижается относительная масса р-клеток, изменяется экспрессия генов ферментов печени, а также активность многих пищеварительных ферментов: увеличивается активность сахаразы и уменьшается активность щелочной фосфатазы и аминопептидазы М [8]. Однако морфологический аспект данной проблемы изучен недостаточно.
Целью данной работы является исследование морфологических изменений печени, имеющих место в раннем постэмбриональном периоде, при дефиците белка в рационе матери. Исследовалась структурная организация печени крысят в возрасте 2 сут.
Материал и методы
Беременные крысы были разделены на 2 группы. Первая группа (п=5) в течение всей беременности и лактации получала стандартный рацион, вторая (п=5) — низкобелковый. В стандартный рацион входила овсяная каша с добавлением различных круп (овса, проса, пшеницы и подсолнечника), мясной фарш, рыбий жир и соль (состав рациона утвержден приказом министра здравоохранения СССР № 1179 от 10.10.1983 г). При низкобелковом питании из рациона был исключен белок живот-
ного происхождения (фарш) при сохранении общего веса корма (40 г в сутки на одно животное). Крысы имели неограниченный доступ к воде. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Объектом исследования была печень 2-дневных крысят как центральный орган метаболизма. Исследовали по 5 животных от каждой группы, по одному от каждого помета. Забой осуществлялся путем быстрой декапитации.
Образцы печени фиксировали в 1 %-м растворе OsO4 на фосфатном буфере (рН=7,3), проводили по спиртам возрастающей концентрации и заключали в эпон.
Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидино-вым синим, монтировали на предметное стекло и заключали в канадский бальзам. В дальнейшем срезы изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки для исследования на электронно-микроскопическом уровне. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, цитратом свинца и изучали под электронным микроскопом. При морфометрическом исследовании цитоплазмы гепатоцитов определяли объемные и численные плотности митохондрий, пероксисом, первичных и вторичных лизосом, фагосом и аутофагосом, секреторных пузырьков; объемные и поверхностные плотности шероховатой и гладкой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи; численные плотности прикрепленных и свободных рибосом, а также свободных рибосом, собранных в полисомы, объемные плотности гликогена и липидных включений. Исследование этих параметров позволяет оценить состояние белково-синтети-ческого аппарата гепатоцитов, их секреторной функции и энергетической системы.
Морфометрию печени под световым микроскопом и цитоплазмы гепатоцитов на электронно-микроскопическом уровне проводили вручную стандартными методами. На светооптическом уровне использовались окуляр-микрометр и окулярная сеточка при конечном увеличении х1 000; на электронно-микроскопическом уровне
применялась квадратная тестовая система при конечном увеличении х48 000.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel и Statistica. Для каждого параметра рассчитывали средние значения и ошибку среднего значения. Межгрупповые значения определяли по t-кри-терию Стьюдента для р>95, 99, 99,9%.
Результаты исследования
Взвешивание животных показало, что масса крысят группы низкобелкового питания была снижена на 14,6 % по сравнению с контролем (р>99,9 %). Эти результаты согласуются с литературными данными о снижении массы детенышей при недостатке белка в рационе матери [9].
В печени крысят 2-дневного возраста гепа-тоциты не образовывали выраженных балок, характерных для печени взрослых животных. В пространствах Диссе и просветах синусоидов было отмечено большое количество кроветворных клеток, в основном предшественников эритроцитов на разных стадиях развития (рис. 1).
При низкобелковом питании крыс в печени крысят наблюдалось снижение объемных и численных плотностей гемопоэтических клеток на 29,41 % (р>95%). Островки кроветворения обычно имели небольшие размеры (рис. 2). Почти в 2 раза снизились объемная и численная плотности макрофагов (р>99,9 %). Синусоиды выглядели пустыми и расширенными. Объемная плотность просветов синусоидов, не занятых кроветворными клетками, возросла на 49 % (р>99,9 %) (рис. 3).
Ядерно-цитоплазматическое отношение гепатоцитов крысят группы низкобелкового питания составило 0,12±0,01, т. е. осталось на том же уровне, что и в контроле (0,13±0,01). Средний объем гепатоцитов увеличился на 25 % (р>99,9 %).
Структурная организация цитоплазмы гепатоцитов животных контрольной группы свидетельствовала об интенсивном протекании метаболических процессов (рис. 4). Плотность расположения органоидов была высокой. Отмечалось большое количество митохондрий округлой или овальной формы, окруженных цистернами гранулярной эндоплазматической сети, комплекс Гольджи включал большое количество везикул. Гликоген располагался мелкими группами, его объемная плотность составила
Рис. 1. Структурная организация печени крысят 2-дневного возраста контрольной группы (окраска толуидиновым синим, об. х40, ок. х10). Крупные островки кроветворения в просветах синусоидов и пространствах Диссе. Гепатоциты не образуют выраженных балочных структур
Рис. 2. Структурная организация печени крысят 2-дневного возраста группы низкобелкового питания (окраска толуидиновым синим, об. х40, ок. х10). Уменьшение размеров островков кроветворения, увеличение объема синусоидальных пространств, не занятых клетками, накопление в цитоплазме гепатоцитов липидов и гликогена
16 14 12 ä?10
S8 6
4
2
О
Г-Ь Г+Ш
1 TI
Низкобелковое питание
Контроль
□ Просветы синусоидов
□ Синусоидальные клетки ■ Кроветворные клетки
Рис. 3. Объемные плотности синусоидов, кроветворных и синусоидальных клеток в печени крысят 2-дневного возраста (* - р>95 %, ** - р>99 %, *** - р>99,9 %. Отрезками обозначена ошибка среднего)
20 18 16 ^14 .12 ¿10 8 6 4 2 0
■
**
I
Контроль Низкобелковое питание
□ Липидные включения ■ Гликоген
Рис. 5. Объемные плотности липидов и гликогена в гепатоцитах крысят 2-дневного возраста (* - р>95 %, ** - р>99 %, *** - р>99,9 %. Отрезками обозначена ошибка среднего)
- ^нша я
■
■ :
Я
шщ
Шш z
Рис. 4. Структурная организация цитоплазмы гепатоцитов крысят 2-дневного возраста контрольной группы
Рис. 6. Структурная организация цитоплазмы гепатоцитов крысят 2-дневного возраста группы
низкобелкового питания. Обилие липидных включений и редко расположенные органоиды
6,19±0,96 %, липидов было немного, их объемная плотность составила 2,54±0,68 %.
При содержании беременных крыс на низкобелковом рационе в гепатоцитах 2-дневных крысят наблюдалось снижение суммарной объемной плотности цитоплазматических органоидов. Объемная плотность липидных включений возросла почти в 7 раз по сравнению с контролем, объемная плотность гликогена — в 2 раза (рис. 5, 6). Крупные липидные включения и большие скопления гликогена в гепатоцитах были видны не только на электронно-микроскопическом, но и на светооптическом уровне.
Митохондрии имели разнообразную форму, их размеры увеличились на 44 % (р>99,9 %), однако объемная плотность была ниже контрольного уровня на 27 % (р>99,9 %), почти в 2 раза снизилась численная плотность митохондрий (р>99,9 %). Снизились объемная и поверхностная плотности гранулярной эндоплаз-матической сети (гЭПС), численные плотности прикрепленных, свободных и полисомальных рибосом. Просветы ЭПС часто были расширены. Объемная плотность лизосомальных структур уменьшилась более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Снизились объемная (на 62,5 %) и поверхностная (на 49 %) плотности цистерн и везикул комплекса Гольджи (в обоих случаях р>99,9 %). Среди гепатоцитов крысят группы низкобелкового питания отмечали клетки с расширенными элементами гЭПС, участками «пустой» цитоплазмы, набухшими митохондриями с просветленным матриксом и небольшим количеством крист (см. рис. 6).
Обсуждение
Согласно данным литературы при дефиците белка в рационе в гепатоцитах половозрелых животных возрастает содержание аутофагосом и аутофаголизосом, что, по-видимому, связано с компенсацией недостатка пищевого белка структурными белками организма [10]. В нашем исследовании в гепатоцитах крысят группы низкобелкового питания содержание лизосо-мальных структур было ниже контрольного уровня. Можно предположить, что недостаточное поступление белка компенсировалось за счет материнского организма либо происходило снижение потребностей детеныша в протеинах как источнике энергии (экономный фенотип).
Момент рождения является стрессом для детеныша. Радикально изменяются условия его
существования. Начинают самостоятельно функционировать дыхательная, пищеварительная и выделительная системы, возникает необходимость поддерживать температурный гомеостаз. Адаптация к новым условиям приводит к резкому возрастанию потребления энергии, поэтому в течение первых суток из гепатоцитов животных в норме полностью исчезает гликоген [11]. На вторые сутки в печени вновь начинается его накопление. В группе низкобелкового питания было отмечено значительно большее содержание гликогена и липидов в гепатоцитах крысят, чем в стандартных условиях, что может свидетельствовать о замедленном обмене веществ у этих животных. На это же указывает снижение объемной и численной плотностей митохондрий, гранулярной ЭПС и рибосом.
Увеличение размеров митохондрий гепатоци-тов, видимо, обусловлено снижением частоты их деления вследствие недостатка «строительного материала» — белка. Другими исследователями [12] было отмечено, что при содержании крыс на низкобелковом рационе в печени потомства снижается количество митохондриальной ДНК, что также свидетельствует о снижении их про-лиферативной активности.
Заключение
При дефиците белка в рационе крыс в период беременности в печени 2-дневных детенышей наблюдаются структурные изменения, свидетельствующие о снижении интенсивности метаболических процессов: уменьшение объемной и численной плотности клеток кроветворного ряда, снижение объемной и численной плотностей митохондрий, численной плотности рибосом в цитоплазме гепатоцитов. Происходит значительное накопление липидов и гликогена, что может в дальнейшем обусловить развитие стеатоза печени.
LIVER ULTRASTRUCTURE IN NEWBORN OFFSPRIG EXPOSED TO ABSENCE OF MATERNAL DIETARY ANIMAL PROTEIN INTAKE DURING PREGNANCY IN RATS
E. G. Skuridina, N. P. Bgatova
The structural organization of a 2-days-old rat offspring's liver at low-protein diet during pregnancy has been studied by methods of electron microscopy. It has been shown that protein malnutrition during pregnancy results in struc-
tural changes testifying to decrease of intensity of metabolic processes in offspring's liver: decrease in volumetric and numerical density of developing blood cells, decrease in volumetric and numerical density of mitochondria, numerical density of ribosomes. Significant accumulation of lipids and glicogen in hepatocytes also can be consequence of delay of metabolic processes, and promote in the further to development a liver steatosis.
Литература
1. Barker D. J. P., Eriksson J. G., Forsen T., Osmond C. Fetal origins of adult disease: strength of effects and biological basis // Intern. J. Epidemiol. - 2002. - Vol. 31. -P. 1235-1239.
2. Hales C. N., Ozanne S. E. The dangerous road of catch-up growth // J. Physiol. - 2003. - Vol. 541, -№ 1. - Р. 5-10.
3. Hales C. N., Barker D. J. P. Type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus: the thrifty phenotype hypothesis // Diabetologia. - 1992. - Vol. 35. - P. 595-601.
4. Holness M. J., Fryer L. G., Priestman D. A., Sug-den M. C. Moderate protein restriction during pregnancy modifies the regulation of triacylglycerol turnover and leads to dysregulation of insulin's anti-lipolytic action // Mol. Cell. Endocrinol. - 1998. - Vol. 142, - № 1/2. -P. 25-33.
5. Yajnik C. S. Early life origins of insulin resistance and type 2 diabetes in India and other asian countries // J. Nutr. - 2004. - Vol. 134, - № 1. - Р. 205-210.
6. Bertram C. E., Trowern A. R., Copin N., et al. The
maternal diet during pregnancy programs altered expression of the glucocorticoid receptor and type 2 11beta-hydroxyster-oid dehydrogenase: potential molecular mechanisms underlying the programming of hypertension in utero // Endocrinology. - 2001. - Vol. 142, - № 7. - P. 2841-2853.
7. McMullen S., Langley-Evans S. C. Maternal low-protein diet in rat pregnancy programs blood pressure through sex-specific mechanisms // Amer. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2005. - Vol. 288. - P. 85-90.
8. Тимофеева Н. М., Никитина А. А., Егорова В. В., Гордова Л. А. Влияние дефицита белка в питании крыс в раннем онтогенезе на функционирование ферментных систем пищеварительных и непищеварительных органов во взрослой жизни // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2004. - Т.138, - № 7. - C. 12-15.
9. Muaki S. M., Underwood L. E., Selvais P. L., et al. Maternal protein restriction early or late in rat pregnancy has differential effects on fetal grows, plasma insulin-like grows factor-1 (IGF-1) an d liver IGF-1 gene expression // Grows Regul. - 1995. - Vol. 5, - № 3. - Р. 125-132.
10. Бгатова Н. П., Шорина Г. Н., Шимек И. и др. Структурные изменения в паренхиме печени крыс при длительном содержании на диетах с различным содержанием белка // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1986. - № 5. - C. 556-559.
11. Калашникова М. М. Характеристика морфологической дифференцировки гепатоцитов животных разных классов в онтогенезе в зависимости от особенностей питания // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1997. -Т. 123. - № 1. - C. 4-10.
12. Park K. S., Kim S. K., Kim M. S., et al. Fetal and early postnatal protein malnutrition cause long-term changes in rat liver and muscle mitochondria // J. Nutr. - 2003. -Vol. 133, - № 10. - P. 3085-3090.
