CC BY
16УДК 616.31-089:616.6:611-018.4:615.21:616-092.9
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НЕФРОНОВ ПОЧЕК ЛАБОРАТОРНЫХ БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТОВ АМИНОФОСФОНАТНОЙ И АМИНОБИСФОСФОНАТНОЙ ГРУПП
С.О. Мостовой1, В.С. Пикалюк2, В. Ф.Шульгин3
^остовойСемен Олегович, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», Таврическая академия (структурное подразделение), старший научный сотрудник отдела организации научной работы, кандидат медицинских наук.
2Пикалюк Василий Степанович, заведующий кафедрой нормальной анатомии, доктор медицинских наук, профессор e-mail: pikaluk@ukr.net
3Шульгин Виктор Федорович заведующий кафедрой общей и физической химии, доктор химических наук, профессор. e-mail: shulvic@gmail.com
Для корреспонденции: 295007, пр. академика Вернадского, д. 4, г.Симферополь, Республика Крым, Россия.
e-mail: Semen-34@yandex.ru
РЕЗЮМЕ
В статье представлены особенности 3-х месячного воздействия веществ: медицинского препарата «Памиред» аминобисфосфонатной природы и соединения, моделирующего примесь, содержащейся в кустарно изготовленном метамфетамине, имеющего аминофосфонатную природу, на структурную организацию нефронов лабораторных белых крыс.
Использовались методы световой микроскопии, включающие качественные и количественные показатели, характеризующие структурное состояние почечных телец с отходящими от них канальцами. Установлены нефротоксические свойства памидроновой кислоты, проявляющиеся в преимущественным поражении тубулярного аппарата и аминофосфонатной примеси, образующейся при кустарном изготовлении метаамфитамина, проявляющейся в преимущественном поражении гломерулярного аппарата.
Ключевые слова: почки, аминобисфосфонаты, аминофосфонаты, нефротоксичность.
NEFRON RESTRUCTURATION IN KIDNEYS OF WHITE LABORATORY RATS EXPERIENCED WITH AMINOPHOSPHONATES AND AMINOBISPHOPHONATES
TREATMENT
SUMMARY
The most important features of 3-month influence of aminobisphosphonate medical drug Pamired and drug that simulates an admixture in clandestine-productioned methamphetamine (aminophospho-nate) on nephron restructuration in kidneys of white laboratory rats are present in the article.
Methods of light microscopy that included qualitative and quantitative indicators to characterize structural condition of nefrones. Nephrotoxicity of pamidronic acid as affection of renal tubular structures and nephrotoxicity of aminophosphonate admicture in clandestine-productioned methamphetamine as affection of renal glomerular structures.
Key words: renal toxicity, nefron, aminophosponates, aminobisphosphonates.
Среди многих проблем стоящих перед российским обществом - проблема наркомании как глобальная угроза здоровью населения страны и национальной безопасности занимает одно из первых мест. На фоне борьбы с незаконным распространением наркотических и психотропных веществ растёт приём кустарно изготовленных веществ, а следовательно и растёт количество дополнительных токсических эффектов, возникающих в результате воздействия побочных примесей, образующихся в процессе упрощенного синтеза наркотических веществ. Одним из таких продуктов является кустарно изготовляемое психотропное вещество метаамфитамин «Винт», в результате синтеза которого одной из основных примесей, содер-
жащихся в исходном продукте, являются ами-нофосфоновые кислоты, в группу которых входят аминобисфосфонаты [1]
Учитывая высокие дозы приёма этого вещества наркозовисивыми ли чностями, растёт масса атипичных заболеваний связанных с действием примесей, таких к примеру, как остеомиелиты челюстей [2,3,4]. Имеются экспериментальные исследования, говорящие о нефротоксичности примесей присутствующих в кустарно изготовленном метаамфетамине [1,5].
Целью настоящего исследования явилась оценка степени воздействия веществ, моделирующих примеси, содержащихся в кустарно изготовленном метамфетамине, имеющих ами-нофосфонатную природу и аминобисфосфоната
«Памиред» на структурную организацию неф-ронов почек лабораторных белых крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент поставлен на 30 лабораторных белых крысах массой 180-200г, которые были разделены на 3 группы:
1. Первую, контрольную (плацебо) группу составили животные, которым для равноценных условий опыта в течение 3-х месяцев производили внутрижелудочное введение 1,0 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки и внутри-брюшинное введение 1,0 мл физиологического раствора 1 раз в сутки.
2. Вторую группу составили животные, которым на протяжении 3-х месяцев производили внутрибрюшинное введение препарата аминобиcфосфонатной группы "Памиред" в дозе 63 мг/кг и внутрижелудочное введение 1,0 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки.
Доза рассчитывалась следующим образом. Изначально определили среднюю пероральную дозу используемую наркоманами в процессе «марафона», доходящую до 700 мг в сутки [6], которая в пересчете 1 кг взрослого человека (70 кг) составила 10 мг на 1 кг. С учётом видовых различий в скорости метаболизма между организмом человека и крыс, определяли дозу животного по формуле, которая включает константу биологической активности:
ED (эффективная доза крысы) = [R (крысы) x ED (эфективная доза человека); мг / кг] R(человека)
где R (крысы) = 3,62 - коэффициент видовой резистентности крыс, R(человека) = 0,57 -коэффициент видовой резистентности для человека [7].
3. Третью группу составили животные, которым на протяжении 3-х месяцев производили внутрижелудочное введение вещества, моделирующего примеси, возникающие при изготовлении метаамфитамина кустарным способом, имеющих аминофосфоновую природу в дозе аналогичной второй группе животных и внут-рибрюшинное введение 1,0 мл физиологического раствора 1 раз в сутки.
Животных выводили из эксперимента в соответствии с правилами проведения работ с экспериментальными животными [8] под кета-миновым наркозом из расчёта 44 мг/кг (доза рассчитана с учётом видовых различий) на 90-е сутки путём декапитации. Материалом для исследования служили почки исследуемых животных, фиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине более 72 часов. Далее осуществляли проводку с использованием изо-пропанола и минерального масла и заливали ткани парафином [4,13]. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм резали на ротационном микротоме Leica RM2245 лезвиями Surgipath DB80LX. Срезы окрашивали гематоксилин-
эозином и по Массону. Микро-морфометрическое исследование проводили на компьютерном морфометрическом комплексе, в состав которого входят: микроскоп Olympus СX-31, цифровая камера Olympus C5050Z при увеличениях 100, 400, 1000.
Проводили полуколичественную и количественную оценку степени поражения исследуемых тканей. Подсчитывали количество клубочков на площадь среза, среди них количество поражённых и склерозированных. Определяли площадь сосудистых клубочков и площадь капиллярных петель. Оценивали степень лимфо-гистиоцитарной инфильтрации и степень деструкции канальцевой системы (полуколичественными методами).
Для обработки данных мы использовали сертифицированное программное обеспечение компании - StatSoft, Inc. (2008). STATISTICA (data analysis software system), version 8.0. www.statsoft.com. Достоверность мы определяли на основании критерия Стьюдента (уровень значимости р < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Почки практически всех животных контрольной группы имеют нормальную структурную организацию органа. Отчетливо обозначены корковое и мозговое вещество почечной паренхимы. Клубочки коры представлены капиллярными петлями, заключенными в эпителиальные капсулы со слегка различимыми просветами. Почечные тельца представлены капиллярными клубочками, расположенными между ними мезангиальными клетками, париетальным и висцеральным листками капсулы нефрона и мочевым пространством. В области мочевого полюса мочевое (боуменово) пространство переходит в проксимальный извитой каналец, выстланный однослойным плоским эпителием. В области ворот органа наблюдаются участки переходного эпителия лоханок, крупные кровеносные сосуды. Между почечными тельцами выявлялись проксимальные и дистальные почечные канальцы с типичной структурой. Между проксимальными канальцами выявляли в значительно меньшем количестве поперечные срезы дистальных извитых канальцев. Мозговое вещество представлено почечными пирамидами, ограниченных, кортикальными столбами, содержащих собирательные трубочки и прямые участки нефронов, в которых визуализировали единичные тонкие сегменты петли Генле. (Таб 1)
В микропрепаратах второй группы животных отмечали нарушение структурной организации коркового и мозгового вещества почечной паренхимы. Выявляли экстракапиллярные продуктивные изменения клубочков в виде пролиферации и десквамации эпителия боуме-новой капсулы с образованием из клеточных
масс "полулуний," прилегающих к сосудистым клубочкам. В просвете капсулы также отмечали отложение фибриновых масс, которые сдавливают клубочек, что приводит к малокровию и запустеванию сосудов клубочка. В пораженных клубочках отмечается расширение и интерпозиция мезангия за счёт избыточной пролиферации мезангиоцитов и накопления мезангиально-го матрикса, наличие утолщения и расщепления базальной мембраны капилляров. Сосуды, окружающие капсулу клубочка, резко расширены и полнокровны с явлениями плазморрагии. В отдельных участках коркового вещества на месте клубочков регистрировали единичные кис-тозно-расширенные полости, напоминающие ретенционные кисты с гомогенным розовым содержимым в просвете, образовавшиеся, по-видимому в результате компрессии канальца. Данные электронной микроскопии также подтвердили наличие мезангиальной интерпозиции с пролиферацией мезангиальных клеток; с неравномерным утолщением базальной мембраны, прилегающими к ней в отдельных участках электронно-плотными депозитами и гиперплазию подоцитов с деструкцией их отростков. Данные морфометрического анализа показывают уменьшение площади клубочка и его капилляров в 1,4 и 2,2 раза соответственно. В отдельных участках коркового вещества отмечаются
очаги фибриноидного некроза. Количество пораженных клубочков составляет 40,43% от площади среза (см. рис. 1А, В; табл. 1). Изменения клубочков сочетаются с тубуло-интерстициальными поражениями в виде диффузной (вакуольно-зернистой) дистрофии эпи-телиоцитов, а в проксимальных и дистальных извитых канальцах вплоть до некроза эпителия канальцев. В их просветах определяются аморфные массы, образовавшиеся, вероятно, как за счёт десквамации эпителия канальцев и отложений фибрина. В большинстве канальцев слущивание эпителиоцитов приводит к оголению базальных мембран, стенки которых утолщены. Отмечается полиморфизм в структуре проксимальных и дистальных канальцев. Группы канальцев с расширенным за счёт атрофии и уплощения эпителия просветом чередуются с канальцами с уменьшенными просветами вследствие набухания некротизированного эпителия в отдельных участках. Наблюдается разрушение стенок и слияние канальцев между собой. В интерстиции при окрашивании по методу Массона регистрировали очаговые разрастания коллагеновых волокон ярко- синего цвета. Между канальцами выявляются круглоклеточные лимфоцитарные инфильтраты с гистиоцитарным венчиком по периферии(см. рис.1 В, С; табл. 1) .
Рисунок 1. Микрофото отделов нефрона почек крыс. А - Околоклубочковый сосуд с явлениями плазморрагии. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение. 200. В - Ретенционная киста с эозино-фильным содержимым в просвете. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 400 С - Дистрофия и некроз эпителия канальцев Окраска Массон. Увеличение. 400. D - Интерпозиция мезангиоцитов к периферии капиллярной петли гломерулы, эллектронно плотный депозит (прилегает к мезангиоциту крайнему справа).Увеличение 6000. Е - Утолщение и деформация мембраны каппиляра. Увеличение
8000.
В микропрепаратах третьей группы животных отмечаются максимально выраженные яв-
ления нарушения структурной организации нефрона. Увеличенные в размерах клубочки
"лапчатой" формы за счет избыточной пролиферации эндотелия и мезангиоцитов чередуются с клубочками уменьшенных размеров с фокальными явлениями склероза. Количество пролиферирующих клубочков составляет 68,11% от пощади среза, клубочков с явлениями склероза составляет 14,8%. от площади среза. Ряд почечных телец характеризуется увеличением полости капсулы нефрона за счёт сращения капилляров клубочка с капсулой и образованием полулуний (адгезия и очаговая синехия нефронной капсулы), или за счёт выпадения фибринозного выпота. В результате расширения пространства капсулы нефрона на одном из полюсов отдельные гломерулы приобретают грушевидную форму. Большинство клубочков характеризуется наличием утолщения базальной мембраны эндотелия капилляров. При окраске по Массону выявляются фокусы склероза в различных сегментах пораженных клубочков. В отдельных почечных тельцах отмечаем десква-мацию эпителия в просвет капсулы. Сосудистый компонент так же разнообразен. В клубочках с явлениями избыточной пролиферации он представлен увеличенным просветом петель, в результате чего площадь капилляров клубочка
увеличилась в 1,4 раза. В клубочках с явлениями склеротических изменений сосудистый компонент представлен капиллярами, с уменьшенным, или полностью редуцированным просветом ряд петель в состоянии стаза, что приводит к уменьшению площади капилляров клубочка в 2 раза, в сравнении с аналогичными показателями контроля (см. рис. 2 D; табл. 1). На электроннограммах выявляли гиперплазию и пролиферацию эндотелия капилляров, адаптивную гиперплазию мезангиоцитов, фибробласты в поле коллагеновых волокон, замещающих ме-зангий; сглаживание ножек подоцитов вплоть до полного исчезновения малых отростков. В интерстиции регистрируется слабовыраженный отек стромы, полнокровие сосудов и также наличие очаговых склеротических изменений. Со стороны проксимальных и дистальных канальцев нефрона отмечаются более выраженные явления смешанной (вакуольно-зернистой) дистрофии, некроза и десквамации эпителия в просвет канальцев. Выявляются участки резко растянутых канальцев с уплощённым эпителием и коллоидоподобным содержимым в их просвете (формирование тиреоидной почки) (см. рис. 2 Е, F; табл. 1).
Рисунок 2. Микрофото различных отделов нефрона почек крыс F - Неравномерная пролиферация мезанглиальных клеток с расширением мезанглия, и элементами склероза. Окраска Массон. Увеличение. 400. G - Формирование щитовидной почки- растянутые канальцы с уплощённым эпителием и коллоидоподобным содержимым в просвете. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение. 400 Н - Дистрофия и некроз эпителия канальцев Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение.400.
I -Подоциты со сглаженными отростками распластанные на базальной мембране (сверху) и про-лифелирующие мезангиоциты, гиперплазиея мезанглия. (внизу). Увеличение 8000. J - Фибробла-сты в зоне коллагеновых волокон,замещающих мезанглий (начинающийся очаговый склероз клубочка) Увеличение 60
Таблица 1
Данные световой микроскопии (M±m) М - средняя выборочная, m - ошибка средней выбо-_рочной)_
Показатель Контроль АМФ-примесь Памиред
Sпк мкм2 4900,7±754
Sск мкм2 - 2435,8±234
Sппк мкм2 - 9262,598±742* 3464,442±598*
КК 192,33±6,44 203,83±2,9* 195,83*
КПК 138,83±2,49* 79,17± 4,58*
КСК 30,17±1,48
Sкк мкм2 3872,1±584
Sкпк мкм2 5256±247* 2153±124*
Sкск мкм2 1797±142 -
СЛГИ - +++ ++
СДК +++ ++
Примечание Sпк площадь клубочка; Sск площадь склерозированного клубочка, S ппк площадь пролиферирующего клубочка. КК-количество клубочков на поверхности среза. КПК количество профилирующих клубочков на поверхности среза. КСК количество склерозировавнных клубочков на поверхности среза. Sкк плошадь капилляров клубочка контрольной группы. Sкпк площадь капилляров пролифелирующих клубочков. СЛГИ степень лимфагистиоцитарной инфильтрации (полуколичественным методом: отсутствие - 0; слабая - +; умеренная - ++; выраженная - +++). СДК степень деструкции канальцев (полуколичественным методом: отсутствие - 0; слабая - +; умеренная - ++; выраженная - +++) Примечание:
* - р<0,05 в сравнении с контрольной группой
ОБСУЖДЕНИЕ
Обобщая результаты, полученные при гис-томорфометрическом исследовании структуры нефронов почек, лабораторных белых крыс второй и третьей групп, которым было произведено введение исследуемых веществ «Памиред» аминобифосфонатной группы и примеси образующейся при кустарном синтезе метаамфита-мина «Винта», имеющего аминофосфонатную природу, выявлены нефротоксические свойства, проявившиеся на уровне структурной организации нефрона. Однако, следует отметить некоторые различия в степени поражения почечной паренхимы и стромы проявившиеся на всех уровнях. Нефротоксичность «Памиреда» проявляется в поражении преимущественно тубуляр-ного аппарата с стромальным компонентом и очаговой гломерулопатией с экссудативным компонентом и подтверждает литературные данные о нефротоксичности аминобисфосфона-тов[ 9, 10].
При исследовании влияния примеси продукта кустарно-изготовленного метаамфетами-на в почках наблюдается более глубокие поражения гломерулярного аппарата и канальцевой системы, что подтверждается как качественными, характеристиками так и количественными данными: А именно - наличием клубочков с явлениями пролиферации эпителия, превышающее аналогичные показатели во второй группе животных в 2 раза, и клубочков с явле-
ниями склероза, которые совершенно не характерны в исследуемой структуре нефронов группы животных получавших памидроновую кислоту. (см таб 1). Поражение канальцевой системы также носит более выраженный деструктивный характер и характеризуется распространенностью дистрофических изменений ту-булярного аппарата с образованием расширенных канальцев с уплощённым эпителием и коллоидоподобным содержимым в их просвете (формирование тиреоидной почки)
Таким образом, вещество аминофосфонат-ной группы, (моделирующее примеси, образующиеся при синтезе метаамфетамина кустарным способом) в в дозе 63мг/кг, обладает более выраженным деструктивным действием на исследуемые почечные структуры и позволяет предположить наличие в исследуемой композитной смеси веществ, возможно обладающих цитотоксичными свойствами [1].
ВЫВОДЫ
Препарат аминобисфосфонатной природы, - памидроновая кислота (Памиред) при внутри-брюшинном введении лабораторным белым крысам в дозе 63 мкг/кг проявляет нефротокси-ческие свойства преимущественно с поражением тубулярного аппарата со стромальным компонентом и очаговой гломерулопатии с экссудативным компонентом.
Нефротоксичность вещества моделирующее примеси образующейся при кустарно-изготовленном метаамфетамине, при внутриже-лудочном введении лабораторным белым крысам в дозе 63мг/кг проявляется в поражении преимущественно гломерулярного аппарата за счёт надмерного пролиферативного компонента с исходом в очаговый гломерулосклероз, и более глубокой распространенностью дистрофических изменений в тубулярном аппарате, которые приводят к формированию «тиреоидной» почки.
Вещество, моделирующее примеси в мета-амфетамине кустарного изготовления, имеющее аминофосфонатную природу, обладает более выраженными деструктирующим действием на структурную организацию нефрона, что возможно обусловлено наличием в исследуемой композитной смеси веществ, возможно обладающих цитотоксичными свойствами.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (базовая часть государственного задания в сфере научной деятельности №2015/701).
ЛИТЕРАТУРА
1. Мостовой С.О., Остапенко О.В., Шульгин В.Ф. Идентификация этиологического фактора, вызывающего «винтовые остеомиелиты», и оценка его воздействия на костную ткань и мо-чевыделительную систему лабораторных белых крыс // Учёные записки Таврического национального университета имени В. И Вернадского. - 2012. - Т25(64), №2. - С. 244-251.
2. Иващенко А.Л. Современные аспекты этио-патогенеза. Клинической картины и лечения остеомиэлитов челюстей у пациентов с наркотической зависимостью и вич-инфекцией /А.Л. Иващенко, И.Н. Матрос-Таранец, А.С. При-луцький // Питання експериментально! та клшь чно! медицини. - 2009. - Т 1, № 13. - С. 213219.
3. Тимофеев А.А. Фосфорный некроз челюстей у наркозависимых больных, употребляющих суррогатный психостимулятор «Винт» / А.А. Тимофеев, И.Г. Лесова // Современная стоматология.- 2009. - № 5. - С. 94- 98.
4. Тимофеев А.А. Клиническое течение гнойно-воспалительных заболеваний челюстей и мягких тканей челюстно-лицевой области у больных, употребляющих наркотик «Винт» / А.А. Тимофеев,А.В. Дакал // Современная стоматология. - 2010. - № 1. - С. 96-102.
5 Мостовой С.О. Экспериментальная оценка воздействия ненаркотического аналога психотропных препаратов суррогатного производства на костную ткань и мочевыделительную систему лабораторных белых крыс. / С.О. Мостовой, О.В. Остапенко Проблеми вшськово! охорош здоровья (збiрник наукових праць украшсько! вшськово-медично! академп. — Ки!в, 2012 Вш 34 — Т2 роздiл11(окремi питання сучасно! ме-дициш) С449 — 455
6. Врублевский А. Г. Наркомании и токсикомании: Клинические формы наркоманий токси-команий //Лекции по наркологии под. Ред. Н. Н. Иванца, М., 2000 - С. 241.
7. Рыболовлев Ю.Р. Рыболовлев Р.С. Дозирование веществ для млекопитающих по константе биологической активности // Доклады АН СССР. - 1979. - Т. 247, № 6. - С. 1513-1516.
8. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose: Council of Europe 18.03.1986. - Strasbourg, 1986. - P. 52.
9. Perazella M.A. Bisphosphonate nephrotoxicity / A.M. Perazella and G.S. Markowitz // International Society of Nephrology. Kidney International. -2008.- Р. 1-9.
10. Verhulst A, Sun S, McKenna CE, D'Haese PC. "Endocytotic uptake of zoledronic acid by tubular cells may explain its renal effects in cancer patients receiving high doses of the compound/'PZoS One.2015 Mar 10;10(3):e0121861.
