CC BY
24
DOI 10.24412/2074-5036-2021-1-3-7 УДК 616-092
Ключевые слова: технологический стресс, крупный рогатый скот, эритроциты, цитоскелет, спектрин, актин, белок полосы 3, гликофорин.
Key words: technological stress, cattle, red blood cells, cytoskeleton, spectrin, actin, band 3 protein, glycophorin.
Дерюгина А. В.1, Иващенко М. Н.2, Таламанова М. Н.1, Белов А. А.2, Петров В. А.2
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ СТРЕССЕ И КОРРЕКЦИИ НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ
STRUCTURAL ORGANIZATION OF ERYTHROCYTE MEMBRANES UNDER STRESS AND CORRECTION BY LOW-INTENSITY LASER RADIATION
'Институт биологии и биомедицины ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
Biology and Biomedicine Institute of Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, 23 Prospekt Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation
2ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия», 603107, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 97.
State Agricultural Academy of Nizhny Novgorod, 97Prospekt Gagarina, 603107, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Дерюгина Анна Вячеславовна, доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой физиологии и анатомии, е-mail: derugina69@yandex.ru
Deryugina Anna Vyacheslavovna, Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Chef of the Department of Physiology and Anatomy, е-mail: derugina69@yandex.ru Иващенко Марина Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и биохимии животных, е-mail: kafedra2577@mail.ru Ivashchenko Marina Nikolaevna, PhD of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Animal Physiology and Biochemistry, е-mail: kafedra2577@mail.ru Таламанова Мария Николаевна, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры физиологии и анатомии, е-mail: kafedra2577@mail.ru Talamanova Maria Nikolaevna, PhD of Biological Sciences, Senior Lecturer of the Department of Physiology and Anatomy, е-mail: kafedra2577@mail.ru Белов Андрей Александрович, аспирант кафедры физиологии и биохимии животных,
е-mail: kafedra2577@mail.ru Belov Andrey Aleksandrovich, Post-graduate Student of the Department of Animal Physiology and Biochemistry,
е-mail: kafedra2577@mail.ru Петров Владимир Александрович, аспирант кафедры физиологии и биохимии животных, е-mail: kafedra2577@mail.ru Petrov Vladimir Alexandrovich, Post-graduate Student of the Department of Animal Physiology and Biochemistry, е-mail: kafedra2577@mail.ru
Аннотация. Целью работы стало установление нарушений белкового спектра эритроцитарных мембран крупного рогатого скота в условиях технологического стресса и эффективности использования в коррекции стресса низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ). При технологическом стрессе у животных отмечено изменение содержания белков цитоскелета и интегральных белков: белка полосы 3 и гликофоринов. При воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 830 нм на фоне стресса обнаружены разнонаправленные изменения в белковом спектре эритроцитарных мембран. Эффекты зависели от места и времени воздействия. При 15 мин экспозиции НИЛИ в области холки к седьмым суткам эксперимента наблюдалось восстановление белкового состава эритроцитарных мембран до значений интактной группы. Summary. The aim of the work was to establish violations of the protein spectrum of the erythrocyte membranes of cattle in the conditions of technological stress and the effectiveness of using low-intensity laser radiation (LILR) in the correction of stress. Under technological stress, the animals showed changes in the content of cytoskeletal proteins and integral proteins: band 3 protein and glycophorins. When exposed to low-intensity laser radiation with
a wavelength of 830 nm under stress, multidirectional changes in the protein spectrum of erythrocyte membranes were detected. The effects depended on the place and time of exposure. By the seventh day of the experiment, the protein composition of the erythrocyte membranes was restored to the values of the intact group at 15 minutes of exposure of the LILR in the withers region.
Введение
Сдерживающим фактором проявления высокой продуктивности крупного рогатого скота следует считать технологический стресс, возникающий в условиях промышленного производства. Стрессы приводят к дополнительным затратам энергии для адаптации организма к новым условиям окружающей среды, ухудшают физиологическое состояние организма, изменяют обменные процессы, вызывают отставание в росте и развитии животных, болезни и снижение продуктивности. Стрессы оказывают негативное влияние на состояние организма животных и развитие на их фоне воспалительных процессов [6].
Чрезвычайно важное место в системе лечебных мероприятий при стрессе у животных занимает восстановление морфофункци-онального состояния форменных элементов крови [1].
В настоящее время в ветеринарной медицине и животноводстве для воздействия на самые различные патологические процессы используется низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ). Воздействие НИЛИ обусловлено универсальными лечебными свойствами лазерного излучения, способностью стимулировать процессы пролиферации, дифференцировки клеток, активизировать микроциркуляцию. Использование НИЛИ обусловлено и тем, что одним из пусковых механизмов в патогенезе стресса являются мембранодестабилизирующие процессы. Эритроциты являются важнейшей составной частью микроциркуляции, а их форма во многом определяет ее адекватность и эффективность [1, 6].
Между тем, до сих пор действие НИЛИ на морфофункциональное состояние эритроцитов при стрессе изучено неполно. В связи с вышеизложенным цель работы -установление нарушений белкового спектра мембран эритроцитов в условиях техноло-
гического стресса и эффективности использования в коррекции низкоинтенсивного лазерного излучения.
Материалы и методы
Исследования осуществляли в соответствии с правилами Европейской конвенции по использованию животных для экспериментов или в иных научных целях и Приказом МЗ России «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
Исследование проведено на высокопродуктивных голштинизированных коровах черно-пестрой породы второй лактации (две недели после отела). Методом аналогов было сформировано 6 групп коров по шесть голов в каждой. В опыте 1 группа животных являлась интактной, 2, 3, 4, 5, 6 группы подвергались действию технологического стресса: взвешивание, перегруппировка, смена рациона, проведение ветобработок, затем 3, 4, 5, 6 группы облучали НИЛИ: 3 группа, находясь в стрессе, подвергалась ежедневному 5-минутному воздействию НИЛИ на ухо; 4 группа, находясь в стрессе, подвергалась ежедневному 5-минутному воздействию НИЛИ на холку; 5 группа, находясь в стрессе, подвергалась ежедневному 15-минутному воздействию НИЛИ на ухо; 6 группа, находясь в стрессе, подвергалась ежедневному 15-минутному воздействию НИЛИ на холку.
Для лазеротерапии применяли автономный лазерный душ «МарсИК» (НПО «Пе-тролазер», Санкт-Петербург) с длиной волны 830 нм, мощностью 90 мВт. Время воздействия составило 5 и 15 минут в область уха или холки. Курс физиопроцедур составил ежедневно однократно 7 облучений.
Опытные и контрольные группы животных находились в одинаковых условиях содержания, кормления и ухода. В ходе исследований за всеми животными было установлено постоянное клиническое наблю-
дение. Критериями оценки здоровья коров служили общее состояние животных (температура тела, частота пульса, дыхания), отсутствие отклонений от нормы при их клиническом исследовании.
Кровь для исследований брали из яремной вены через час, сутки и через неделю.
Разделение белков мембран эритроцитов проводили методом электрофореза в поли-акриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ). Электрофорез в ДСН-ПААГ проводили по методу Лэммли с использованием камеры Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, USa) [8].
Для статистической обработки полученных результатов использовали табличный редактор Microsoft Excel 2007 и программу Statistica 6.0. После доказательства принадлежности экспериментальных данных к нормальному распределению с использованием критерия Шапиро-Уилка определяли значения средних арифметических и стандартных отклонений.
Результаты исследований
Исследования белкового спектра эритро-цитарных мембран показало, что технологический стресс изменял содержание белков цитоскелета, что выражалось в увеличении актина к первому часу и спектрина к первым суткам, при последующем уменьшении концентрации интегральных белков: белка полосы 3 и гликофоринов.
Действие НИЛИ вызывало разнонаправленные изменения в зависимости от времени и места воздействия.
Облучение в течение 5 мин в области уха определило снижение содержания спектрина и гликофоринов при увеличении содержания актина к часу и белка полосы 3 к первым суткам относительно значений интактной группы. К концу первой недели эксперимента наблюдалось снижение концентрации актина и гликофоринов относительно интактной группы (табл. 1).
При действии НИЛИ в области уха в течение 15 мин и в области холки как в течение 5 мин, так 15 мин выявлено однонаправленное изменение в содержании спектрина и гликофоринов. Так, наблюдалось увеличе-
ние концентрации спектрина на начальном этапе, оно было более выраженно по сравнению с действием технологического стресса, напротив, содержание гликофоринов снижалось, так же более значимо по сравнению с действием стресса. Содержание белка полосы 3 снижалось относительно группы интактных животных, но было выше значений, регистрируемых при технологическом стрессе (табл. 1). Только при 15 мин экспозиции НИЛИ в области холки к 7 суткам регистрации наблюдалось восстановление белкового состава эритроцитарных мембран до значений интактной группы.
Учитывая, что спектрин является основным белком цитоскелета эритроцитов, белок полосы 3 формирует основу для макромоле-кулярного комплекса интегральных и периферических белков мембраны эритроцитов, а гликофорины относятся к трансмембранным гликопротеинам, можно говорить, что при стрессовом воздействии наблюдается изменение как периферических, так и интегральных белков эритроцитарной мембраны. Известно, что при уменьшении содержания спектрина и сокращении мест связывания с анкирином снижается поверхностная вязкость мембраны [9].
В свою очередь гидрофобная область белка полосы 3 образует анионный канал, обеспечивающий ионный гомеостаз эритроцита [11]. Кроме того, белок полосы 3 рассматривается как интегрированная структурная единица для обмена С02/02 в эритроцитах. Цитоплаз-матическая область белка полосы 3 имеет сайты связывания с рядом ферментов гликолиза [10].
Таким образом, выявленные изменения белковой фазы могут реализоваться в уменьшении вязкости мембраны и повышении ее ригидности, а также затрагивать метаболические процессы, связанные с работой гликолитических ферментов. Снижение активности гликолиза приведет к уменьшению АТФ, что сопровождается выключением ионных насосов и накоплением в клетках ионов Са2+ [5].
Накопление в клетках ионов Са2+ приводит к активации мембраносвязанных фосфолипаз, что повышает транслокацию
Таблица 1
Белковый спектр мембран эритроцитов при технологическом стрессе и действии НИЛИ (%)
Группа животных Время после воздействия Спектрин Актин Белок полосы 3 Гликофорины
Интактные 1 час 13,319±0,83 6,375±0,71 28,902±1,33 26,470±2,01
1 сутки 13,319±1,72 6,375±2,03 28,902±1,08 26,470±2,22
1 неделя 16,817±2,00 17,211±0,49 24,679±1,88 12,116±1,17
Технологический стресс 1 час 14,507±1,54 20,728±1,52* 32,935±2,00 32,881±0,79
1 сутки 28,223±0,46* 8,051±1,45 17,619±1,44* 14,755±1,33*
1 неделя 13,813±1,36 17,190±1,48 8,552±1,92* 11,229±2,33
Стресс +НИЛИ ухо 5 минут 1 час 8,229±0,92* 27,899±2,11* 25,885±0,45 11,460±1,32*
1 сутки 10,270±2,13 44,859±1,94* 34,154±2,14* 21,435±1,28
1 неделя 17,807±1,84 13,127±1,87* 23,799±,48 8,814±1,93*
Стресс +НИЛИ ухо 15 минут 1 час 47,518±1,64* 5,925±1,82 11,575±2,20* 25,312±1,44
1 сутки 48,166±1,55* 6,305±2,34 37,218±1,39* 11,405±1,05*
1 неделя 19,253±1,67 8,611±1,56* 19,533±2,67 6,917±1,78*
Стресс +НИЛИ холка 5 минут 1 час 47,518±1,64* 5,925±1,82 11,575±2,20* 25,312±1,44
1 сутки 28,361±1,29* 11,595±1,67* 21,980±1,83 27,832±0,77
1 неделя 13,535±0,92 15,901±1,29* 18,399±2,95* 2,914±1,03*
Стресс +НИЛИ холка 15 минут 1 час 40,378±2,02* 6,935±1,24 22,704±1,88* 5,347±2,28*
1 сутки 13,689±0,87* 2,490±1,26* 29,318±2,07 13,376±0,92*
1 неделя 15,834±1,84 18,305±1,99 20,975±2,15 17,591±2,96
Примечание: * - р < 0.05 относительно интактной груп:
фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны и образование эхиноцитов [2].
Использование НИЛИ вызывало восстановление белковых фракций эритроцитарных мембран. Обсуждая полученные эффекты НИЛИ, необходимо учитывать, что эффекты НИЛИ не всегда зависят от дозы и увеличение дозы не всегда эффективно, что и проявляется при действии на холку: с увеличением времени воздействия эффекты не усиливаются.
НИЛИ может воздействовать непосредственно на эритроциты (при действии НИЛИ в области уха) и через нейроэндокринные структуры мозга (действие НИЛИ в области холки). Обсуждая прямые эффекты НИЛИ на эритроциты, можно предположить его действие на порфири-ны эритроцитов, и в частности на гемоглобин. Известно, что гемоглобин связан с белком полосы 3 [3], можно предположить, что через гемоглобин происходит модификация белка полосы 3, который являясь анионным каналом, восстанавливает ионный гомеостаз в клетки. В частности, большое значение играет восстановление концентрации Са2+. Показано, что увеличение цитозольной Са2+ может приводить к активации
трансглутаминазы, вызывающей сшивания белков и стимулировать фосфолипазы, протеинки-назы и фосфатазы, а также протеазы, такие как кальпаин [4]. Деградация мембранных белков кальпаином может участвовать в механизме, приводящем к гибели эритроцитов [7]. Восстановление ионов Са2+ будет способствовать обратным процессам.
Поскольку белок полосы 3 связан с ферментами гликолиза, можно предположить, что НИЛИ оказывает опосредованное действие и на метаболические процессы. В частности показано, что при действии НИЛИ увеличивается концентрация АТФ, в результате чего происходит улучшение деформируемости эритроцитов [7].
Заключение
Исследование белкового спектра эритроцитарных мембран показало, что технологический стресс изменял содержание белков цитоскелета, что выражалось в увеличении актина к первому часу и спектрина к первым суткам, при последующем уменьшении концентрации интегральных белков: белка полосы 3 и гликофоринов.
Использование НИЛИ вызывало восстановление белковых фракций эритроцитар-ных мембран. Эффекты НИЛИ не всегда зависели от дозы, и увеличение дозы не всегда было эффективно, что и проявлялось при действии на холку: с увеличением времени воздействия эффекты не усиливаются.
НИЛИ может воздействовать непосредственно на эритроциты (при действии НИЛИ в области уха) и через нейроэндокринные структуры мозга (действие НИЛИ в области холки). Говоря о прямых эффектах НИЛИ на эритроциты, можно предположить его действие на порфирины эритроцитов, и в частности на гемоглобин.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-016-00195.
Список литературы
1. Байбеков И. М. Эритроциты в норме, патологии и при лазерных воздействиях / И. М. Байбеков, Р. Ш. Мавлян-Ходжаев, А. Г. Эрстекис, С. В. Москвин. Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2008. 256 с.
2. Боровская М. К. Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза / М. К. Боровская, Э. Э. Кузнецова, В. Г. Горохова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. Т. 3, № 73. С. 334-354.
3. Bennett-Guerrero E. Evolution of adverse changes in stored RBCs / E. Bennett-Guerrero, T. H. Veldman // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. V. 104, № 43. Р. 17063-17068.
4. Berg C. P. Human mature red blood cells express caspase-3 and caspase-8, but are devoid of mitochondrial regulators of apoptosis / C. P. Berg, I. H. Engels, A. Rothbart, K. Lauber, A. Renz, S. F. Schlosser, K. Schulze-Osthoff, S. Wesselborg // Death Differ. 2001. № 8. P. 1197-1206.
5. Deryugina A. V. Low-level laser therapy as a modifier of erythrocytes morphokinetic parameters in hyper-adrenalinemia / A. V. Deryugina, M. N. Ivashchenko, A. G. Samodelkin // Lasers in Medical Science. 2019. V 34, № 8. P. 1603-1612. doi: 10.1007/s10103-019-02755-y.
6. Deryugina A. V. Stress-related effects of low-intensity laser irradiation / A. V. Deryugina, M. N. Iva-shchenko, P. S. Ignatyev // International Journal of Biomedicine. 2019. T. 9, №2. P. 163-167.
7. Gao X. Molecular mechanisms of cell proliferation induced by low power laser irradiation / X. Gao, D. Xing // J. Biomed Sci. 2009. V 16, № 4. doi:10.1186/1423-0127-16-4.1.
8. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage / U. K. Laemmli // Nature. 1970. № 227 (5259). P. 680-685.
9. Moroz V. V. Comparison of red blood cell membrane microstructure after different physicochemical influences: atomic force microscope research / V. V. Moroz, A. M. Chernysh, E. K. Kozlova // Journal of Critical Care. 2010. 25(3):539.e1-12.
10. Nunomura W. Regulation of Protein 4.1R, p55, and Glycophorin C Ternary Complex in Human Erythrocyte Membrane / W. Nunomura, Y. Takakuwa // The Journal of biological chemistry. 2000. V. 275, №32. P. 24540-24546.
11. Saldanha C. Modulation of erythrocyte hemorheological properties by band 3 phosphorylation and dephosphorylation / C. Saldanha, A. S. Silva // Clinical Hemorheology and Microcirculation. 2007. V. 6, № 3. P. 183-194 PMID: 17361021.
Объективная проверка слуха у животных. BAER-тест
С 2018 года ЧОУ ДПО «Институт Ветеринарной Биологии» проводит обучающий курс по объективной проверке слуха у животных (BAER-тест) у собак, кошек и других видов животных. В теоретической части занятий слушатели знакомятся с теорией процесса регистрации вызванных слуховых потенциалов и основами нейрофизиологии. За время практических занятий каждый слушатель обучается самостоятельно проводить осмотр животного перед проведением BAER-теста, проверять племенные документы (для выписки сертификата допуска в разведение), непосредственно выполнять BAER-тест, фиксировать данные тестирования, интерпретировать данные тестирования, выписывать экспертное заключение о результатах BAER-теста. По окончании курса слушатели получают СЕРТИФИКАТ СПЕЦИАЛИСТА по проведению BAER-теста.
Подробнее: http://invetbio.spb.ru/seminar_baer.htm
Записаться на курс, приобрести пр ибор для проверки слуха у животных: ivb-info@mail.ru
