CC BY
55
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Экспериментальная неврология
© Россохин А.В., Шаронова И.Н., 2021
Структурная фармакология ГАМКл-рецепторов
А.В. Россохин, И.Н. Шаронова
ФГБНУ«Научный центр неврологии», Москва, Россия
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), основной тормозный нейромедиатор в центральной нервной системе (ЦНС) млекопитающих, активирует ионотропные рецепторы А типа (ГАМКаР), обеспечивающие процессы быстрого торможения. ГАМКаР являются основной мишенью для различных групп препаратов, широко используемых при лечении заболеваний ЦНС.
В обзоре представлены данные, позволяющие показать, как связаны физиологические эффекты, вызываемые активацией и модуляцией функций ГАМКаР различными веществами (в том числе относящимися к лекарственным соединениям), со структурой рецептора и с взаимодействием этих веществ с конкретными модуляторными сайтами. Недавний прогресс в криоэлектронной микроскопии привёл к фундаментальным достижениям в понимании детальной организации и механизмов функционирования ГАМКаР. Обзор основан как на современных структурных данных, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии, так и на результатах исследований, выполненных при помощи биохимических и электрофизиологических методов, а также методов молекулярного моделирования.
Ключевые слова: ГАМК-рецептор; положительные аллостерические модуляторы; молекулярное моделирование; криоэлектронная микроскопия
Благодарность. Выполненные нами вычисления производились на базе центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешних источников финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Адрес для корреспонденции: 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5. ФГБНУ НЦН. E-mail: alrossokhin@yahoo.com. Россохин А.В.
Для цитирования: Россохин А.В., Шаронова И.Н. Структурная фармакология ГАМКА-рецепторов. Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2021; 15(4): 44-53.
DOI: https://doi.org/10.54101/ACEN.2021A5
Поступила 01.09.2021 / Принята в печать 17.09.2021
Structural pharmacology of GABAА receptors
Alexey V. Rossokhin, Irina N. Sharonova
Research Center of Neurology, Moscow, Russia
Gamma-aminobutyric acid (GABA) is the main inhibitory neurotransmitter in the mammalian central nervous system (CNS), activating the inotropic type A receptors (GABAa receptors) to provide fast inhibition. GABAa receptors are the main target for various groups of drugs that are widely used in the treatment of CNS disorders.
This review examines the relationship between the physiological effects of GABAa receptor activation and modulation by various substances (including medicinal compounds), the receptor's structure, and the interaction of these substances with specific modulatory sites. Recent advances in cryogenic electron microscopy have led to fundamental improvements in understanding the detailed organization andfunction of GABAa receptors. This review is based on both the latest structural data obtained from cryogenic electron microscopy and the results of biochemistry and electrophysiology studies, as well as molecular modelling.
Keywords: GABAa receptor; positive allosteric modulators; molecular modelling; cryogenic electron microscopy
Acknowledgements. Our calculations were performed at the Supercomputer Resource Sharing Centre of the Lomonosov Moscow State University.
Source of funding. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article. For correspondence: 105064, Russia, Moscow, pereulok Obukha, 5. Research Center of Neurology. E-mail: alrossokhin@yahoo.com. Rossokhin A.V.
For citation: Rossokhin A.V., Sharonova I.N. [Structural pharmacology of GABA receptors]. Annals of clinical and experimental neurology. 2021; 15(4): 44-53. (In Russ.) A
DOI: https://doi.org/10.54101/ACEN.2021.4.5
Received 01.09.2021 / Accepted 17.09.2021
Введение
Быстрое торможение в ЦНС опосредуется активацией рецепторов у-аминомасляной кислоты А типа (ГАМКдР). Активация ГАМКаР двумя молекулами агониста ГАМК переводит пору рецептора в открытое состояние, в котором обеспечивается энергетически оптимальный перенос ионов хлора внутрь клетки через гидрофобный барьер мембраны, что приводит к гиперполяризации мембраны и затрудняет генерацию нейронами потенциалов действия.
ГАМКаР являются мишенью для большого числа как эндогенных, так и экзогенных модуляторов, регулирующих функции этих рецепторов, в том числе широко используемых в клинической практике. К таким модуляторам можно отнести химические соединения, принадлежащие к различным классам: антиконвульсанты, анксиолитики, общие анестетики, нейростероиды, конкурентные и неконкурентные антагонисты [1, 2].
Общие сведения о структуре ГАМКаР_
ГАМКаР принадлежит к семейству цис-петельных лиганд-управляемых рецепторов, которые состоят из 5 субъединиц, симметрично (или псевдосимметрично) расположенных вокруг центральной оси и формирующих ион-проводящую пору. К этому семейству у позвоночных также относятся катион-проводящие никотиновый ацетилхолиновый и се-ротониновый рецепторы, анион-проводящий глициновый рецептор [3, 4].
Обнаружены 8 типов субъединиц: а1-6, Р1-3, у1-3, р1-3, е, п, 5 и 9, из которых может быть построен ГАМКаР [5]. Наиболее часто в ЦНС встречаются ГАМКАР, состоящие их двух а-, двух в- и одной у- или 5-субъединицы [5, 6]. Рецепторы, содержащие у-субъединицу, локализованы в постсинапти-ческой мембране, где они опосредуют быстрые фазовые ответы, в то время как рецепторы, содержащие 5-субъединицу, локализованы вне синапсов и опосредуют медленные тонические токи. Синаптические и экстрасинаптические рецепторы обладают различными биофизическими свойствами, включая кинетику десенситизации, а также проявляют различные фармакологические свойства [2, 5, 7].
В целом лиганд-управляемые рецепторы могут находиться в 3 основных функциональных состояниях: закрытом, открытом и десенситизированном. Закрытый рецептор не связан с агонистом и находится в непроводящем состоянии. В отрытом агонист-связанном состоянии через пору рецептора свободно проходит ионный ток. В десенситизи-рованном состоянии, несмотря на присутствие агониста, рецептор не проводит ионный ток и невосприимчив к новым стимулам.
В структуре ГАМКАР можно выделить экстраклеточный и трансмембранный домены (ЭКД и ТМД соответственно) (рис. 1, А, В). ЭКД каждой субъединицы включает ^концевую а-спираль, за которой следуют 10 структур типа «р-тяж-петля-р-тяж», упакованных в в-сэндвич. ТМД состоит из 4 а-спиралей (М[-М4) и различных по длине петель, соединяющих а-спирали (рис. 1, В). Пора ГАМКАР формируется 5 М2-сегментами различных субъединиц. Аминокислотный состав М2-спиралей определяет селективность и проводимость канала [8].
Y2
в2
С-петля C-loop
£
цис-петля cys-loop
M-M, петля
M2 ,.v Ю ?"M2-M3loop_
Внутриклеточное пространство Intracellular space
ЭКД ECD
ТДМ TDM
в2
ЭТМ, ПФЛ, _ ДЗП, АЛП ETM, PPF, DZP, ALP
R2 ЭТМ, к ДЗП, АЛП ETM, PPF, DZP, ALP
Рис. 1. Архитектура ГАМКдР.
А — вид из плоскости мембраны на 2 : 2 : 1 аф2у2-рецептор (6X3Z). Субъединицы выделены цветом и буквенным обозначением (а1 — сине-зеленый, Р2 — оранжевый, у2 — пурпурный цвет). B — структура отдельной субъединицы. N и С — окончания аминокислотной цепи, С-петля и цис-петля ЭКД, Mj-M4 — трансмембранные спирали, М2-М3 — петля ТМД. C — вид из внутриклеточного пространства на ЭКД. Межсубъе-диничные интерфейсы выделены при помощи обозначений +/-. Показаны электронные плотности ГАМК и диазепама в Р+/а--и а+/у--интерфейсах.
D — вид из внеклеточного пространства на ТМД. Показаны трансмембранные межсубъединичные интерфейсы, в которых связываются положительные аллостерические модуляторы: Р+/а- — общие анестетики (этомидат — ЭТМ и пропофол — ПФЛ), бензодиазепины (диазепам — ДЗП), нейростероиды (аллопрег-нанолон — АЛП); а+/Р- — барбитураты (фенобарбитал — ФБЛ); Р-/у+ — барбитураты (ФБЛ), бензодиазепины (ДЗП).
Fig. 1. GABA» receptor architecture.
A — view parallel to the membrane plane towards 2:2:1 аф2у2 receptor (6X3Z). The subunits are marked with colours and letters (а1 is blue-green, P2 is orange, and y2 is magenta).
B — structure of a single subunit. N and С — amino acid chain terminals, ECD С-loop and cys-loop, М,-М4 - transmembrane helices, М2-М3 — TMD loop.
C — view from the intracellular space towards the ECD. Intersubunit interfaces are marked with +/-. The electronic densities of GABA and diazepam in Р+/а- and а+/у- interfaces are shown. D — view from the extra space towards the TMD. Transmembrane in-tersubunit interfaces to which positive allosteric modulators bind are shown: Р+/а- — general anaesthetics (etomidate (ETM) and propo-fol (PPF)), benzodiazepines (diazepam (DZP)), neuroactive steroids (allopregrnnolone (ALP)); а+/Р- barbiturates (phenobarbital (PBT)); p/y+ — barbiturates (PBT), benzodiazepines (DZP).
Каждая субъединица «соприкасается» с соседними субъединицами основной (+) и вспомогательной (-) сторонами. Система обозначений +/- используется для маркировки межсубъединичных интерфейсов рецептора. ГАМКаР имеет два р+/а--интерфейса, и по одному а+/Р--, а+/у-- и у+/Р--интерфейсу (рис. 1, С, D).
A
B
N
M
M
С
D
Structural pharmacology of GABAa receptors
ABC
Рис. 2. Ортостерический сайт в ЭКД со связанными ГАМК (А) и конкурентным антагонистом бикукуллином (B).
Показаны боковые цепи остатков, вносящих наибольший вклад во взаимодействие с лигандом. Водородные связи и полярные контакты изображены красными пунктирными линиями. Показаны только полярные атомы водорода.
C — наложение 2 крио-ЭМ-структур ГАМКаР со связанными ГАМК (PDB ID 6X3Z) и бикукуллином (PDB ID 6X3S). ТМД и некоторые структурные элементы ЭКД al- и р2-субъединиц не показаны для ясности. Цветовое изображение субъединиц соответствует рис. 1, при этом на фрагменте C для структуры 6X3Z использован более светлый тон. Стрелка указывает на изменение конформации С-петли.
Fig. 2. Orthosteric site in the ECD with bound GABA (А) and the competitive antagonist bicuculline (B).
Side chains of the residues, which play the biggest role in ligand interaction, are demonstrated. Hydrogen bonds and polar contacts are shown as red dashed lines. Only the polar hydrogen atoms are shown.
C — overlay of the two cryo-EM structures: GABAa receptor with bound GABA (PDB ID 6X3Z) and with bicuculline (PDB ID 6X3S). The TMD and some structural elements of the ECD al and P2 submits are not shown for clarity purposes. The subunit colours correspond to those in Fig. 1, but a lighter shade is used for the 6X3Z structure in the C fragment. The arrow indicates the change in the C-loop conformation.
Агонисты и модуляторы, связывающиеся в ЭКД ГАМКаР
ГАМК и конкурентные антагонисты
ГАМК взаимодействуют с двумя структурно эквивалентными сайтами связывания, расположенными в P+/a--межсубъединичных интерфейсах ЭКД ГАМКаР (рис. 1, C) [9, 10]. На рис. 2, А, B показаны фрагменты криоэлектронно-микроскопических (крио-ЭМ) структур а1^2у2-ГАМКАР со связанными ГАМК (код Protein Data Bank (PDB ID) — 6X3Z) и конкурентным антагонистом бикукуллином (PDB ID 6X3S).
ГАМК связывается внутри так называемой «ароматической коробочки», формируемой боковыми цепями ароматических аминокислотных остатков Phe65 (al, петля D) и Tyr97 (Р2, петля A), Tyr157 (02, петля B), Tyr205, Phe200 (02, петля C) (рис. 2, А). В сайте связывания формируются электростатические и катион-п взаимодействия между аминогруппой ГАМК и остатками P2-Tyr97 и Tyr205. Кроме того, карбоксильная группа ГАМК образует солевой мостик с Arg67 (al, петля D) и водородную связь с Thr202 ф2, петля C). Таким образом, ГАМК координируется в основном за счёт гидрофильных взаимодействий в р+^-интерфейсах ЭКД.
Несмотря на то что алкалоид растительного происхождения бикукуллин является значительно более крупной молекулой по сравнению с ГАМК, он также связывается в р+^-интерфейсах ЭКД ГАМКАР (рис. 2, B). При этом гидрофобная природа фталидного и изохинолинового колец бикукуллина определяет характер его взаимодействий с ароматическими остатками. Фталидное кольцо бикукул-лина участвует в п-стэкинг-взаимодействиях с Phe200 ф2,
петля С) и стабилизирует петлю С в более открытой конформации (рис. 2, С). Наложение двух структур — 6X3Z и 6X3S — показывает, что петля С в структуре 6X3S отогнута примерно на 4,5 А по сравнению со структурой 6X3Z.
Важно отметить, что боковые цепи остатков А^67 (а1, петля D) и А^Ш (а1, петля Е), участвующих в связывании ГАМК и стабилизации открытого состояния рецептора, изменяют свою конформацию и поворачиваются от мембраны, чтобы сайт связывания вместил более крупный антагонист. Водородная связь между остатками А^120 (а1, петля Е) и Туй05 (Р2, петля С), которая стабилизирует положение петли С в открытой конформации рецептора (рис. 2, А), разрушается при связывании бикукуллина.
Изменение положения петли С в бикукуллин-связанной структуре приводит к конформационным изменениям в р-сандвиче (петли D, CYS, Б) р2-субъединицы, которые влияют на репозиционирование петли М2-М3 ТМД (рис. 1, В), что в итоге приводит к изменению конформации (из открытой в закрытую) активационных ворот ГаМКаР.
Агонисты и антагонисты бензодиазепинового сайта
Бензодиазепины (БЗД) представляют собой класс лекарственных препаратов, обладающих анксиолитическими, противосудорожными, седативными, снотворными и мио-релаксантными свойствами. БЗД были введены в клиническое использование в 1960-х гг. и вскоре получили широкое распространение в качестве лекарств, назначаемых в терапевтических целях [1, 11]. Интересно, что ГАМКаР сначала был выделен как бензодиазепиновый рецептор [12, 13].
С
t
D
Рис. 3. Сайт связывания БЗД в а+/т--интерфейсе ЭКД.
А, B — крио-ЭМ-структуры со связанными ДЗП (6X3X) и флума-зенилом (6X3U).
C, D — структурные модели связывания золпидема и тиазольного аналога имидазопиридинов (соединения 37) в а+/у--интерфейсе ЭКД.
Обозначения в A—D соответствуют подписям к рис. 1 и 2.
Fig. 3. BZD binding site in the ECD a+/y- interface.
A, B — cryo-EM structures with bound DZP (6X3X) and flumazenil (6X3U).
C, D — structural models of zolpidem and the thiazole analogue imidaz-opyridine (compound 37) binding in the ECD а+/у- interface. Labels in A-D correspond to the terms in Fig. 1 and 2.
Эффективность БЗД варьирует среди ГАМКаР различного субъединичного состава [14-16]. Рецепторы, содержащие а1-3-, а5- и у1-3-субъединицы, формируют высокоаффинный сайт связывания БЗД [15]. Более того, с селективностью по а-субъединице связаны различные клинические эффекты этих препаратов: а1-субъединица участвует в седа-тивном и противосудорожном действии; а2 — в анксиоли-тическом; а2-, а3- и а5-субъединицы — в миорелаксантном; а1- и а5-субъединицы — в развитии амнезии и когнитивных нарушений [17, 18].
Структура БЗД сайта ГАМКаР хорошо охарактеризована [10, 19]. В ЭКД ГАМКаР в интерфейсе между а- и
у-субъединицами находится высокоаффинный сайт связывания БЗД. Сайты связывания БЗД с более низким сродством обнаружены также в ТМД в интерфейсах между в-и а-, а также между в- и у-субъединицами.
В PDB представлены крио-ЭМ-структуры а1в2у2- и а1в3у2-ГАМКаР в комплексе с ГАМК и ДЗП: 6X3X и 6HUP соответственно [10, 19]. Конформации диазепама в а+/у--интерфейсе ЭКД хорошо совпадают в 6X3X и 6HUP структурах. Доступны также крио-ЭМ-структуры а1в3у2-ГАМКаР в комплексе с другим классическим БЗД алпразо-ламом (6HUO) и а1в2у2-ГАМКАР в комплексе с антагонистом БЗД сайта флумазенилом (6X3U). БЗД сайт ГАМКаР в а+/у--интерфейсе ЭКД со связанными диазепамом (6X3X) и флумазенилом (6X3U) показан на рис. 3, А, B.
Как и в ортостерическом сайте ГАМК (рис. 2, А), в сайте связывания БЗД важную роль играют ароматические остатки Phe100, Hisl02, Tyr160, Tyr210 а1-субъединицы и Tyr58, Phe77 у2-субъединицы (рис. 3, А). Атом хлора ДЗП является акцептором водородной связи, образуемой с остатками His102 (а1) и Asn60 (у2). Также ДЗП выступает одновременно и донором, и акцептором водородной связи с Ser205, расположенным на изгибе C-петли а1-субъединицы (рис. 3, А). Интересно, что His102 представлен в а1-, а2-, а3- и а5-, но не в а4- и а6-субъединицах [15]. В последних 2 субъединицах эквивалентную позицию занимает аргинин, боковая цепь которого стерически препятствует связыванию классических БЗД [17, 20].
Антагонист БЗД-сайта флумазенил демонстрирует кардинально отличную от ДЗП моду связывания (рис. 3, А, B). Флумазенил имеет плоскую конформацию и связывается глубже относительно остатка у2 Asn60, определяющего нижнюю границу БЗД-сайта. Вероятно, это связано с наличием дополнительной водородной связи с Thr142 (у2) [19].
Классические БЗД аллостерически стабилизируют молекулу ГАМК в ортостерическом сайте связывания [10, 21, 22]. Флумазенил конкурирует с БЗД за общий сайт связывания, однако, взаимодействуя преимущественно с остатками а1-субъединицы, вызывает антагонистический эффект. J.J. Kim c соавт., изучая крио-ЭМ-структуры ГАМКаР в комплексе с ГАМК (PDB ID 6X3Z), ГАМК+ДЗП (6X3X) и ГАМК+флумазенил (6X3U), определили, что конформа-ция 6Х3Х-рецептора наиболее стабильна [10, 23]. Анализ 6Х3и-структуры в комплексе с использованием метода молекулярной динамики показал, что связывание флумазени-ла в а+/у--интерфейсе ЭКД дестабилизирует как ЭКД, так и ТМД а1в2у2-ГАМКАР [10]. Последнее хорошо согласуется с использованием флумазенила в клинике при передозировке как ДЗП, так и пропофола или изофлурана (связываются исключительно в ТМД) [24].
Помимо классических БЗД, а+/у--интерфейс ЭКД является сайтом связывания также для имидазопиридинов, которые оказывают минимальное негативное влияние на когнитивные и психомоторные функции, а также вызывают меньшее привыкание у пациентов [25]. Золпидем принадлежит к соединениям этого класса и широко применяется как снотворное средство. В отличие от ДЗП золпидем обладает наибольшим сродством к ГАМКаР, содержащим а1-субъединицу, более низким сродством к а2- и а3-содержащим рецепторам и практически не взаимодействует с а5-ГАМК\Р [14, 26].
A
B
Structural pharmacology of GABAa receptors
Поскольку на сегодняшний день не существует крио-ЭМ- или рентгеновской структуры ГАМКаР в комплексе с золпидемом, мы использовали методику молекулярного моделирования для построения структурной модели связывания этого вещества. При помощи метода Монте-Карло минимизации [27] энергии и компьютерной программы ZMM [28-33] мы осуществили докинг и нашли энергетически оптимальную конформацию золпидема в БЗД-сайте связывания аЩу2-ГАМКАР (рис. 3, C) [34]. Наша модель предсказывает, что золпидем взаимодействует с остатками петель Е (Met130) и F (Glu189) у2-субъединицы, с которыми практически не взаимодействуют классические БЗД (рис. 3, А—C). Важность остатков Met130 и Glu189 для связывания золпидема была ранее установлена в мутационных экспериментах [35, 36].
В настоящее время ведётся активный поиск новых классов модуляторов БЗД-сайта ГАМКаР, ориентированный на получение высокоактивных, малотоксичных соединений с минимальными побочными эффектами. В рамках этого направления исследований были сконструированы и испытаны в экспериментах по вытеснению меченого флунитра-зепама, а также в электрофизиологических экспериментах тиазольные аналоги имидазопиридинов [34]. В результате этой работы были выделены соединения-лидеры, обладающие наибольшей потенцирующей активностью. На рис. 3, D показана структурная модель связывания в а+/у--интерфейсе ЭКД соединения-лидера 37, полученная нами при помощи метода Монте-Карло минимизации. Интересно отметить, что соединение 37, как и ДЗП, взаимодействует с остатками His102 (а1) и Asn60 (у2) (рис. 3 А, D), а также с остатками Met130, Thr142 и Glu189 у2-субъединицы, характерными для связывания золпидема (рис. 3, C, D).
Потенциация ГАМКаР через межсубъединичные трансмембранные интерфейсы_
Общие анестетики и барбитураты
Барбитураты начали применяться в медицинской практике ещё в начале XX в. в качестве успокаивающих и снотворных средств, однако в настоящее время их применение ограничено из-за высокой вероятности случайной передозировки, возникновения привыкания и лекарственной зависимости [37, 38]. ФБЛ является противоэпилептиче-ским лекарственным средством, общие анестетики (ЭТМ и ПФЛ) используются в медицинской практике в качестве анестезирующих средств [37, 39].
Общие анестетики и барбитураты являются положительными аллостерическими модуляторами (ПАМ) ГАМКаР. В низких концентрациях они усиливают вызванные ГАМК токи [40-43], а в высоких концентрациях способны в отсутствие агониста активировать ГАМКаР [38, 44, 45]. Эксперименты по фотохимическому мечению [46-49], с использованием SCAMP-метода [48, 50, 51] и по направленному мутагенезу [52-55] показали, что сайты связывания этих веществ находятся в межсубъединичных интерфейсах ТМД.
Для облегчения сравнения различных субъединиц в области ТМД используется единая система обозначения остатков [56]. Высококонсервативные остатки Arg в N-терминальной части М2-спирали принимаются за пози-
М1
GABAAR al GABAAR_y2 GABAAR_ß2 GAßAAR_ß3
GlyRal M2
GABAA^al GABAA _y 2 GABAA_f32 GAEAA_|i3 GlyR_a3 Gl yR cfl
>33
GABAAR_al gabaar у2 GABAAR_p2 GABAAft_ß3 SlyR_a3
glyr «1
-22'
fhlkrkigïfviqtylpcimtvilsqv3fwlnr fdlsrrmgyftiqtyipctliwlswvsfwink fklkrhtgyftlqtympsilitilswvsfwtny frlkrnigyfilqtympsilitilswvsfwiny fh l e rqmg y yliqmïipsllivil swvsfhinm fhlerqmgyyliqmyipsllivilswisfwinm
О' 9'
e svpartvfgvttv ltmttl sis arn s l p кvay davfartslgittvltmttlstiarkslpkvsy dasaarvalgittvltmttinthlretlpkipy dasaarvalgittvltmttinthlretlpkipy daaparvalgittvltmttqssgsraslpkvsy daaparvgl gi tt v ltmttq s s g srasl pkvsy
36' 39'
atamdwf1avcyafvfsaliefatvnyftk
vtamdlfvsvcfifvfsalveygtlhyfvs
vkaidmy lmgcfvfvfmallëyalvnyi ff vkaidmylmgcfvfvflallëyafvnyiff vkaidiwmavcllfvfsalleyaavmfvsr vkaidiwmavcllfvfsalleyaavnfvsr
275 2 98 268 269 279 274
309 331
301
302 312
303
338 361
331
332 342 337
Рис. 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей Mj-M3-сегментов различных субъединиц ГАМКаР и глицинового рецептора.
Последовательности взяты из базы данных UniProt с идентификационными номерами ГАМК,а1 P14867, ГАМК,|32 P47870, ГАМКЮ P28472, ГГАМКА_у21^18507, GlyR_a1 O93430, GlyR_a3 O7531ПВыравнивание произведено относительно высококонсервативных остатков Arg в цитоплазматической части М2-спиралей (0'). Цифры справа обозначают номер последнего остатка в последовательности.
Fig. 4. Alignment of the amino acid sequences of the М1-М3 segments in the various subunits of the GABA, receptor and glycine receptor.
The sequences are taken from the UniProt database with the identification numbers GABA. al P14867, GABA. R2 P47870, GABA.R3 P28472, GABA^ P18507, GlyRjxl O9343D and GlyR_a3 O75311. The alignment was performed relative to the highly-conserved Arg residues in the cytoplasmic part of the M2 helices (0'). The numbers on the right indicate the number of the last residue in the sequence.
цию 0'. Далее при движении в направлении внеклеточного вестибюля канала происходит увеличение номера остатка на единицу, или уменьшение — при движении в противоположном направлении (рис. 4).
В Мгсегменте в позиции 22' различных субъединиц цис-петельных рецепторов (рис. 4) находится высококонсервативный остаток Pro, выше которого образуется короткий отрезок п-спирали. В ней каждый остаток связан водородной связью не с 4-м, как в a-спирали, а с 5-м по ходу спирали остатком. В результате у Мгспирали образуется изгиб, который расширяет проход из липидного бислоя в трансмембранный интерфейс в верхней (экстраклеточной) части ТМД (рис. 5, A-D). Таким образом, у ГАМКаР образуются 5 гомологичных полостей, в которых могут связываться небольшие молекулы ПАМ. Недавно были опубликованы крио-ЭМ-структуры alp2y2-ГАМKАР в комплексе с ЭТМ (6X3V), ПФЛ (6X3T) и ФБЛ (6X3W) [10]. ЭТМ и ПФЛ обнаружены в P+/a--, а ФБЛ — в у+/Р-- и a+/P--трансмембранных интерфейсах.
Связывание ЭТМ исключительно в р+^-интерфейсе подтверждается экспериментальными исследованиями [46, 52, 57]. В сайте связывания фенильное кольцо ЭТМ ориентировано в сторону ЭКД, метильная и имидазольная группы — к оси канала, а этиловый эфир — в сторону ли-пидного бислоя (рис. 5, A). Электростатические взаимодействия формируются между амидным азотом боковой цепи
Рис. 5. Связывание внутривенных анестетиков в ТМД.
A, B — ЭТМ (6X3V) и ПФЛ (6X3T) в Р+/а--интерфейсе. C — сайты связывания ФБЛ (6X3V) в а+/Р-- (вверху) и Р-/у+-(внизу) интерфейсах.
D — сайты связывания ДЗП (6X3X) в Р+/а-- (вверху) и Р-/у+-
Îвнизу) интерфейсах.
i A-D показаны только фрагменты Mj-Мз-спиралей. Обозначения в A-D соответствуют подписям к рис. 1 и 2.
Fig. 5. Intravenous anaesthetic bindingin the TMD.
A, B — ETM (6X3V) and PPF (6X3T) in the R+/œ- interface. C — binding sites of PBT (6X3V) in the а+/Р- (top) and the P-/y+ (bottom) interfaces.
D — binding sites of DZP (6X3X) in the р+/а- (top) and the P-/y+ (bottom) interfaces.
A-D show only fragments of the М,-М3 helices. Labels in A-D correspond to the terms in Fig. 1 and 2.
остатка 02 Asn265 (15') и п-электронами фенильного кольца ЭТМ. С остатком 02-Asn15' связана специфичность потенцирующего эффекта ЭТМ по отношению к рецепторам, содержащим 02/3-субъединицу. Мутация Asn15'Ser (гомологичный остаток в 01-субъединице) значительно снижала, а Asn15'Met полностью устраняла потенцирующее действие ЭТМ [52]. Сильные ван-дер-Ваальсовы взаимодействия формируются с гидрофобными остатками Мз-спирали 02-Phe289 (39'), Met286 (36') и Мгспирали a1-Met236 (-19'), Pro233 (-22').
Данные биохимических исследований указывают, что ПФЛ с различной аффинностью может связываться не только в в+/а--, но также в а+/в-- и у+/р--интерфейсах ГАМКаР [48, 58]. Однако в крио-ЭМ-структуре 6X3T связывание ПФЛ было обнаружено только в в+/а--интерфейсах [10]. ПФЛ формирует ван-дер-Ваальсовы контакты с гидрофобными остатками Мз-спирали P2-Phe289 (39'), Met286 (36'), а также Mi-спирали a1-Pro233 (-22'), Leu232 (-23'), Ile228 (-27'). ПФЛ образует водородную связь с атомом кислорода основной цепи остатка a1-Ile228 (-27') (рис. 5, B). В отличие от ЭТМ, ПФЛ не формирует электростатических контактов с P2-Asn15', а мутация последнего на Ser слабо влияла на его эффективность [59]. Однако мыши с внедрённой мутацией 03-Asn15'Met были нечувствительны к иммобилизирующему действию ПФЛ [60].
ФБЛ, в отличие от ЭТМ и ПФЛ, связывается в у+/Р-- и а+/в--трансмембранных интерфейсах (рис. 5, C). Моды связывания ФБЛ в двух различных интерфейсах полностью совпадают, кольцо барбитуровой кислоты глубоко заходит в интерфейс, а фенильное кольцо направлено от оси канала. Сайт связывания ФБЛ гомологичен сайтам ЭТМ и ПФЛ и находится на уровне остатка M2 15'. ФБЛ стабилизирован в сайте связывания в основном за счёт ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с гидрофобными остатками обеих субъединиц и формирует водородную связь с атомом кислорода основной цепи остатка -27' P2-Leu223 (рис. 5, C). Гомологами остатка 02-M2-Asn15' являются Ser270 в ai-субъединице и Ser280 в у2-субъединице. Структурные модели связывания ФБЛ в у+/Р-- и a+/P--интерфейсах предсказывают, что замещение Ser на Asn в позиции 15' приведёт к стерическо-му конфликту с ФБЛ.
Общие анестетики и барбитураты сходным образом влияют на кинетику ГАМК-токов. Аппликация ЭТМ, ПФЛ и ФБЛ приводила к увеличению длительности ГАМКергических постсинаптических токов за счёт увеличения постоянной времени деактивации рецептора [44, 61, 62]. Исследования одиночных ГАМКаР показали, что эти вещества не изменяют проводимость канала, но увеличивают вероятность перехода в открытое состояние [42, 61, 63, 64].
Все рассмотренные крио-ЭМ-структуры (6X3V, 6X3T и 6X3W) соответствуют десенситизированному состоянию ГАМКАР. Они характеризуются значительным сужением поры на уровне десенситизационных ворот (диаметр кольца -2' не превышает 3,3 Á) и значительным расширением поры (от 7,2 до 10,6 Á) на уровне активационных ворот за счёт поворота боковых цепей остатков Leu9' от оси поры. Таким образом, можно предположить, что связывание внутривенных анестетиков в трансмембранных интерфейсах влияет на геометрию М2-спиралей и способствует переходу активационных ворот рецептора к более открытой конформации.
A
B
ORIGINAL ARTICLES. Experimental neurology Structural pharmacology of GABAa receptors
Бензодиазепины
Наряду с высокоаффинным сайтом связывания ДЗП в а+/у--интерфейсе ЭКД были предсказаны низкоаффинные сайты связывания в ТМД ГАМКаР [65]. В недавно опубликованных крио-ЭМ-структурах а1в3у2- (6HUP) и а1в2у2-(6X3X) ГАМКаР сайты связывания ДЗП были обнаружены в в+/а-- [19] и в в+/а-- и у+/в--межсубъединичных интерфейсах [10] соответственно. Сайт связывания ДЗП в в+/а--интерфейсе перекрывается с сайтами связывания общих анестетиков, а сайт связывания в у+/в--интерфейсе перекрывается с одним из сайтов связывания барбитуратов.
Моды связывания ДЗП в структурах 6HUP и 6X3X в в+/а--межсубъединичных интерфейсах полностью совпадают, фе-нильное кольцо направлено к оси поры, бензольное кольцо частично заходит в интерфейс между М2- и М3-спиралями в-субъединицы (рис. 5, D). В сайте связывания ДЗП стабилизирован в основном за счёт гидрофобных взаимодействий с остатками в2/3-М3 Phe289 (39'), Met286 (36') и а1-М1 Pro233 (-22'), Leu232 (-23'), Met236 (-19'). Интересно, что ДЗП в у+/в--интерфейсе является энантиомером по отношению к его положению в в+/а--интерфейсе. ДЗП связывается выше остатка y2-Ser280 (15'), фенильное кольцо направлено от оси поры и взаимодействует с остатками у2-М3 Phe304 (39') и в2-М1 Pro228 (-22'), а бензольное кольцо располагается рядом с М2-спиралью у2-субъединицы (рис. 5, D).
Связывание ДЗП с 4 сайтами (1 в ЭКД и 3 в ТМД) делает открытое состояние ГАМКаР более стабильным. J.J. Kim с соавт. [10] установили, что структура ГАМКаР 6X3X (+ ГАМК, + 4ДЗП) стабильнее структуры 6X3Z (+ ГАМК) и намного более стабильна, чем структура 6X3U (+ ГАМК + флумазенил).
Интересно, что ни биохимические исследования, ни крио-ЭМ не показали возможности связывания ПАМ в а+/у--трансмембранном межсубъединичном интерфейсе. Этот интерфейс в литературе шуточно прозвали orphan site (сирота). Предполагается, что он занят или блокирован молекулами липидов [10].
Нейроактивные стероиды
Нейростероиды представляют собой стероидные гормоны, которые синтезируются в центральной и периферической нервной системе либо de novo из холестерина, либо путём метаболизма предшественников, переносимых кровью непосредственно в нервной ткани [66]. Нейростероиды являются эффективными модуляторами как синаптических, так и экстрасинаптических ГАМКаР [67, 68]. Различные нейростероиды могут оказывать как потенцирующее, так и ингибирующее действие на ГАМКаР. Мы ограничимся в этом обзоре обсуждением механизмов действия потенцирующих нейростероидов ввиду их важности для медицинской практики.
Интерес к терапевтическим свойствам потенцирующих нейростероидов связан с возможностью их использования в качестве анестетиков, противосудорожных препаратов и для лечения некоторых неврологических и психиатрических заболеваний [69]. В последние десятилетия некоторые синтетические нейростероиды были введены в терапевтическую практику [70], а в 2019 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медика-
ментов (США) одобрило использование в клинической практике нейростероида АЛП для лечения посттравматической депрессии [71].
АЛП является эндогенным ПАМ ГАМКаР. АЛП потенцировал вызванные ГАМК токи в культурах нейронов гиппо-кампа и спинного мозга крысы [72, 73] и при этом усиливал связывание агониста ГАМКаР 3Н-мусцимола и агониста сайта БЗД 3Н-флунитразепама [40, 72]. Интересно, что относительно высокие концентрации (>100 нМ) нейростеро-идов могут непосредственно активировать ГАМКаР в отсутствие ГАМК [67, 72].
Экспериментальные данные указывают на то, что сайт связывания нейростероидов отличается от сайтов связывания ГАМК, общих анестетиков, барбитуратов и БЗД. Эффекты, вызываемые барбитуратами и нейростероидами на связывание 3Н-мусцимола или 3Н-флунитразепама, являются аддитивными [40, 73]. G.D. Li с соавт. показали, что АЛП усиливает, а не подавляет фотохимическое мечение ГАМКАР 3Н-азиэтомидатом [74]. Фотохимическое мечение гомо-олигомерного РЗ-ГАМКаР при помощи 6-азипрегна-нолона выявило остаток М3-сегмента Phe301 (51'), который расположен на 4 витка спирали ниже остатка Met36', участвующего в связывании ЭТМ [75].
A
B
Рис. 6. Связывание нейростероида АЛП в р+/от-трансмембранном межсубъединичном интерфейсе.
A — полноразмерный в+/а--межсубъединичный интерфейс модели открытого а1р2у2-ГАМК»Р, построенной по гомологии c а1-глициновым рецептором (3JAE). Показано место связывания АЛП и электронные плотности, соответствующие ГАМК (ЭКД) и ЭТМ (ТМД).
B — сайт связывания АЛП в укрупнённом виде. Показаны фрагменты Mj-Мз-спиралей ТМД.
Обозначения в A, B соответствуют подписям к рис. 1 и 2.
Fig. 6. Binding of the neuroactive steroid ALP in the P+/«r transmembrane intersubunit interface.
A — a full size в+/а- intersubunit interface of an open аф2у2-GABA, receptor model, based on homology with the а1 glycine receptor (3JAE). The ALP binding site and the electron densities corresponding to GABA (ECD) and ETM (TMD) are shown. B — ALP binding site, magnified. Fragments of TMD Mj-M3 helices are shown.
Labels in A and B correspond to the terms in Fig. 1 and 2.
Структурная фармакология ГАМКА-рецепторов
В 2017 г. были опубликованы рентгеновские структуры химерных гомо-олигомерных в3-а5-ГАМКАР и GLIC-аг ГАМКаР в связанном с нейростероидами АЛП и тетраги-дродеоксикортикостероном состоянии [76, 77]. В обоих рецепторах место связывания нейростероидов оказалось в цитоплазматической части в+/а--трансмембранного интерфейса. Основываясь на этих данных, при помощи метода Монте-Карло минимизации мы построили структурную модель связывания АЛП в а1^2у2-ГАМКАР. Наша модель предсказывает, что АЛП связывается между М1- и Мз-спиралями в в+/а--межсубъединичном интерфейсе ТМД, формирует водородную связь с остатком а1-М Gln242 (-13'), а также образует сильные ван-дер-Ваальсовы связи с гидрофобными остатками а1-М:-Тгр246 (-9'), Val243 (-14'), 11е239 (-16') и в2-Мз Ьеи297 (47'), Ьеи301 (51') (рис. 6, А, В).
Как и БЗД, нейростероиды увеличивают частоту открываний одиночных каналов, а также, подобно внутривенным анестетикам, увеличивают длительность открытого состояния канала [68, 78]. Кроме того, нейростероиды увеличивают время спада ГАМКергических постсинаптических токов [79]. Поскольку АЛП связывается и взаимодействует с М1- и М3-сегментами в районе десенситизационных ворот ГАМКаР [80-82], можно предположить смещение равновесия в кинетике перехода рецептора из открытого в десен-ситизированное состояние в сторону открытой конформа-ции, что должно приводить к увеличению времени жизни канала в открытом состоянии.
Заключение
Ионотропные ГАМКаР являются основной мишенью для различных групп препаратов, которые действуют как общие анестетики, анксиолитики и антиконвульсанты. Механизмы модуляции ГАМКаР этими соединениями, локализация мест их связывания на рецепторе и вызываемые ими физиологические эффекты продолжают оставаться предметом многочисленных исследований.
В обзоре рассмотрены последние достижения в понимании структуры, функций и фармакологии ГАМКаР, современные данные о молекулярных механизмах и локализации мест связывания таких клинически значимых препаратов, как БЗД, общие анестетики, барбитураты, нейро-стероиды и др. Представленные данные иллюстрируют, как эти фармакологические соединения взаимодействуют с ГАМКаР, модулируя его конформацию и функцию. Молекулярные взаимодействия и последующие фармакологические эффекты, вызываемые этими веществами, сложны из-за структурной гетерогенности ГАМКаР и существования многочисленных аллостерически взаимосвязанных сайтов. Выявление и характеристика различных сайтов связывания на ГАМКаР позволяет получить важную информацию для разработки фармацевтических препаратов, которые могут быть использованы для лечения широкого спектра неврологических заболеваний и психических расстройств.
Список источников / References
1. Sieghart W Allosteric modulation of GABAa receptors via multiple drug-binding sites. Adv Pharmacol 2015;72:53-96. DOI: 10.1016/bs.apha.2014.10.002. PMID: 25600367.
2. Olsen R.W GABAa receptor: positive and negative allosteric modulators. Neuropharmacology 2018;136(Pt A):10-22. DOI: 10.1016/j.neuro-pharm.2018.01.036. PMID: 29407219.
3. Hille B. Ionic channels of excitable membrane. 3rd ed. Massachusetts, 2001.
4. Nemecz A., Prevost M.S., Menny A. et al. Emerging molecular mechanisms of signal transduction in pentameric ligand-gated ion channels. Neuron. 2016;90(3):452-470. DOI: 10.1016/j.neuron.2016.03.032. PMID: 27151638.
5. Sieghart W. Structure, pharmacology, and function of GABAa receptor subtypes. Adv Pharmacol. 2006;54:231-263. DOI: 10.1016/s1054-3589(06)54010-4. PMID: 17175817.
6. Hevers W., Luddens H. The diversity of GABAa receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAa channel subtypes. Mol Neurobiol. 1998;18(1):35-86. DOI: 10.1007/BF02741459. PMID: 9824848.
7. Mortensen M., Patel B., Smart T.G. GABA Potency at GABA receptors found in synaptic and extrasynaptic zones. Front Cell Neurosci. 2011;6:1. DOI: 10.3389/fncel.2012.00001. PMID: 22319471.
8. Keramidas A., Moorhouse A.J., Schofield P.R. et al. Ligand-gated ion channels: mechanisms underlying ion selectivity. Prog Biophys Mol Biol. 2004;86(2):161-204. DOI: 10.1016/j..pbiomolbio.2003.09.002. PMID: 15288758.
9. Laverty D., Desai R., Uchanski T. et al. Cryo-EM structure of the human a,ß,y, GABAa receptor in a lipid bilayer. Nature. 2019;565(7740):516-520. DOI: 10.1u38/s41586-018-0833-4. PMID: 30602789.
10. Kim J.J., Gharpure A., Teng J. et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 2020. 585(7824):303-308. DOI: 10.1038/s41586-020-2654-5. PMID: 32879488.
11. Sternbach L.H. The benzodiazepine story. J Med Chem. 1979;22(1):1-7. DOI: 10.1021/jm00187a001. PMID: 34039.
12. Sigel E., Mamalaki C., Eric A.B. Isolation of a GABA receptor from bovine brain using a benzodiazepine affinity column. FEBS Lett. 1982;147(1):45-48. DOI: 10.1016/0014-5793(82)81008-9. PMID: 6291997.
13. Sigel E., Stephenson F.A., Mamalaki C. et al. A gamma-aminobutyric acid/benzodiazepine receptor complex of bovine cerebral cortex. J Biol Chem. 1983;258(11):6965-6971. PMID: 6304068.
14. Sieghart W., Savic M.M. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. CVI: GABAA receptor subtype- and function-selective ligands: key issues in translation to humans. Pharmacol Rev. 2018;70(4):836-878. DOI: 10.1124/ pr.117.014449. PMID: 30275042.
15. Sigel E., Emst M. The benzodiazepine binding sites of GABAa receptors. Trends Pharmacol Sci. 2018;39(7):659-671. DOI: 10.1016/j.tips.2M8.03.006. PMID: 29716746.
16. Castellano D., Shepard R.D., Lu W. Looking for novelty in an "old" receptor: recent advances toward our understanding of GABARs and their implications in receptor pharmacology. Front Neurosci. 2020;14:616298. DOI: 10.3389/ fnins.2020.616298. PMID: 33519367.
17. Tan K.R., Rudolph U., Luscher C. Hooked on benzodiazepines: GABAa receptor subtypes and addiction. Trends Neurosci. 2011;34(4):188-197. DOI: 10.1016/j.tins.2011.01.004. PMID: 21353710.
18. Jacob T.C. Neurobiology and therapeutic potential of alpha5-GABA Type A receptors. Front Mol Neurosci. 2019;12:179. DOI: 10.3389/fnmol.2019.00179. PMID: 31396049.
19. Masiulis S., Desai R., Uchanski T. et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 2019;565(7740):454-459. DOI: 10.1038/s41586-018-0832-5. PMID: 30602790.
20. Wieland H.A., Luddens H., Seeburg P. A single histidine in GABAA receptors is essential for benzodiazepine agonist binding. J Biol Chem. 1992;267(3):1426-1429. PMID: 1346133.
21. Baur R., Sigel E. Benzodiazepines affect channel opening of GABAa receptors induced by either agonist binding site. Mol Pharmacol. 2005;67(4):1005-1008. DOI: 10.1124/mol.104.008151. PMID: 15657366.
22. Campo-Soria C., Chang Y., Weiss D.S. Mechanism of action of benzodiazepines on GABAa receptors. Br J Pharmacol. 2006;148(7):984-990. DOI: 10.1038/sj.bjp.0706796. PMID: 16783415.
23. Kim J.J., Hibbs R.E. Direct structural insights into GABAa receptor pharmacology. Trends Biochem Sci. 2021;46(6):502-517. DOI: 10.1016/j. tibs.2021.01.011. PMID: 33674151.
24. Safavynia S.A., Keating G., Speigel I. et al. Effects of gamma-amino-butyric acid type A receptor modulation by flumazenil on emergence from general anesthesia. Anesthesiology. 2016;125(1):147-158. DOI: 10.1097/ ALN.0000000000001134. PMID: 27111534.
25. Sanger D.J. The pharmacology and mechanisms of action of new generation, non-benzodiazepine hypnotic agents. CNS Drugs. 2004;18(Suppl 1):9—15; discussion 41, 43-15. DOI: 10.2165/00023210-200418001-00004. PMID: 15291009.
26. Hanson S.M., Morlock E.V., Satyshur K.A. et al. Structural requirements for eszopiclone and zolpidem binding to the gamma-aminobutyric acid type-A (GABAa) receptor are different. J Med Chem. 2008;51(22):7243-7252. DOI: 10.1021/jm800889m. PMID: 18973287.
Structural pharmacology of GABAa receptors
27. Li Z., Scheraga H.A. Monte Carlo-minimization approach to the multiple-minima problem in protein folding. Proc Natl Acad Sci USA. 1987;84(19):6611-6615. DOI: 10.1073/pnas.84.19.6611. PMID: 3477791.
28. Zhorov B.S. Vector method for calculating derivatives of energy of atom-atom interactions of complex molecules according to generalized coordinates. J Struct Chem. 1981; 22:4-8.
29. Rossokhin A., Teodorescu G., Grissmer S. et al. Interaction of d-tubocu-rarine with potassium channels: molecular modeling and ligand binding. Mol Pharmacol. 2006;69(4):1356-1365. DOI: 10.1124/mol.105.017970. PMID: 16391240.
30. Garden D.P., Zhorov B.S. Docking flexible ligands in proteins with a solvent exposure- and distance-dependent dielectric function. J Comput Aided Mol Des. 2010;24(2):91-105. DOI: 10.1007/s10822-009-9317-9. PMID: 20119653.
31. Rossokhin A., Dreker T., Grissmer S. et al. Why does the inner-helix mutation A413C double the stoichiometry of Kv1.3 channel block by emopamil but not by verapamil? Mol Pharmacol. 2011;79(4):681-691. DOI: 10.1124/ mol.110.068031. PMID: 21220411.
32. Rossokhin A. V., Sharonova I. N., Dvorzhak A. et al. The mechanisms of potentiation and inhibition of GABAa receptors by non-steroidal anti-inflammatory drugs, mefenamic and niflumic acids. Neuropharmacology. 2019;160:107795. DOI: 10.1016/j.neuropharm.2019.107795. PMID: 31560908.
33. Rossokhin A. The general anesthetic etomidate and fenamate mefenamic acid oppositely affect GABAAR and GlyR: a structural explanation. Eur Biophys J. 2020:49(7):591-607. DOI: 10.1007/s00249-020-01464-7. PMID: 32940715.
34. Tikhonova T. A., Rassokhina I. V., Kondrakhin E. A. et al. Development of 1,3-thiazole analogues of imidazopyridines as potent positive allosteric modulators of GABAa receptors. Bioorg Chem. 2020;94:103334. DOI: 10.1016/j.bio-org.2019.103334. PMID: 31711764.
35. Buhr A., Sigel E. A point mutation in the gamma2 subunit of gamma-am-inobutyric acid type A receptors results in altered benzodiazepine binding site specificity. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(16):8824-8829. DOI: 10.1073/ pnas.94.16.8824. PMID: 9238062.
36. Sancar F., Ericksen S.S., Kucken A.M. et al. Structural determinants for high-affinity zolpidem binding to GABA-A receptors. Mol Pharmacol. 2007;71(1):38-46. DOI: 10.1124/mol.106.029595. PMID: 17012619.
37. Franks N.P. Molecular targets underlying general anaesthesia. Br J Pharmacol. 2006; 147(Suppl 1):S72-S81. DOI: 10.1038/sj.bjp.0706441. PMID: 16402123.
38. Loscher W., Rogawski M.A. How theories evolved concerning the mechanism of action ofbarbiturates. Epilepsia. 2012;53(Suppl 8):12-25. DOI: 10.1111/ epi.12025. PMID: 23205959.
39. Forman S. A. Clinical and molecular pharmacology of etomidate. Anesthesiology. 2011;114(3):695-707. DOI: 10.1097/ALN.0b013e3181ff72b5. PMID: 21263301.
40. Peters J.A., Kirkness E.F., Callachan H. et al. Modulation of the GABAa receptor by depressant barbiturates and pregnane steroids. Br J Pharmacol. 1988;94(4):1257-1269. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1988.tb11646.x. PMID: 2850060.
41. Hales T.G., Lambert J.J. The actions of propofol on inhibitory amino acid receptors of bovine adrenomedullary chromaffin cells and rodent central neurones. Br J Pharmacol. 1991;104(3):619-628. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1991. tb12479.x. PMID: 1665745.
42. Yang J., Uchida I. Mechanisms of etomidate potentiation of GABAa receptor-gated currents in cultured postnatal hippocampal neurons. Neuroscience. 1996;73(1):69-78. DOI: 10.1016/0306-4522(96)00018-8. PMID: 8783230.
43. Krasowski M.D. Contradicting a unitary theory of general anesthetic action: a history of three compounds from 1901 to 2001. Bull. Anesth. Hist. 2003;21(3):1-24. PMID: 17494361. DOI: 10.1016/s1522-8649(03)50031-2.
44. Zhang Z.X., Lu H., Dong X.P. et al. Kinetics of etomidate actions on GABAa receptors in the rat spinal dorsal horn neurons. Brain Res. 2002;953(1-2):93-100. DOI: 10.1016/s0006-8993(02)03274-2. PMID: 12384242.
45. Ruesch D., Neumann E., Wulf H. et al. An allosteric coagonist model for propofol effects on alpha1beta2gamma2L gamma-aminobutyric acid type A receptors. Anesthesiology. 2012;116(1):47-55. DOI: 10.1097/ ALN.0b013e31823d0c36. PMID: 22104494.
46. Li G.D., Chiara D.C., Sawyer G.W. et al. Identification of a GABAa receptor anesthetic binding site at subunit interfaces by photolabeling with an etomidate analog. JNeurosci. 2006;26(45):11599-11605. DOI: 10.1523/JNEUROS-CI.3467-06.2006. PMID: 17093081.
47. Chiara D.C., Dostalova Z., Jayakar S.S. et al. Mapping general anesthetic binding site(s) in human аД y-aminobutyric acid type A receptors with [3H]TDBzl-etomidate, a photoreactive etomidate analogue. Biochemistry. 2012;51(4):836-847. DOI: 10.1021/bi201772m. PMID: 22243422.
48. Forman S.A., Miller K.W Mapping general anesthetic sites in hetero-meric y-aminobutyric acid type A receptors reveals a potential for targeting receptor subtypes. Anesth Analg. 2016;123(5):1263-1273. DOI: 10.1213/ ANE.0000000000001368. PMID: 27167687.
49. Jayakar S.S., Zhou X., Chiara D.C. et al. Identifying drugs that bind selectively to intersubunit general anesthetic sites in the а, p,y2 GABAaR transmembrane domain. Mol Pharmacol. 2019;95(6):615-628. DO Г 10.1124/mol.118.114975. PMID: 30952799.
50. Bali M., Akabas M.H. Defining the propofol binding site location on the GABAa receptor. Mol Pharmacol. 2004;65(l):68-76. DOI: 10.1124/mol.65.1.68. PMID: 1472223.
51. Stewart D.S., Hotta M., Li G.D. et al. Cysteine substitutions define etomidate binding and gating linkages in the alpha-M1 domain of gamma-aminobu-tyric acid type A (GABAA) receptors. J Biol Chem. 2013;288(42):30373-30386. DOI: 10.1074/jbc.M113.494583. PMID: 24009076.
52. Belelli D., Lambert J.J., Peters J.A. et al. The interaction ofthe general anesthetic etomidate with the gamma-aminobutyric acid type A receptor is influenced by a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(20):11031-11036. DOI: 10.1073/pnas.94.20.11031. PMID: 9380754.
53. Krasowskia M.D., Nishikawac K., Nikolaevaa N. et al. Methionine 286 in transmembrane domain 3 of the GABAA receptor p subunit controls a binding cavity for propofol and other alkylphenol general anesthetics. Neuropharmacology. 2001;41(8):952-964. DOI: 10.1016/s0028-3908(01)00141-1. PMID: 11747900.
54. Siegwart R., Krahenbuhl K., Lambert S. et al. Mutational analysis of molecular requirements for the actions of general anaesthetics at the gamma-aminobu-tyric acidA receptor subtype, alpha1beta2gamma2. BMC Pharmacol. 2003;3:13. DOI: 10.1186/1471-2210-3-13. PMID: 14613517.
55. Stewart D., Desai R., Cheng Q. et al. Tryptophan mutations at azi-etomidate photo-incorporation sites on alpha1 or beta2 subunits enhance GABAA receptor gating and reduce etomidate modulation. Mol Pharmacol. 2008;74(6):1687-1695. DOI: 10.1124/mol.108.050500. PMID: 18805938.
56. Miller C. Genetic manipulation of ion channels: a new approach to structure and mechanism. Neuron. 1989;2(3):1195-1205. DOI: 10.1016/0896-6273(89)90304-8. PMID: 2483110.
57. Siegwart R., Jurd R., Rudolph U. Molecular determinants for the action of general anesthetics at recombinant alpha2beta3gamma2 gamma-aminobutyric acid A receptors. J Neurochem. 2002;80(1):140-148. DOI: 10.1046/j.0022-3042.2001.00682.x. PMID: 11796752.
58. Eaton M.M., Germann A.L., Arora R. et al. Multiple non-equivalent interfaces mediate direct activation of GABAA receptors by propofol. Curr Neuro-pharmacol. 2016;14(7):772-780. DOI: 10.2174/1570159x14666160202121319. PMID: 26830963.
59. Reynolds D.S., Rosahl T.W, Cirone J. et al. Sedation and anesthesia mediated by distinct GABAA receptor isoforms. J Neurosci. 2003;23(24):8608-8617. DOI: 10.1523/JNEURDSCI.23-24-08608.2003. PMID: 13679430.
60. Jurd R., Arras M., Lambert S. et al. General anesthetic actions in vivo strongly attenuated by a point mutation in the GABAa receptor beta3 subunit. FASEB J. 2003;17(2):250-252. DOI: 10.1096/fj.02-0611fje. PMID: 12475885.
61. Orser B.A., Wang L.Y., Pennefather P.S. et al. Propofol modulates activation and desensitization of GABAa receptors in cultured murine hippocampal neurons. J Neurosci. 1994;14(12):7747-7760. DOI: 10.1523/JNEUROSCI. 14-12-07747.1994. PMID: 7996209.
62. Mathers D.A., Wan X., Puil E. Barbiturate activation and modulation of GABAa receptors in neocortex. Neuropharmacology. 2007;52(4):1160-1168. DOI: 10.1016/j.neuropharm.2006.12.004. PMID: 17289092.
63. Parker I., Gundersen C.B., Miledi R. Actions of pentobarbital on rat brain receptors expressed in Xenopus oocytes. J Neurosci. 1986;6(8):2290-2297. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.06-08-02290.1986. PMID: 2875136.
64. Kitamura A., Sato R., Marszalec W. et al. Halothane and propofol modulation of gamma-aminobutyric acidA receptor single-channel currents. Anesth Analg. 2004;99(2):409-415. DOI: 10.1213/01.ANE.0000131969.46439.71. PMID: 15271715.
65. Walters R.J., Hadley S.H., Morris K.D. et al. Benzodiazepines act on GABAa receptors via two distinct and separable mechanisms. Nat Neurosci. 2000;3A12):1274-1281. DOI: 10.1038/81800. PMID: 11100148.
66. Baulieu E.E. Neurosteroids: of the nervous system, by the nervous system, for the nervous system. Recent Prog Horm Res. 1997;52:1-32. PMID: 9238846.
67. Belelli D., Lambert J.J. Neurosteroids: endogenous regulators of the GABAa receptor. Nat Rev Neurosci. 2005;6(7):565-575. DOI: 10.1038/nm1703. PMID: 15959466.
68. Belelli D., Hogenkamp D., Gee K.W. et al. Realising the therapeutic potential of neuroactive steroid modulators of the GABAa receptor. Neurobiol Stress. 2020;12:100207. DOI: 10.1016/j.ynstr.2019.100207. PMID: 32435660.
69. Reddy D.S., Estes W.A. Clinical potential of neurosteroids for CNS disorders. Trends Pharmacol Sci. 2016;37(7):543-561. DOI: 10.1016/j.tips.2016.04.003. PMID: 27156439.
70. Reddy D.S. Pharmacology of endogenous neuroactive steroids. Crit Rev Neurobiol. 2003;15(3-4):197-234. DOI: 10.1615/critrevneurobiol.v15.i34.20. PMID: 15248811.
71. Zorumski C.F., Paul S.M., Covey D.F. et al. Neurosteroids as novel antidepressants and anxiolytics: GABAa receptors and beyond. Neurobiol Stress. 2019;11:100196. DOI: 10.1016/j.ynstr.2019.100196. PMID: 31649968.
72. Majewska M.D., Harrison N.L., Schwartz R.D. et al. Steroid hormone metabolites are barbiturate-like modulators of the GABA receptor. Science. 1986;232(4753):1004-1007. DOI: 10.1126/science.2422758. PMID: 2422758.
73. Turner D.M., Ransom R.W, Yang J.S.J. et al. Steroid anesthetics and naturally-occurring analogs modulate the gamma-aminobutyric acid receptor complex at a site distinct from barbiturates. J Pharmacol Exp Ther. 1989;248(3):960-966. PMID: 2539464.
Структурная фармакология ГАМКд-рецепторов
74. Li G.D., Chiara D.C., Cohen J.B. et al. Neurosteroids allosterically modulate binding of the anesthetic etomidate to gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 2009;284(18):11771-11775. DOI: 10.1074/jbc.C900016200. PMID: 19282280.
75. Chen Z.W., Manion B., Townsend R.R. et al. Neurosteroid analog pho-tolabeling of a site in the third transmembrane domain of the beta3 subunit of the GABAA receptor. Mol Pharmacol. 2012;82(3):408-419. DOI: 10.1124/ mol.112.078410. PMID: 22648971.
76. Laverty D., Thomas P., Field M. et al. Crystal structures of a GABAA-re-ceptor chimera reveal new endogenous neurosteroid-binding sites. Nat Struct Mol Biol. 2017;24(11):977-985. DOI: 10.1038/nsmb.3477. PMID: 28967882.
77. Miller P.S., Scott S., Masiulis S. et al. Structural basis for GABAA receptor potentiation by neurosteroids. Nat Struct Mol Biol. 2017;24(11):986-992. DOI: 10.1038/nsmb.3484. PMID: 28991263.
78. Twyman R.E., Macdonald R.L. Neurosteroid regulation of GABAA receptor single-channel kinetic properties of mouse spinal cord neurons in culture. J Physiol. 1992;456:215-245. DOI: 10.1113/jphysiol.1992.sp019334. PMID: 1338096.
79. Lambert J.J., Belelli D., Peden D.R. et al. Neurosteroid modulation of GABAA receptors. Prog Neurobiol. 2003;71(1):67-80. DOI: 10.1016/j.pneuro-bio.20(B.09.001. PMID: 14611869.
80. Gielen M., Thomas P., Smart T.G. The desensitization gate of inhibitory Cys-loop receptors. Nat Commun. 2015;6:6829. DOI: 10.1038/ncomms7829. PMID: 25891813.
81. Rossokhin A.V., Zhorov B.S. Side chain flexibility and the pore dimensions in the GABAA receptor. J Comput Aided Mol Des. 2016;30(7):559-567. DOI: 10.1007/s10822-016-9929-9. PMID: 27460059.
82. Rossokhin A.V. Homology modeling of the transmembrane domain of the GABAa receptor. Biophysics. 2017;62(5):708-716. DOI: 10.1134/ s0006350917050190.
Информация об авторах
Россохин Алексей Владимирович — к.ф-м.н., в.н.с. лаб. функциональной синаптологии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия, orcid.org/0000-0001-7024-7461
Шаронова Ирина Николаевна — д.б.н., в.н.с. лаб. функциональной синаптологии ФГБНУ НЦН, Москва, Россия, orcid.org/0000-0001-9955-1870
Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.
Information about the authors
Alexey V. Rossokhin — Cand. Sci. (Phys.-Math.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology, Research Center of Neurology, Moscow, Russia, orcid.org/0000-0001-7024-7461
Irina N. Sharonova — D. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology, Research Center of Neurology, Moscow, Russia, orcid. org/0000-0001-9955-1870
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
