CC BY
6DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-30-77-84 УДК 575.89
С. С. Левыкина, Н. В. Воронова, Ю. В. Бондаренко
СТРУКТУРА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА MACROSIPHUM ALBIFRONS ESSIG, 1911 — ОПАСНОГО ВРЕДИТЕЛЯ ЛЮПИНА
Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т Независимости, 4 e-mail: nvoronova@bsu.by
В настоящей работе приведена информация по сборке, аннотации и результатам структурного анализа митохондриального генома тли Macrosiphum albifrons. Митохондриальный геном M. albifrons имеет пред-ковую структуру и отклонение в сторону содержания адениновых оснований вследствие насыщенности ими региона повторов. Показано наличие полного набора тРНК, в 14 из которых спаренные основания являются аберрантными.
Ключевые слова: тли, митохондриальный геном, Macrosiphum albifrons, аннотация, тРНК.
Введение
Семейство настоящие тли (Aphididae) — обширный таксон из отряда полужесткокрылых насекомых с рядом специфических характеристик, привлекающих внимание исследователей к его представителям. Для тлей характерен быстрый темп роста популяций вследствие наличия облигатного циклического партеногенеза, наличие различающихся морф внутри одного годичного цикла. При благоприятных условиях эти фитофаги способны к взрывному наращиванию численности, что в конечном счете приводит к потере значительной части урожая и финансовым убыткам в случае, когда речь идет о видах, наносящих ущерб непосредственно промыш-ленно культивируемым культурам.
Люпиновая тля (Macrosiphum albifrons Essig) впервые была отмечена на территории Республики Беларусь в 2010 г. [1].M. albifrons специализируется на представителях рода Lupinus. Ввиду широкого возделывания люпина как сельскохозяйственной и декоративной культуры, на данный момент люпиновая тля отмечается на территории всех агроклиматических областей Беларуси, являясь при этом переносчиком вирусных заболеваний люпина. Питание M. albifrons приводит к хло-ротизации листьев и нарушению нормального протекания различных физиолого-биохими-ческих процессов в растении. Продолжительное питание тли приводит к угнетению
роста люпина и, следовательно, снижению выхода конечной продукции — зеленой биомассы и семян, которые активно используют на территории Республики Беларусь в качестве компонента кормовой базы в сфере животноводства.
В настоящее время в комплекс вредителей люпина входит порядка пятидесяти различных видов [2]. Люпиновая тля относительно недавно пополнила данный перечень, являясь инвазивным для фауны Европы видом [3]. Не исключено, что в ближайшие годы M. albifrons сформирует сплошной ареал территории Республики Беларусь, по причине расширения территории возделывания люпина, а также произрастания люпина многолистного (Lupinus polyphyllus Lindl.) в лесных массивах [4]. В отличающихся от привычных для M. albifrons природно-климатических условиях, не исключена вероятность его расселения на другие виды растений как результат процессов адаптивной микроэволюции.
У насекомых митохондриальный геном имеет небольшой размер, что делает его удобной моделью для изучения микроэволюционных процессов [5-7]. В его кольцевой структуре локализованы 13 белок-кодирующих генов, 22 гена транспортных РНК и 2 гена рибосомальных РНК большой и малой субъединицы митохондриальных рибосом [8, 9]. Гены в митохондриальном геноме могут
частично перекрываться, нередко несколько нуклеотидов одновременно относятся как к старт-кодону гена, так и к терминирующему кодону вышележащего гена. Интересной особенностью митохондриального генома насекомых является отсутствие полноценного терминирующего кодона в белок-кодирую-щем гене Nad4. Его нуклеотидная последовательность заканчивается единичным ти-миновым основанием и предполагается, что полноценный стоп-кодон ТАА формируется после завершения транскрипции, на стадии аденилирования мРНК.
Несмотря на количество накопленных на сегодняшний момент данных о митохондри-альных геномах насекомых, некоторые особенности структуры митогенома до сих пор плохо изучены. Так, например, филогенетическая применимость, причина сдвига базовой асимметрии нуклеотидов и функции количественного и качественного состава нуклеотидных повторов в регионе формирования D-петли окончательно не установлены.
Митохондриальные геномы являются значимым объектом исследований в области молекулярной эволюции. В последние десятилетия митохондриальная ДНК используется при определении генетической структуры популяции внутри вида, а также при определении филогенетической близости между видами. Особый интерес представляют митохондри-альные перестройки генов у разных видов из-за их редкости, в связи с эволюционно сложившейся консервативности в организации структуры у тлей [10, 11].
Нуклеотидные последовательности мито-хондриальных геномов используются не только при исследовании насекомых, но и других животных. Использование в популяционно-ге-нетических и филогенетических исследованиях отдельных генов митогенома уже считается классическим приемом [12, 13]. Так, например, участок гена Сох1 активно используется в качестве общепризнанного универсального филогенетического маркера для животных, а гены рибосомальных РНК применяются для построения филогений на уровне классов [14]. На сегодняшний момент из более чем 5000 описанных видов тлей из 24 подсемейств, нуклеотидные последовательности полных митохондриальных геномов известны
только для 43 видов из 6 подсемейств [15]. Ограниченный ресурс доступных митохон-дриальных геномов затрудняет проведение сравнительных исследований. Так, например, митогеномы для тлей родаMacrosiphum в ну-клеотидных базах данных отсутствуют, в то время как среди рода Aphis представлены для 4 видов (A. gossypii NC024581.1, A. glycines МК1ПШ, A. fabae mordvilkoi MG897128, A. craccivora MT095075, A. craccivora KX447142.1, A. craccivoraNC_031387.1), некоторые из которых продублированы.
В рамках этой работы мы поставили перед собой задачу изучить структурную организацию митохондриального генома M. albifrons, данные о котором будут представлены впервые для науки. Расшифрованный митогеном позволит проводить исследования внутрипопуляци-онной структуры экономически значимого для Беларуси инвайдера M. albifrons.
Материалы и методы
Колония M. albifrons была собрана в г. Минске (Беларусь) с Lupinus luteus. Собранные образцы хранили в спирте с концентрацией 96% при температуре -80 °C. Видовая принадлежность образцов была подтверждена кандидатом биологических наук, доцентом Д. Г. Жоровым на основании существующих морфологических и морфометрических ключей. Тотальная ДНК была выделена с использованием набора. Blood-Animal-Plant DNA Preparation Kit (Jena Bioscience). Пробоподготовка проводилась с использованием библиотеки Truseq 350. Сек-венирование было проведено по технологии Illumina на приборе miseq в Республике Корея, после чего полученные результаты были переданы в виде не подвергнутых какой-либо обработке данных. Объем полученных данных составил 45 GB, что соответствует примерно 100-кратному покрытию генома. Митохондри-альный геном был извлечен и собран с использованием NovoPlasty v. 2.7.1 [16].
Аннотация митохондриального генома была осуществлена путем гомологичного выравнивания с доступными последовательностями близкородственных видов из Genbank NCBI, с последующей ручной валидацией полученных данных (табл. 1).
Все тРНК-гены M. albifrons были идентифицированы при помощи онлайн-сервиса
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности, используемые для аннотации митогенома M. albifrons
Название вида Подсемейство Триба Код доступа в Genbank
Sitobion avenae NC_024683.1
Diuraphis noxia Macrosiphini NC_022727.1
Cavariella salicicola NC_022682.1
Indomegoura indica NC_045897
Aphis craccivora Aphidinae NC_031387.1
Aphis craccivora KX447142.1
Aphis gossypii Aphidini NC_045897
Aphis aurantii MN397939
Aphis citricidus NC_043903
Cervaphis quercus Greenideinae Cervaphidini NC_024926.1
Greenidea psidii Greenideini NC_041198.1
Floraphis meitanensis Eriosomatinae Fordini MF043990.1
Eriosoma lanigerum Eriosomatini KP722582.1
ARWEN [17] с дополнительной визуализацией в программе VARNA [18]. Локализацию региона повторов и региона формирования D-петли определяли по границам соседних генов. Тандемные повторы в данных областях были обнаружены с помощью веб-сервера Tandem Repeats Finder [19]. Шпилечная структура D-петли была визуализирована также при помощи программы VARNA. Карта митохондриального генома M. albifrons была построена в программе SnapGene с соблюдением реальных генных пропорций (GSL Biotech; на сайте snapgene.com). Нуклеотидный состав была рассчитана при помощи анализа Compute Nucleotide Composition в программе MEGAX [20].
Последовательность полного митохондриального генома M. albifrons была депонирована в GenBank NCBI, где ей был присвоен следующий код доступа — MW659868.
Результаты и обсуждение
Размер полного митохондриального генома M. albifrons составил 15,395 Kb. Содержание аденин-тиминовых оснований в митохон-дриальной ДНК составило 84,1%. В целом такая картина является довольно типичной для митохондриальных геномов тлей трибы Macrosiphini [21]. Высокое содержание аденин-тиминовых оснований характерно
для митохондриальных геномов тлей ввиду высокой консервативности этих геномов и обычно отличается не более, чем на десятые доли процента, иногда — несколько процентов [22], в то время как нуклеотидный состав среди близкородственных видов варьирует в широком диапазоне [23, 24].
В представленном геноме пропорция (А+Т)/ ^+С)>80/20 наблюдаете во всех функциональных областях (табл. 2).
Все белок-кодирующие гены показали высокое смещение нуклеотидного состава в сторону адениновых и тиминовых оснований. Содержание А+Т нуклеотидов в разных областях митохондриального генома М albifrons варьировалось в области значений 82,3-88,7%. Наиболее насыщенным аденин-тиминовыми основаниями оказался регион повторов, что объясняется наличием в данной области множества АТ-повторов, характерных для этого участка. В целом в белок-ко-дирующих генах наблюдается отрицательное значение АТ- и GC- отклонения, что означает преимущественное содержание тиминовых и цитозиновых оснований в генах. Аналогичное предпочтение выявлено для области формирования D-петли. Интересно, что в целом по геному наблюдается АТ-смещение в сторону аденина в сравнении с тимином, несмотря на то, что сумма длин областей,
Таблица 2
Нуклеотидный состав митохондриального генома M. albifrons
Область Содержание нуклеотидов, % Длина, п. н.
A T G C A+T AT-отклонение GC- отклонение
Полный геном 45,3 38,8 5,9 10,0 84,1 0,077 -0,261 15395
Белок-кодирующие гены 35,5 48,1 7,8 8,6 83,5 -0,150 -0,050 10971
Белок-кодирующие гены (+)-цепи 38,5 43,8 6,9 10,8 82,3 -0,064 -0,224 6756
Белок-кодирующие гены (-)-цепи 30,6 54,9 9,3 5,1 85,5 -0,284 0,292 4215
Гены тРНК 44,6 40,7 6,1 8,6 85,3 0,046 -0,170 1445
Гены рРНК 46,1 38,6 5,1 10,3 84,7 0,089 -0,340 2039
Регион Б-петли 42,6 42,7 4,9 9,7 85,3 -0,002 -0,326 648
Регион повторов 57,2 31,5 1,6 9,7 88,7 0,289 -0,724 257
Примечание. Все стоп-кодоны белок-кодирующих генов были исключены из анализа
использующих преимущественно аденино-вые основания, значительно ниже. Так, суммарная длина нуклеотидов для тРНК, рРНК и региона повторов составляет 3741 п. н., а для белок-кодирующих генов и региона D-петли — 11619 п. н.
В результате аннотации было установлено наличие в митогеноме М albifrons полного набора белок-, тРНК- и рРНК-кодирующих генов. Регион повторов и область формирования D-петли были отмечены в теоретически ожидаемой локализации (табл. 3). Дополнительно регион повторов был верифицирован путем обнаружения в нем нуклеотидных повторов, а область локализации D-петли — путем обнаружения консервативных доменов, характерных для данного участка, при анализе картины выравнивания.
Для митохондриального генома М albifrons установлено наличие семнадцати случаев перекрытия генов, среди которых один общий нуклеотид встречается семь раз, три раза — по семь общих нуклеотидов у двух генов, два случая перекрытия наблюдается для трех нуклеотидов, и по одному разу присутствует перекрытие в размере двух, четырех, пяти, одиннадцати и двадцати нуклеотидов. Также между некоторыми генами обнаруживаются короткие некодирующие вставки, преимущественно от одного до семи нуклеотидов. Исключение составляют гены Nad5
и his, вставка между которыми составляет 49 нуклеотидов.
Порядок генов в митохондриальном геноме M. albifrons соответствует таковому у так называемой предковой формы митохондриального генома насекомых (рис. 1).
Суммарная длина всех тРНК составила 1445 п. н., с диапазоном длины в 62-75 нуклеотидов для единичных генов. Сконструированные модели для тРНК представляют собой классическую вторичную структуру «клеверного листа» (рис. 2), с характерным для насекомых отсутствием дигидроуриди-новой петли в одной из двух моделей тРНК-серина. В структуре всех тРНК суммарно было обнаружено 22 случая неканонического спаривания нуклеотидов (16 случаев GU и 6 UU пар) во всех структурных частях тРНК. Обычно аминоацильный стебель у тлей наиболее консервативен по длине и составляет 7 канонических пар нуклеотидов [25], однако в митогеноме M. albifrons длина данной структуры варьирует, в том числе содержит нестандартные пары оснований. В митохон-дриальном геноме M. albifrons нуклеотидные пары GU и UU обнаружены в 14 из 22 тРНК. На сегодняшний день доподлинно не известно, являются ли аберрантные тРНК функциональными в митогеномах, предложен только теоретический механизм посттранскрипционного редактирования РНК [26].
Таблица 3
Структурная аннотация митохондриального генома M. albifrons
Название области Продукт/функциональное назначение Координаты в геноме Длина, н. н. Кодирующая цепь
Cox1 Субъединица I цитохром с оксидазы 1-1536 1536 +
leu тРНК лейцина 1532-1599 68 +
Cox2 Субъединица II цитохром с оксидазы 1603-2274 672 +
lys тРНК-лизина 2276-2350 75 +
asp тРНК-аспарагиновой кислоты 2350-2412 63 +
Atp8 Субъединица VIII АТФ-синтазы F0 2422-2571 150 +
Atp6 Субъединица VI АТФ-синтазы F0 2552-3205 654 +
Cox3 Субъединица III цитохром с оксидазы 3205-3990 786 +
gly тРНК-глицина 3990-4052 63 +
Nad3 Субъединица III НАДН-дегидрогеназы 4050-4406 357 +
ala тРНК-аланина 4407-4470 64 +
arg тРНК-аргинина 4470-4534 65 +
asn тРНК-аспарагина 4535-4598 64 +
ser тРНК-серина 4598-4659 62 +
glu тРНК-глутаминовой кислоты 4663-4726 64 +
Rep_region Область повторов 4727-4983 257 +
phe тРНК-фенилаланина 4984-5048 65 -
Nad5 Субъединица V НАДН-дегидрогеназы 5049-6719 1671 -
his тРНК-гистидина 6769-6833 65 -
Nad4 Субъединица IV НАДН -дегидрогеназы 6834-8156 1323 -
Nad4L Субъединица IV L НАДН -дегидрогеназы 8150-8443 294 -
thr тРНК-треонина 8442-8503 62 +
pro тРНК-пролина 8505-8572 68 -
Nad6 Субъединица VI НАДН -дегидрогеназы 8564-9067 504 +
CytB Цитохром B 9067-10182 1116 +
ser тРНК-серина 10191-10255 65 +
Nad1 Субъединица I НАДН -дегидрогеназы 10266-11201 936 -
leu тРНК-лейцина 11202-11266 65 -
rrnL 16S рРНК 11260-12527 1268 -
val тРНК-валина 12527-12590 64 -
rrnS 12S рРНК 12603-13373 771 -
D-loop Область D-петли 13374-14021 648
ile тРНК-изолейцина 14022-14085 64 +
gln тРНК-глутамина 14083-14148 66 -
met тРНК-метионина 14158-14223 66 +
Nad2 Субъединица II НАДН -дегидрогеназы 14224-15201 978 +
trp тРНК-триптофана 15198-15267 70 +
cys тРНК-цистеина 15257-15325 69 -
tyr тРНК-тирозина 15329-15394 66 -
Рис. 1. Карта митохондриального генома М. а1Ыргвт'
Рис. 2. Вторичная структура тРНК М. а1Ыргвт
Заключение
Анализ структурного состава митохондриального генома M. albifrons показал, что ми-тогеном данного вида тли обладает предковой, или классической, структурой. Нуклеотидный состав генома в отношении содержания АТ-нуклеотидов смещена в сторону аденина по причине высокого содержания адениновых оснований в регионе повторов (57,2%). В ми-тохондриальном геноме M. albifrons присутствует полный набор тРНК.
Список использованных источников
1. Buga, S. V. Aphids of the tribe Macrosiphi-ni (Insecta: Homoptera: Aphididae) in Belarus. / S. V. Buga, A. V. Stekolshchikov // Zoosystem-atica Rossica. - 2012. - Vol. 21, № 1. - Р. 63-96.
2. Вирусные болезни люпина и меры борьбы с ними / А. Л. Амбросов [и др.]; Белорус. НИИ защиты растений. - Минск: Ураджай, 1985. - 77 с.
3. Жоров, Д. Г. Инвазивные виды гемипте-роидных насекомых (Insecta: Hemipteroidea) Беларуси (таксономический состав, экологические группы, географическое распространение, биологические основы вредоносности): автореф. ... дис. канд. биол. наук: 03.02.05 / Д. Г. Жоров; БГУ - Минск, 2017. -25 с.
4. Буга, С. В. Современные тренды динамики географического распространения на территории Беларуси инвазивных видов беспозвоночных-фитофагов/С. В. Буга, Д. Г. Жоров, О. В. Синчук // Земледелие и защита растений. - 2016. - № 3. - С. 34-37.
5. Phylogenetic relationship and characterization of the complete mitochondrial genome of the black citrus aphid, Aphis aurantii (He-miptera: Aphididae) / Y. Wang [et. al.] // Mitochondrial DNA Part B. - 2019. - Vol. 4, № 2. -P. 3567-3568.
6. Molecular evolutionary trends and feeding ecology diversification in the Hemiptera, anchored by the milkweed bug genome / K. A. Pan-filio [et al.] // Genome Biol. - 2019. - Vol. 20, № 1. - P. 64.
7. The genome sequence of the grape phylloxera provides insights into the evolution, adaptation, and invasion routes of an iconic pest / C. Rispe [et. al.] // BMC Biology. - 2020. -Vol. 18, № 1. - P. 90.
8. Wolstenholme, D. R. Animal Mitochondrial DNA: Structure and Evolution / D. R. Wolstenholme // International Review of Cytology. - Elsevier, 1992. - Vol. 141. - P. 173-216.
9. Boore, J. L. Animal mitochondrial genomes / J. L. Boore // Nucleic Acids Res. -1999. - Vol. 27, № 8. - P. 1767-1780.
10. Cameron, S. L. Insect Mitochondrial Genomics: Implications for Evolution and Phylog-eny / S. L. Cameron // Annu. Rev. Entomol. -2014. - Vol. 59, № 1. - P. 95-117.
11. Deducing the pattern of arthropod phytogeny from mitochondrial DNA rearrangements / J. L. Boore [et al.] // Nature. - 1995. - Vol. 376, № 6536. - P. 163-165.
12. Doerder, F. P. Barcodes Reveal 48 New Species of Tetrahymena, Dexiostoma, and Glaucoma: Phylogeny, Ecology, and Biogeography of New and Established Species / F. P. Doerder // Journal of Eukaryotic Microbiology. - 2019. -Vol. 66, № 1. - P. 182-208.
13. Applying plant DNA barcodes for Rosa-ceae species identification / X. Pang [et al.] // Cladistics. - 2011. - Vol. 27, № 2. - P. 165-170.
14. Barcoding for diatoms in the Yangtze River from the morphological observation and 18S rDNA polymorphic analysis / Z. Li [et al.] // Forensic Science International. - 2019. -Vol. 297. - P. 81-89.
15. Zhang H. [et al.] The First Complete Mi-tochondrial Genome of Lachninae Species and Comparative Genomics Provide New Insights into the Evolution of Gene Rearrangement and the Repeat Region // Insects. - 2021. - Vol. 12, № 1. - P. 55.
16. Dierckxsens, N. NOVOPlasty: de novo assembly of organelle genomes from whole genome data / N. Dierckxsens, P. Mardulyn, G. Smits // Nucleic Acids Research. - 2017. -Vol. 45, № 4. - P. e18.
17. Laslett, D. ARWEN: a program to detect tRNA genes in metazoan mitochondrial nu-cleotide sequences / D. Laslett, B. Canback // Bioinformatics. - 2008. - Vol. 24, № 2. -P. 172-175.
18. Darty, K. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure / K. Darty, A. Denise, Y. Ponty // Bioinformatics. -2009. - Vol. 25. - P. 1974-1975.
19. Benson, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences / G. Benson //
Nucleic Acids Research. - 1999. - Vol. 27, № 2. - P. 573-580.
20. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms / S. Kumar [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2018. - Vol. 35, № 6. - P. 1547-1549.
21. Zhang, B. [et al.] The mitochondrial genome of the Russian wheat aphid Diuraphis noxia: Large repetitive sequences between trnE and trnF in aphids // Gene. - 2014. - Vol. 533, № 1. - P. 253-260.
22. Chen, J. [et al.] The mitochondrial genome of Greenidea psidii van der Goot (Hemiptera: Aphididae) and comparisons with other Aphi-didae aphids // Int J Biol Macromol. - 2019. -Vol. 122 - P. 824-832.
23. Mao, M. [et al.] The complete mitochondrial genome of Macrosteles quadrilineatus (Hemiptera: Cicadellidae) // null. - 2017. - Vol. 2, № 1. - P. 173-175.
24. Wu F. [et al.] The complete mitochondrial genome sequence of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) // Mitochondrial DNA Part B. -2016. - Vol. 1, № 1. - C. 239-240.
25. Wang, Y. [et al.] Comparative Analysis of Mitochondrial Genomes of Five Aphid Species (Hemiptera: Aphididae) and Phylogenetic Implications // PLOS ONE. - 2013. - Vol. 8, № 10. -P. e77511.
26. Schneider, A. Mitochondrial tRNA import: are there distinct mechanisms? // Trends Cell Biol. - 2000. - Vol. 10, № 12. - P. 509-513.
S. S. Levykina, N. V. Voronova, Y. V. Bandarenka
MITOCHONDRIAL GENOME STRUCTURE OF MACROSIPHUM ALBIFRONS ESSIG, 1911 — A DANGEROUS PEST OF LUPINE
Belarusian State University 4 Nezavisimosty Ave., 220030 Minsk, Belarus e-mail: nvoronova@bsu.by
This work provides information on the assembly, annotation, and results of the structural analysis of the Macrosiphum albifrons mitochondrial genome. The mitochondrial genome of M. albifrons has an ancestral ability and a deviation towards the content of adenine bases in their saturation region of repeats. The presence of a complete set of tRNAs was shown, in 14 of which the paired bases are aberrant.
Keywords: aphids, mitochondrial genome, Macrosiphum albifrons, annotation, tRNA.
Дата поступления статьи: 1 марта 2021 г.
