CC BY
84
УДК 541.64 + 547(495.9 + 333.3,4)
СТРУКТУРА ГУАНИДИНСОДЕРЖАЩИХ (СО) ПОЛИМЕРОВ И ИХ БИОЦИДНЫЕ И ТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
© 2012 г. Ю.А. Малкандуев1, С.Ю. Хаширова1, А.И. Сарбашева1, М.Х. Байдаева1, А.И. Мартыненко2, Н.И. Попова2, Н.А. Сивов2, С.М. Балаева1
1Кабардино-Балкарский государственный университет, ул. Чернышевского, 173, г. Нальчик, КБР, 360004, bsk@rect.kbsu.ru
2Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук, Ленинский проспект, 29, г. Москва, ГСП-1, 119991, sivov@ips.ac.ru
1Kabardino-Balkar State University, Chernishevskiy St., 173, Nalchik, KBR, 360004, bsk@rect.kbsu.ru
2A.V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis of Russian Academy of Sciences, Leninskiy Ave, 29, Moscow, GSP-1, 119991, sivov@ips.ac.ru
Исследованы биоцидные и токсические свойства гуанидинсодержащих гомо- и сополимеров диаллильной и акрилатной природы: поли(мет)акрилатгуанидинов, сополимеров (мет) акрилатгуанидинов и диаллилгуанидинацетата с диаллилдиметиламмоний хлоридом, а также модельных полимеров сравнения: полидиаллилдиметиламмоний хлорида и полигексаметиленгуанидин гидрохлорида. Показано, что сополимеры проявляют значительную биоцидную активность по отношению к E. coli и St. aureus, причем максимальные показатели демонстрируют сополимеры с диаллилгуанидинацетатом. Близкие показатели имеют сополимеры с (мет)акрилатгуанидинами, содержащие 30^70 мол. % акрилатного компонента. Показано, что гомополимеры и сополимеры на основе (мет)акрилатгуанидинов, содержащие менее 40 мол. % звеньев диаллилдиметиламмоний хлорида, являются нетоксичными, а при большем содержании диаллилдиметиламмоний хлорида (до 65 + 70 %) характеризуются невысокой токсичностью. Исключение составляют сополимеры с диаллилгуанидинацетатом, токсичность которых близка к токсичности полидиаллилдимети-ламмоний хлорида.
Ключевые слова: полиакрилатгуанидин, полиметакрилатгуанидины, сополимеры (мет)акрилатгуанидинов и ди-аллилгуанидинацетата с диаллилдиметиламмоний хлоридом, биоцидная активность, токсичность.
Biocide and toxic properties of guanidine containing homo and copolymers of diallyl and acrylate nature: poly(meth)acrylate guani-dines, copolymers of (meth)acrylate guanidines and diallylguanidine acetate with diallyldimethylammonium chloride, also model polymers for comparison: polydiallyldimethylammonium chloride and polyhexamethyleneguanidine hydrochloride were investigated in this work. It was shown that copolymers reveal high biocide activity in respect to E. coli and St. aureus and copolymers with diallylguanidine acetate demonstrate the maximum indices. Copolymers with (meth)acrylate guanidines containing 30^70 mol.% of acrylate component have similar indices. It was shown that homo and copolymers on the base of (meth)acrylate guanidines with less than 40 mol.% diallyldimethylammonium chloride links are non-toxic and these copolymers characterize low toxicity when these links are less than 65^70 mol.%. The exceptions are copolymers with diallylguanidine acetate — their toxicity is similar topolydiallyldimethylammonium chloride's one.
Keywords: polyacrylate guanidine, polymethacrylate guanidine, copolymers of (meth)acrylate guanidines and diallylguanidine acetate with diallyldimethylammonium chloride, biocide activity, toxicity.
Широкое распространение устойчивых штаммов ко многим бактерицидным веществам и возможность их эпидемического распространения является серьезной проблемой для построения эффективной антибактериальной терапии. В связи с этим необходимым становится поиск средств, обеспечивающих блокировку сразу нескольких факторов устойчивости патогенных микроорганизмов. Для решения этой задачи перспективным представляется использование синтетических полимеров, которые могут оказывать комбинированное воздействие на бактериальную клетку, а также являются более эффективными и менее опасными для человека по сравнению с низкомолекулярными биоцидными веществами, традиционно используемыми для защиты от микроорганизмов.
Перспективными химическими структурами для получения новых гуанидинсодержащих биоцидных полимеров являются четвертичные аммониевые соли диаллильного ряда и соли акриловых кислот. Во-первых, хорошо известно, что сами кислоты акрилового ряда, содержащие химически активные функциональные группы, представляют перспективный ряд мономеров, поскольку полученные на их основе полимеры и сополимеры могут сохранять потенциал активности, являясь удобными носителями, в том числе и биологически активных веществ. Во-вторых, присутствие в элементарном звене этих полимеров гуанидиновой группы должно придавать им высокую биоцидную активность. Особенно ценным качеством гуанидинсодержащих соединений является то, что в живом организме имеются ферментные системы, способные разлагать эти соединения, предотвращая их кумуляцию. Следует, однако, помнить, что для каждого нового гуанидинсодержащего соединения или ряда соединений, близких по строению, способность эффективной работы таких ферментативных систем требует дополнительной проверки.
Исходя из вышесказанного можно сделать вывод, что синтез новых гуанидинсодержащих полиэлектролитов (ПЭ) на основе мономеров акрилового ряда и производных диалкилдиаллиламмония с использованием метода радикальной полимеризации и разработка путей получения новых гуанидинсодержащих био-цидных ПЭ является весьма актуальной задачей.
Экспериментальная часть
Синтез исходных полимеров проводили по разработанным авторами методикам [1 - 4].
Методика оценки бактерицидной активности (со)полимеров. Для изучения бактерицидной активно-
сти синтезированных (со)полимеров в качестве тест-микробов использованы штаммы E.coli (кишечной палочки) и St.aureus (золотистого стафилококка) из международной коллекции эталонных штаммов, микробная нагрузка которых составляла 0,1 мл 1-й миллиардной суспензии на 1 мл препарата, использованного в определенных концентрациях (2-кратные разведения препарата в стерильном растворе дистиллированной воды). В контрольную пробирку препараты не добавляли, в них содержались тест-штаммы E.coli, St.aureus и 1 мл дистиллированной воды. Экспозиция препаратов с тест-микробами составляла 1 ч при комнатной температуре. Далее проводился высев из каждой опытной пробирки и из контрольной на питательный агар Эндо, разлитый в стерильные чашки Петри. Затем чашки с посевами инкубировали в термостате при 37 °С в течение 18 ч и определяли антибактериальную активность изучаемых образцов.
Методика оценки токсичности синтезированных (со)полимеров. Методика (методом in vitra) устанавливает порядок определения токсичности с использованием кратковременной суспензионной культуры клеток - спермы быка. Оценка токсичности производится при контроле готовой продукции шприцев однократного применения и инфузионных устройств однократного применения. Тест-система - сперма быка, гранулированная, замороженная в парах жидкого азота (замороженную сперму быка получают на станциях искусственного осеменения). Принцип метода основан на анализе зависимости показателя подвижности суспензии сперматозоидов m от времени: m = f(t) = dCnV, где d - постоянный коэффициэнт; Cn - концентрация подвижности клеток; V - средний модуль скорости клеток.
Оценка показателя подвижности осуществляется путем подсчета числа флуктуаций интенсивности рассеянного излучения, вызванного прохождением клеток через оптический зонд; 1т - индекс токсичности, определяемый по средним значениям времени подвижности
(^рХ 1ср.оп.: 1Ср.Кон.) •100%, где ^р.оп^ 1ср.кон. - среднее
время подвижности сперматозоидов в опытном и контрольном образцах; 1т > 0. Если 1т входит в нормативный интервал 60^120 %, то вытяжка признается нетоксичной.
Изучение фунгицидной активности полимеров. Для оценки фунгицидной активности полимеров против твердой головни на озимой пшенице растение опрыскивали в фазе 1-го развернутого листа водными растворами испытуемых образцов (концентрация 0,075 %). Контрольные растения не обрабатывали.
Инокуляцию проводили уредоспорами твердой головни через сутки после опрыскивания, учет пора-женности растений твердой головней - путем подсчета количества пустул на листьях.
Обсуждение полученных результатов
Синтез полиакрилатгуанидина (ПАГ), полиметак-рилатгуанидина (ПМАГ), их сополимеров с диаллилдиметиламмоний хлоридом (СП ДАДМАХ-АГ, СП ДАДМАХ-МАГ), а также сополимеров диаллилдиме-тиламмоний хлорида с диаллилгуанидинацетатом (СП ДАДМАХ-ДАГА) и определение структуры полученных соединений было выполнено авторами ранее [1 -7]. Отметим, что эти полимеры отвечают ряду требований, которые предъявляются к современным препаратам подобного рода: хорошая растворимость в воде и физиологическом растворе (1%-е растворы полимеров
Биоцидность и токсичность полимерных производ
имеют рН 6,5^7,0); растворы бесцветны, не имеют запаха, не вызывают разрушения обрабатываемых материалов, а также полимерная природа этих соединений способствует отсутствию ингаляционной токсичности и образованию на обработанных поверхностях длительно сохраняющейся полимерной пленки, обеспечивающей пролонгированный биоцидный эффект.
Исследования бактерицидной активности и токсичности синтезированных гомо- и сополимеров показали, что эти препараты весьма активны и обладают биоцидным действием по отношению к грамположи-тельным (8!ашеш) и грамотрицательным (Е.соИ) микроорганизмам, а также многие образцы обладают невысокой токсичностью (табл. 1). Методика определения бактерицидной активности и токсичности приведена в эксперименте.
Таблица 1
х АГ, МАГ и ДАГА и ряда модельных полимеров а
№ пп Соединение МьМ2 6 It, % E. coli в St. aureus в МПК, %103 г
1 ПАК - 87,1 --- --- -
2 ПАГ 0:100 67,6 --- -++ 8,5
3 СП с АГ 18:82 75,2 —+ +++ 1,9
4 СП с АГ 36:64 98,8 -++ +++ 2,0
5 СП с АГ 75:25 122,4 +++ +++ 2,3
6 ПМАК - 93,2 --- --- -
7 ПМАК(Г) - 76,1 --- -++ 9,8
8 ПМАГ 0:100 104,6 --- -++ 9,2
9 СП с МАГ 11:89 88,7 -++ -++ 2,2
10 СП с МАГ 28:72 101,5 -++ +++ 2,7
11 СП с МАГ 34:66 119,1 +++ +++ 1,4
12 СП с МАГ 43:57 131,3 -++ +++ 1,9
13 СП с МАГ 61:39 143,4 -++ +++ 3,2
14 ПДАДМАХ 100:0 29,7 —+ --- -
15 ПГМГ ГХ - 27,5 -++ -++ 8,7
16 СП с ДАГА 85:15 38,6 +++ +++ 0,4
17 СП с ДАГА 95:5 33,5 +++ +++ 1,5
Примечания. а - исследованы образцы сополимеров ДАДМАХ и АГ (оп. 3-5), сополимеров МАГ и ДАДМАХ (оп. 9-13), ПАК (оп. 1), ПАГ (оп. 2), ПМАК (оп. 6), ПМАК, модифицированной гуанидином (оп. 7), ПМАГ (оп. 8), ПДАДМАХ (оп. 14), ПГМГ ГХ (оп. 15), сополимеров ДАДМАХ и ДАГА (оп. 16, 17). Методики исследования биоцидных и токсических свойств приведены в эксперименте; It - индекс токсичности, %; б - соотношение сомономеров по данным ЯМР спектроскопии [7], М1 - ДАДМАХ, М2 - АГ, МАГ или ДАГА; в - Escherichia coli 1257 - кишечная палочка, представитель грамотрицательной бактерии и Staphylococcus aureus 906 - золотистый стафилококк, представитель грамположительной бактерии; (+ + +) - сплошной лизис бактериальной клетки, полностью задерживает рост данного штамма; (-+ + ) - частичный лизис клетки, наблюдаются зоны подавления роста через 48 ч; (—+) - частичный лизис клетки, наблюдаются зоны подавления роста через 72 ч; (---) - не активен; г - минимальная подавляющая концентрация в вес. % для St. aureus.
На основании полученных данных можно сделать следующие выводы. Полиакриловые кислоты (табл. 1, оп. 1 и 6), а также гомополимеры ПАГ и ПМАГ (табл. 1, оп. 2 и 8) обладают низкой токсичностью, причем полимерные производные акриловой кислоты - меньшей токсичностью. Это можно объяснить, вероятно, дополнительным гидрофобным взаимодействием с клеточной стенкой полимеров на основе МАГ. Для сополимеров наблюдается та же закономерность (табл. 1, оп. 3-5 и 9-13): менее токсичны сополимеры с АГ, при этом токсичность образцов тем выше, чем больше содержание в сополимерах звеньев ДАДМАХ (рисунок). Так как критерием нетоксичности по методике исследования является величина 1т в интервале от 60 до 120 (табл. 1, колонка 4), то для наглядности при сравнении из величины этого индекса вычли нижний предел, равный 60.
Это ожидаемый результат для полиамфилитных сополимеров, так как производные акриловых кислот имеют низкую токсичность, тогда как ПДАДМАХ -высокую (табл. 1, оп. 14) благодаря своей поликатио-ной природе. Достаточно высокую токсичность показали и образцы сополимеров ДАДМАХ и ДАГА, но она ниже, чем у ПДАДМАХ (табл. 1, оп. 16, 17 и 14). Высокой токсичностью обладает и другой поликатион, взятый для сравнения, - ПГМГ ГУ (табл. 1, оп. 15). Отсюда можно сделать вывод о том, что при выборе сополимера в качестве биоцидного препарата нужно учитывать состав сополимера.
Как видно из табл. 1, синтезированные гуанидин-содержащие препараты проявляют бактерицидную активность в отношении изученных клеточных культур, причем у сополимеров наблюдается наиболее выраженная биоцидная активность (наибольшую биоцидность проявляют сополимеры ДАДМАХ и
ДАГА, табл. 1, оп. 16 и 17). Как известно, это связано с тем, что ПЭ образуют в водной среде электрически заряженные группы, фиксированные вдоль достаточно протяженной полимерной цепи и способные к «многоточечным» (кооперативным) взаимодействиям с бактериальной клеткой, причем транспортную функцию в 1-ю очередь выполняют положительно заряженные звенья ДАДМАХ, а в случае сополимеров ДАДМАХ и ДАГА - и звенья ДАГА. Это подтверждается и тем, что поликислоты ПАК и ПМАК (табл. 1, оп. 1 и 6) не обладают биоцидными свойствами по отношению к исследованным культурам, сополимер МАК и МАГ, полученный модификацией ПМАК гуа-нидином, при низкой токсичности обладал слабыми биоцидными свойствами (табл. 1, оп. 7). Этим же объясняются гораздо более слабые биоцидные свойства гомополимеров (табл. 1, оп. 2 и 8).
Зависимость 1т от содержания ДАДМАХ в сополимерах с АГ (кривая 1) и МАГ (кривая 2)
В целом у ПАГ и ПМАГ отмечена более выраженная активность по отношению к грамположительным микроорганизмам, а грамотрицательные штаммы оказались более устойчивыми к этим соединениям (табл. 1, оп. 2 и 8).
Необходимо отметить также следующее. Когда мы обсуждаем биологическую активность синтезированных нами гуанидинсодержащих полимеров, то имеем в виду, что речь не идет о лекарственных препаратах. Речь идет о биоцидных препаратах, предназначенных для обработки различных поверхностей, и введении их в различные композиции для придания им биоцид-ности. И в этом случае при воздействии на бактерии эффект собственно биоцидности будет дополняться токсичным воздействием этих соединений. Поэтому в ряду синтезированных полимеров образцы с большей токсичностью обладают большей биоцидностью. В приведенном ниже ряду токсичность и биоцидность уменьшается слева направо (СП - сополимер):
СП ДАДМАХ-ДАГА > СП ДАДМАХ-МАГ > СП ДАДМАХ-АГ > П(М)АГ.
При этом мы прекрасно понимаем, что фактор токсичности важно учитывать в случае контакта с препаратами теплокровных животных.
Относительно механизма биоцидного действия ПЭ, в частности, исследованных в данной работе, можно высказать следующие соображения. Учитывая, что под собственной физилогической активностью полимеров обычно понимают активность, которая связана с полимерным состоянием и не свойственна низкомолекулярным аналогам или мономерам [8], механизмы проявления собственной физиологической активности могут включать в себя как важнейшую составляющую физические эффекты, связанные с большой массой, осмотическим давлением, конфор-мационными перестройками и другими, а также - с межмолекулярными взаимодействиями и с биополимерами организма, многие из которых являются полианионами (белки, нуклеиновые кислоты, ряд полисахаридов), а биомембраны также имеют суммарный отрицательный заряд. Взаимодействие между противоположно заряженными ПЭ протекают кооперативно, причем образующиеся в результате поликомплексы достаточно прочны. Известно, что наибольшее значение имеют при таких взаимодействиях плотность заряда и молекулярная масса [8 - 13].
По сравнению с другими катионными ПЭ использование гуанидинсодержащих биоцидных полимеров имеет еще одно положительное преимущество. Для синтетических биоцидных полимеров следует учитывать их биодеградируемость в живом организме. В этом отношении биоцидный эффект гуанидиновых соединений может оказаться физиологичным, так как в живом организме имеются ферментные системы, способные вызывать деградацию этих соединений, предотвращая их кумуляцию [14]. Однако, как уже отмечалось, для каждого нового гуанидинсодержащего соединения данный факт требует отдельной проверки.
Относительно возможного действия гуанидиново-го фрагмента, выполняющего в нашем случае основную биоцидную функцию, нами могут быть высказаны следующие соображения. Гуанидиновый остаток несет в себе аминокислота аргинин, и при протекании различных процессов в клетке гуанидиновые фрагменты наших полимеров могут заменять аргинин, вызывая различные нарушения. Аналогичное вмешательство может происходить в процессах, в которых участвует пуриновое азотистое основание гуанин, имеющее в своей структуре гуанидиновый фрагмент. Главная причина объединения цепей полинуклеоти-дов - образование водородных связей между нуклеиновыми основаниями (гуанин образует пару с цитози-ном, пиримидиновым основанием). Замещение гуанина на гуанидиновый фрагмент может вызвать нарушение в таких важных процессах, как передача генетической информации, синтез нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и ряде других.
Нами обнаружено также биоцидное действие новых гуанидинсодержащих сополимеров по отношению к патогенной грибковой микрофлоре человека, в частности Candida alb. Наиболее активны в этом отношении сополимеры ДАДМАХ:ДАГА (85:15,
табл. 1, оп. 16), (МПК 3,0х10-3 %) и ДАДМАХ:МАГ (61:39, табл.1, оп. 13), (МПК 1,0х10-3 %).
В фитопатологической лаборатории Кабардино-Балкарского представительства Всероссийского института защиты растений некоторые из синтезированных образцов были испытаны на фунгицидную активность против твердой головни на озимой пшенице (табл. 2). Методика проведения оценки фунгицидной активности приведена в эксперименте.
Проведенные исследования по оценке фунгицидной активности ряда гомо- и сополимеров показали, что обработка растений синтезированными препаратами (табл. 2, оп. 1 - 3) в концентрации 7,5*10-2 % снижает пораженность озимой пшеницы твердой головней на 40 ^ 80 %, т.е. более эффективно, чем известным препаратом - поликарбацином (табл. 2, оп. 4).
Таблица 2
Эффективность новых гуанидинсодержащих препаратов против твердой головни на озимой пшенице
№ пп Препарат Снижение пораженности, %
1 ПМАГ 40
2 ДАДМАХ-ДАГА 70
3 ДАДМАХ-МАГ 85
4 Поликарбацин 20
Таким образом, сочетание в полученных сополимерах высокой бактерицидной активности (за счет содержания гуанидиновых групп) с повышенной способностью связываться с бактериальными клетками благодаря звеньям ДАДМАХ позволило нам синтезировать новые эффективные гуанидинсодержащие биоцидные полимеры. Наличие же в сополимерной цепи акрилатных звеньев позволяет получать такие препараты с низкой токсичностью.
Литература
1. Синтез новых мономеров на основе диаллилгуани-дина и их способность к радикальной полимеризации / Ю.А.
Поступила в редакцию_
Малкандуев [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2002. № 3. С. 82 -85.
2. Synthesis and potential radical copolymerization of new monomers based on diallylguanidine / G.E. Zaikov [et al.] // J. Appl. Pol. Sci. 2004. Vol. 91. P. 439 - 444.
3. Радикальная гомо (со)-полимеризация акрилат- и метакрилгуанидинов в водных средах / А.М. Эсмурзиев [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2003. № 6. С. 74 - 75.
4. Синтез новых гуанидинсодержащих полимеров / С.Ю. Хаширова [и др.] // Новые полимерные композиционные материалы : материалы 2-й Всерос. науч.-практ. конф. Нальчик, 2005. С. 73 - 75.
5. Определение состава и строения гомополимеров и сополимеров на основе акрилат- и метакрилатгуанидинов методом ЯМР1Н-спектроскопии / Н.А. Сивов [и др.] // Там же. С. 239 - 244.
6. Определение строения гуанидинсодержащих мономеров и полимеров методом ИК-спектроскопии / Ю.А. Мал-кандуев [и др.] // Там же. С. 245 - 252.
7. Строение и состав акрилат- метакрилатгуанидинов, их гомо- и сополимеров с диаммонийхлоридом / Н.А. Сивов [и др.] // Нефтехимия. 2006. Т. 46, № 1. С. 44.
8. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М., 1986. 296 с.
9. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. СПб., 1993. 261 с.
10. Ikeda T., Yamaguchi H., Tazuke S. New polymeric bio-cides: synthesis and antibacterial activity of polycations with pendant biguanide groups // Antimicrob. Agents Chemother. 1984. Vol. 26. Р. 139.
11. Ikeda T., Tazuke S., Suzuke Y. Polycationic biocides with pendant biguanide groups: molecular weights dependence on antibacterial activity of the polymeric biocides // Macromol. Chem. 1984. Vol. 185. P. 869.
12. Ikeda T., Tazuke S. // Polymer. Prep. 1985. Vol. 26. P. 226.
13. Franklin T.J., Snow G.A. Biochemistry of Antimicrobial Action. London, 1981. 286 р.
14. Гембицкий П.А., Воинцева И.И. Полимерный био-цидный препарат полигексаметиленгуанидин. Запорожье, 1998. 42 с.
18 октября 2011 г.
