CC BY
31
УДК 577.1:612.017.1:616-097
Структура FAB-фрагментов антител к фуллерену C60: структурные детерминанты связывания фуллерена
Е. М. Осипов1, О. Д. Гендриксон1, Т. В. Тихонова1, А. В. Жердев1, О. Н. Солопова2, П. Г. Свешников2, Б. Б. Дзантиев1, В. О. Попов1*
1Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные
основы биотехнологии» РАН, Россия, 119071, Москва, Ленинский просп., 33
2Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Россия, 113149, Москва,
Симферопольский бул., 8
*E-mail: vpopov@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 11.10.2018
Принята к печати 12.02.2019
РЕФЕРАТ Структура Fab-фрагментов антител к фуллерену C60 (FabC60) решена методом рентгеноструктур-ного анализа. Виртуальный докинг C60 в антигенсвязывающем кармане FabC60 показал, что связывание C60 с FabC60 обеспечивается энтальпийными и энтропийными факторами: я-я-стэкинг-взаимодействиями с ароматическими остатками антигенсвязывающего кармана и снижением площади доступной растворителю гидрофобной поверхности C60. Фрагмент подвижной петли CDR H3, локализованный на поверхности FabC60, затрудняет доступ C60 в антигенсвязывающий центр, что может объяснять пониженную аффинность антител к С60. Структура FabC60 депонирована в Protein Data Bank с pdbid 6H3H.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антитела, молекулярное моделирование, рентгеноструктурный анализ, фуллерен. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток; ИФА - иммуноферментный анализ; СИТ - соевый ингибитор трипсина; ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин; ФБ - 50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7.4, содержащий 100 мМ NaCl; ФБТ - ФБ, содержащий 0.05% Тритона Х-100; CDR - гипервариабельные участки; FabC60 - Fab-фрагмент антител к фуллерену С60; Kd - константа диссоциации; r.m.s.d. - среднеквадратичное отклонение; SolC60 - фуллеренаминокапроновая кислота.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема иммунного распознавания - один из ключевых вопросов современной биохимии, важный как для понимания биологических процессов, так и для создания новых лекарственных препаратов и конструирования вакцин. За последние годы получено большое количество теоретических и экспериментальных данных, способствующих пониманию структурно-функциональных закономерностей иммунного взаимодействия [1-5]. Одним из эффективных средств изучения комплекса антитело-антиген является рентгеноструктурный анализ, успешно применяемый для изучения взаимодействия антител с различными высокомолекулярными антигенами (белками, полисахаридами и др.) и низкомолекулярными водорастворимыми гаптенами [6-9].
На сегодняшний день круг потенциальных мишеней иммунного распознавания существенно расширился, в том числе благодаря частицам со структурно вырожденной поверхностью. К таким частицам относятся техногенные наночастицы, объемы производства
и применения которых в различных областях науки и технологий интенсивно растут [10]. Возможность варьировать физико-химические параметры нано-частиц открывает широкие горизонты для синтеза наночастиц с заданными свойствами, которые могут использоваться в таких областях биомедицины, как направленная доставка лекарственных средств, диагностика заболеваний и имиджинг органов и тканей [11-13]. Использование этих нестандартных объектов в медицине и биотехнологии делает важным изучение особенностей иммунного ответа на техногенные наночастицы, попадающие в организм.
К антигенам, взаимодействие с которыми не укладывается в рамки стандартных закономерностей иммунной реакции, относятся фуллерены - наночасти-цы, состоящие исключительно из атомов углерода и обладающие уникальной геометрией и свойствами [14]. Ряд исследований показывает возможность получения специфических антител к фуллеренам и предоставляет данные о комплексах антитело-фуллерен [15-18].
Изучению структуры сайта иммунного связывания фуллерена со специфическими антителами посвящена лишь одна работа [15]. Методами рент-геноструктурного анализа и компьютерного моделирования показано, что специфический сайт связывания молекул фуллерена представляет собой сферическую полость размером 7 Á, образованную кластером гидрофобных аминокислот. Однако в смоделированной структуре комплекса фуллерена с Fab-фрагментом антитела [15] во взаимодействие с фуллереном вовлечены гидрофобные остатки за пределами CDR.
Задача настоящего исследования состояла в изучении структуры Fab-фрагмента антител против фуллерена С60 методом рентгеноструктурного анализа и в моделировании строения комплекса анти-тело-фуллерен. С этой целью использованы Fab-фрагменты полученных ранее моноклональных антител к фуллерену С60 (FabC60) [18].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Растворимое производное С60 - фуллеренаминока-проновая кислота (C(0(H)3(NH(CH2)5COONa)3 х 10 H2O, SolC60) с чистотой 98% - приобретено у «Интелфарм» (Россия). Меченные пероксидазой хрена козьи антитела против ^-цепей IgG мыши приобретены у Bethyl Laboratories Inc. (США), 3,3',5,5'-тетраметилбензи-дин (ТМБ) и Тритон X-100 - у Sigma-Aldrich (США). Остальные реагенты имели аналитическую степень чистоты. Для иммуноферментного анализа (ИФА) использованы микропланшеты Costar 9018 фирмы Corning (США).
Получение Fab-фрагментов моноклональных антител мыши
Использовали Fab-фрагменты (FabC(0) клона В1 моноклональных антител мыши (Ful B1, IgG2a lambda), полученных нами ранее [18]. Антитела B1 очищали из асцитной жидкости одностадийной аффинной хроматографией на G-сефарозе и диализовали в течение ночи против 200 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7.4, содержавшего 2 мМ EDTA и 10 мМ цистеин. Для получения Fab-фрагментов антител B1 кристаллический папаин (Sigma, США) растворяли в том же буфере, смешивали с антителами в пропорции 1 : 100 и инкубировали смесь в течение 4 ч при 37°C и легком покачивании. Реакцию останавливали добавлением йодоуксусной кислоты до конечной концентрации 10 мМ. Для удаления Fc-фрагментов реакционную смесь наносили на колонку с белок-А-сефарозой, проскок собирали и диализовали против натрий-фосфатного буфера. Концентрацию FabC(0 опреде-
ляли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент E280 ( 1 мг/мл) = 1.4. Чистоту образцов контролировали методом электрофореза по Лэммли в 12% полиакриламидном геле без добавления Р-меркаптоэтанола.
Характеристика Fab-фрагментов моноклональных антител мыши
Непрямой ИФА. Конъюгат С60-тиреоглобулин (5 мкг/мл) в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7.4, содержавшем 100 мМ NaCl (ФБ), добавляли в лунки микропланшета и инкубировали в течение 16 ч при 4oC. Микропланшет отмывали 4 раза ФБ, содержавшим 0.05% Тритона X-100 (ФБТ). Затем в лунки микропланшета добавляли серию разведений антитела B1 и его Fab-фрагмента и инкубировали в течение 1 ч при 37oC. После четырехкратной отмывки ФБТ в лунки добавляли меченные пероксидазой хрена козьи антитела против ^-цепей IgG мыши в разведении 1:10 000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Микропланшет отмывали 4 раза ФБТ и измеряли пероксидазную активность иммунных комплексов. Для этого в лунки вносили субстратную смесь, содержавшую 0.42 мМ ТМБ и 1.8 мМ Н2О2 в 0.1 М цитрат-ном буфере, pH 4.0, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя в лунки 1 М H2SO4. Оптическую плотность продукта окисления измеряли при 450 нм, используя микропланшетный фотометр Zenyth 3100 (Anthos Labtec Instruments, Австрия).
Конкурентный ИФА SolC60. Конъюгат C60 - соевый ингибитор трипсина (С60-СИТ) (1 мкг/мл) в ФБ добавляли в лунки микропланшета и инкубировали в течение 16 ч при 4oC. Микропланшет промывали 4 раза ФБТ и вносили в лунки растворы SolC60 (от 5 мкг/мл до 0.1 нг/мл) и FabC60 (5 мкг/мл), инкубировали в течение 90 мин при 37oC. После четырехкратной отмывки ФБТ в лунки микропланшета добавляли меченные пероксидазой хрена козьи антитела против ^-цепей IgG мыши в разведении 1:10 000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После отмывки микропланшета измеряли пероксидазную активность полученных комплексов как описано выше.
Зависимость оптической плотности от концентрации антигена аппроксимировали с помощью программы Origin 7.5 (OriginLab, США), используя четырех-параметрическую сигмоидную функцию:
У=А+
А А 0
l + (f)
Лл
где - максимальная величина оптической плотности, Л„ - минимальная величина оптической плотно-
сти, р - наклон калибровочной кривой, х0 - концентрация антигена, приводящая к 50% ингибированию связывания антителом.
Кристаллизация
Для кристаллизации использовали два препарата белка: раствор FabC60 (7 мг/мл) в 50 мМ буфере HEPES, pH 7.0, и раствор комплекса FabC60 с SolC60, полученный смешиванием 100 мкл раствора FabC60 (0.16 мМ или 7 мг/мл) с 20 мкл 1 мМ водного раствора
SolC«0.
Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии пара в варианте с висячей каплей при 298 К. В качестве противорастворов использовали наборы кристаллизационных растворов Index HR2-134 и Crystal Screen HR2-110/112 фирмы Hampton Research (США). Капли состояли из равных объемов (1 мкл) раствора белка и противорас-твора. Кристаллы FabC60, пригодные для рентгено-структурного анализа, получены с использованием противораствора, содержавшего 25% полиэтилен-гликоль 3350, 0.2 М (NH4)2SO4, 0.1 М бис-Трис, pH 6.5. Образование кристаллов наблюдалось на третий день, в течение недели кристаллы вырастали до размеров 200X200X50 мкм.
азоте. Набор дифракционных данных обрабатывали программой XDS [19]. Кристаллографические расчеты проводили с использованием комплекта программ CCP4 [20]. Структуру FabC60 решали методом молекулярного замещения программой BALBES [21]. В качестве модели для молекулярного замещения использовали структуру антител из Protein Data Bank (код pdbid 1MFB) [22]. Уточнение структуры проводили с использованием программы REFMAC5 [23]. Визуальную коррекцию модели проводили вручную с использованием COOT [24]. Иллюстрации подготавливали с использованием программного пакета PyMOL [25]. Структуру депонировали в Protein Data Bank (PDB, код pdbid 6H3H).
Докинг малых молекул
Докинг и подготовку структур рецептора и лиганда выполняли с использованием программы Autodock Vina [26]. Файл с координатами C60 скачивали из ChemSpider (www.chemspider.com). Рецептор определяли как трехмерную сеть со стороной, равной 22.5 Á, и с центром в точке (13.95; -9.51; 38.74). Каждое измерение сети содержало 60 точек.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сбор дифракционных данных и решение структуры
Набор дифракционных данных с кристалла FabC60 собирали на пучке К4.4е (станция «Белок» Курчатовского источника синхротронного излучения, Москва, Россия) на длине волны 0.98 А при 100 К в токе азота. Перед сбором данных кристаллы вымачивали в противорастворе, дополнительно содержавшем 20% глицерина, и замораживали в жидком
Характеристика Fab-фрагментов моноклональных антител мыши
FabC60, использованные в настоящей работе, получены расщеплением полноразмерных анти-С60-антител В1 папаином и очищены до гомогенного состояния, что подтверждено данными электрофореза в 12% по-лиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях (рис. 1А).
А
1
2
кДа
97 66
Б
В
45
30
20
0.1 1
Белок, мкг/мл
10
100
SolC, нг/мл
1000
Рис. 1. Характеристика FabC60. А - определение гомогенности FabC60 (1) с помощью электрофореза в 12% поли-акриламидном геле в невосстанавливающих условиях. Полоса 2 - маркеры молекулярных масс. Б - кривые титрования моноклонального антитела В1 (1) и FabC60 (2) в непрямом ИФА. В - конкурентный ИФА SolC60: иммобилизован конъюгат С60-СИТ, в растворе - FabC60 (1); иммобилизован конъюгат С60-СИТ, в растворе - Fab-фрагмент моноклональных антител к Х-вирусу картофеля (2); иммобилизован конъюгат атразин-СИТ, в растворе - FabC60 (3)
Л
Рис. 2. А - структура FabC60. Н-цепь и ее CDR окрашены серым и фиолетовым, L-цепь и ее CDR окрашены оранжевым и зеленым цветом соответственно. Б - поверхность антигенсвязывающего кармана в FabC60. Поверхность Н- и L-цепей показана черным и серым цветом, поверхность CDR Н- и L-цепей - оттенками фиолетового и зеленого цветов соответственно
Иммунохимическая реакционная способность FabC60 изучена методом непрямого ИФА (рис. 1Б). По данным ИФА реакционная способность полученных FabC60 примерно в 80 раз ниже по сравнению с полноразмерными антителами.
Антигенсвязывающую способность FabC60 изучали с помощью конкурентного ИФА. В данном формате анализа конъюгат С —белок, иммобилизованный
60 7
на твердой фазе, и водорастворимое производное фуллерена, SolC60, конкурентно взаимодействовали с Fab-фрагментами антител. Специфичность взаимодействия подтверждали в экспериментах, где в качестве контроля использовали Fab-фрагменты моно-клональных антител к другому антигену (Х-вирусу картофеля), а также иммобилизованный на твердой фазе конъюгат белка с другим гаптеном (пестицидом атразином) (рис. 1В). Как видно из полученных данных, FabC60 не взаимодействует с адсорбированным конъюгатом атразин-СИТ (кривая 3 на рис. 1В). Кроме того, иммобилизованный конъюгат С60-СИТ не связывается с неспецифическими антителами (кривая 2 на рис. 1В). Кривая 1 на рис. 1В свидетельствует о наличии эффекта конкуренции между свободным SolC60 и иммобилизованным конъюгатом С60-СИТ за антигенсвязывающие участки FabC60. Таким образом, полученные результаты подтверждают специфическую природу иммунного взаимодействия Fab-фрагментов антител В1 и производного фуллерена С60.
Структура FabC60
Кристаллизация комплекса FabC60 с SolC60 привела к образованию кристаллов свободной формы FabC60. Структуры FabC60, полученные без SolC60 и в ее присутствии, были одинаковыми, и в дальнейшем мы рассматриваем только структуру, полученную при кристаллизации свободной формы FabC60.
Структура FabC60 была решена методом рент-геноструктурного анализа с разрешением 1.9 А. Статистика собранных дифракционных данных
представлена в таблице. В независимой части элементарной ячейки располагаются две молекулы FabC60, которые совмещаются по координатам 2717 эквивалентных атомов со среднеквадратичным отклонением 1.0 А. Эти же молекулы совмещаются по координатам атомов вариабельного домена со среднеквадратичным отклонением 0.4 А Две молекулы независимой части элементарной ячейки отличаются конформацией С-концов и межмолекулярными контактами (см. ниже).
FabC60 имеет характерную для Fab-фрагментов двухдоменную структуру, состоящую из тяжелой (Н) и легкой ^-цепей, и линейные размеры 45 х 50 х 100 А (рис. 2Л). Вариабельный домен тяжелой цепи включает остатки 1-119, а вариабельный домен легкой цепи ^^ - остатки 1-108. Константный домен тяжелой цепи (СН) включает остатки 123-222, константный домен легкой цепи (С^ - остатки 115-215. В электронной плотности уточнены все аминокислотные остатки легких цепей. Остатки 135-139, расположенные в петле между доменами VH и СН, разупо-рядочены и не локализованы на картах электронной плотности.
Гипервариабельные участки (CDR) определены следующим образом: L1 (Arg23-Asn36), L2 ^1у51-А1а57), L3 (А1а91^а199), H1 (Gly26-His35), H2 (Tyr50-Glu59) и Ш (Gly99-Trp109) [27, 28] (рис. 2Б). Аминокислотные остатки этих участков формируют антигенсвязывающий карман с размерами 9х7 А и глубиной 5 А (диаметр сферы С60 = 7 А). Из-за наличия у фуллерена сопряженной системы я-я-связей мы ожидали, что CDR будет содержать остатки, склонные к я-я-стэкинг-взаимодействиям. Действительно, поверхность антигенсвязывающе-го кармана частично образована расположенными в CDR гидрофобными ароматическими остатками Туг50 (Н2), Туг101 (Н3), Туг34 (L1), Тгр93 (L3) и Тгр98 (L3). Боковая группа Туг101 из петли Asp100-Туг101 в CDR Н3 плохо видна на картах электронной плотности; В-факторы у атомов боковой группы
Статистика сбора данных и уточнения структуры
Обработка данных
Пространственная группа симметрии Р2,
Параметры элементарной ячейки а; Ь; с, А; в, град 40.18; 137.58; 83.15 в = 91.9°
Разрешение 28.83-1.91 (2.02-1.91)
I / а 17.5 (3.2)
Полнота набора, % 99.5 (97.3)
Общее число отражений 349716 (52972)
Уникальные отражения 69665 (10963)
Избыточность набора 5.0 (4.8)
И %* 8.4 (2.3)
СС1/2 99.9 (83.0)
В-фактор Вильсона 29.7
Уточнение структуры
ИСГу8^ % 19.3 (27.9)
Ий-ее, % 23.5 (34.3)
Отклонение величин от идеальных значений:
Длина связей, А 0.02
Углы между связями, град 1.9
Двугранные углы, град 7.2
Число атомов
Белок 6535
Вода 456
Величина среднего температурного фактора, А2
Белок 30.1
Вода 32.5
Статистика графика Рамачандрана
Разрешенная область, % 97.4
Запрещенная область, % 0.2
*Для1Т
1 г т____
шим разрешением.
Туг101 (54 А2) выше, чем у атомов Туг101 основной цепи (28 А2). Это различие в величине В-факторов свидетельствует о подвижности боковой группы Туг101 и может быть связано с локализацией Туг101 на поверхности белка. Подвижный Туг101 может выполнять функцию «крышки» кармана, затрудняя вход С60 в антигенсвязывающий карман и снижая тем самым аффинность взаимодействия антитело-антиген (рис. 2Б).
На поверхности антигенсвязывающего сайта обнаружены остатки №г33 и His35 из CDR Н1, способные образовывать водородные связи, которые могут быть вовлечены в связывание фуллерена [15]. Однако в полученной нами структуре свободной формы FabC60 остатки №г33 и His35 двух молекул FabC60 независимой части элементарной ячейки образуют водородные связи с С-концевыми остатками Н- и L-цепей симметрично упакованных молекул FabC60 (рис. 3А,Б). В первой молекуле FabC60 анти-генсвязывающий карман занят С-концевым пептидом Ala219-Ser222 Н-цепи симметричной молекулы. Карбоксильная группа Ser222 симметрично-связанной молекулы FabC60 образует две водородные связи с №г33 и His35. Во второй молекуле FabC60 антиген-связывающий карман занят С-концевым пептидом Asp213-Ser215 L-цепи другой симметрично-связанной молекулы FabC60. В этом случае водородные связи С-концевого остатка Ser215 с остатками №г33 и His35 опосредованы молекулами воды. Вероятнее всего, связывание в антигенсвязывающем сайте FabC60 одного из С-концов другой молекулы не имеет отношения к биологической роли и является арте-
Рис. 3 .А - упаковка РаЬС60 в кристалле с пространственной группой Р2Г С-Конец тяжелой цепи РаЬС60 (зеленый) занимает антигенсвязывающий сайт соседней FabC60. Б - увеличенная область контакта (ориентация и окрашивание отличаются от рис. 3А). Связывание С-концевого Ser222' тяжелой цепи соседней молекулы в антигенсвязы-вающем кармане FabC60. Тяжелая и легкая цепи гипервариабельных участков окрашены фиолетовым и зеленым цветом соответственно. Водородные связи С-концевой карбоксильной группы Ser222' (атомы углерода черного цвета) показаны пунктиром черного цвета
Л
Антигенсвязывающий карман
Рис. 4. A - структуры FabC60 (показана голубым) и анти-С60 Fab (показана оранжевым цветом) [15], совмещенные по VH-доменам. Антигенсвязывающий карман выделен рамкой. Б - увеличенные области связывания C60 в FabC60 (голубой) и анти-С60 Fab (оранжевый), совмещенные по VH-доменам. Гипервариабельные участки тяжелых и легких цепей FabC60 окрашены фиолетовым и зеленым
фактом кристаллической упаковки. Однако мы предполагаем, что подобная кристаллическая упаковка, стабилизированная дополнительными водородными связями, препятствует связыванию антигена и является одной из причин, не позволивших нам закристаллизовать комплекс FabC„ и SolC„.
60 60
Степень гомологии первичной структуры FabC60 и ранее описанных антител к фуллерену (анти-С60 Fab, pdbid 1emt) [15] довольно высока и составляет 76 и 40% по H- и L-цепям соответственно. FabC60 содержит легкую ^-цепь, в то время как анти-С60 Fab - легкую к-цепь. Структуры этих антител отличаются взаимным расположением V- и С-доменов, поэтому сравнительный анализ этих двух структур затруднен. При совмещении структур по координатам VH домена r.m.s.d. составляет 0.4 А (рис. 4A). Антигенсвязывающие карманы этих антител отличаются по составу и строению, максимальные отличия наблюдаются в укладке L-цепи и петли CDR H3 (рис. 4Б). Петля H3 анти-С60 Fab [15] на семь остатков короче петли Н3 FabC60 (11 остатков).
Докинг C60 в FabC60 и анализ связывания C60
с FabC60
Поскольку нам не удалось получить структуру комплекса С60 с FabC60, мы выполнили докинг C60 в антигенсвязывающем кармане FabC60, чтобы определить структурные особенности связывания фуллерена с антителами [26]. Известно, что связывание антигена сопровождается конформационными изменениями в гипервариабельных участках [29, 30].
Максимальные структурные перестройки наблюдаются в петле CDR H3, которая имеет наибольшую подвижность и наиболее трудна для моделирования среди всех петель антигенсвязывающего региона [31]. Для понимания возможного влияния петли CDR H3 на связывание антигена мы сравнили две модели комплекса С60 с нативной формой FabC60 (Комплекс I) и модифицированной формой FabC60 с удаленными остатками Asp100 и Tyr101 из CDR H3 (Комплекс II) (рис. 5).
В комплексе I молекула C60 связывается на поверхности антигенсвязывающего сайта и образует я-я-стэкинг с остатками: Tyr50 (CDR H2), Tyr101 (CDR H3) и Trp93 (CDR L3). При связывании фуллерена площадь его доступной растворителю поверхности снижается на 40%. Энергия связывания, рассчитанная с использованием программы Autodock Vina, составила -7 ккалхмоль-1, что соответствует константе диссоциации (Kd) комплекса, равной 7.4 х 10-6 М. Экспериментально определенная Kd комплекса С60 и полноразмерных антител B1 к фуллерену составила 1.1 х 10-7 М [18]. С учетом 80-кратного снижения аффинности взаимодействия С60 с FabC60, Kd комплекса С60 и FabC60 оценивается величиной 9 х 10-6 М, что хорошо коррелирует с величиной, рассчитанной для модели комплекса С60 с нативной формой FabC60, полученной докингом.
Удаление остатков Asp100 и Tyr101 приводит к тому, что в комплексе II молекула С60 глубже входит в антигенсвязывающую полость и связывается на расстоянии около 4 А от положения C в комплек-
Б
Рис. 5. Смоделированное с использованием программы Autodock Vina связывание C60 (показан стержневой моделью) в немодифицированном (оранжевый каркас C60) и модифицированном (голубой каркас C60) анти-генсвязывающем кармане FabC60. Остатки Asp100-Tyr101, удаленные в модифицированной структуре, показаны стержневой моделью синего цвета. Поверхность H- и L-цепей модифицированного антигенсвя-зывающего кармана, использованная для генерации рецептора в Autogrid, окрашена фиолетовым и зеленым соответственно
се I (рис. 5). Энергия связывания, рассчитанная с использованием программы Autodock Vina, растет с -7 до -12 ккалхмоль-1, что соответствует снижению величины Kd комплекса с 7.4 х 10-6 до 1.6 х 10-9 М. Рост аффинности в отсутствие Asp100 и Tyr101 объясняется образованием дополнительных (помимо ранее упомянутых) я-я-взаимодействий с His35 H-цепи и Tyr34 L-цепи, а также снижением площади доступной растворителю гидрофобной поверхности C60 с 60 до 40% от исходной. Таким образом, остатки Asp100 и Tyr101 из CDR H3 могут играть ключевую роль в снижении аффинности взаимодействия фуллерена C60 с соответствующими антителами.
В уже упомянутой работе [15] также не удалось получить кристаллическую структуру комплекса Fab-фрагментов (pdbid 1emt) с C60, и структура комплекса была смоделирована с использованием программы INSIGHT 2 по методике, отличной от ис-
пользованной в нашей работе: молекулу С60 вручную помещали в полость вариабельного домена между Н- и L-цепями, после чего энергия системы минимизировалась [15]. В связывание С60 в полученной модели вовлечены остатки Туг36, Gln89, Phe96 и Phe98 L-цепи и Asn35, Тгр47 и Тгр106 Н-цепи, связывание сопровождалось уменьшением на 90% площади доступной растворителю гидрофобной поверхности фуллерена [15].
Единственными экспериментально установленными структурами, по которым возможно проверить правильность выводов о движущих силах образования комплекса антитело-фуллерен, являются структуры комплекса С60 с синтетическим белком (pdЬid 5hkn, 5hkr, 5е13) [32]. Фуллерен С60 в этих комплексах связан в гидрофобном кармане. При связывании доступная растворителю гидрофобная поверхность С60 уменьшается на ~90% и образуется я-я-стэкинг-взаимодействие с остатком туг9. Проведенный нами дополнительный анализ структур позволил обнаружить не упомянутое в работе [32] еще одно я-я-взаимодействие С60 с пептидной связью Leu19-Ala20.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, результаты, полученные при моделировании строения комплексов С60 с FabC60, согласуются с экспериментальными данными [32]. Основной вклад в энергию связывания фуллерена с белками вносят гидрофобные и я-я-стэкинг-взаимодействия. Подвижный фрагмент петли в гипервариабельном участке Н3 затрудняет доступ С60 к антигенсвязы-вающему сайту, что объясняет низкую аффинность изучаемых антител (^ около 10-7 М).
Остатки Т^33 и His35 в антигенсвязывающем кармане, которые в растворе могут быть вовлечены в связывание фуллерена, в условиях кристаллизации образуют водородные связи с С-концевыми остатками симметрично расположенной молекулы FabC60, стабилизируя кристаллическую упаковку свободной формы FabC60 и препятствуя кристаллизации комплекса С_п с FaЬC0„.
60 60
Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН № 32 «Наноструктуры: физика, химия, биология, основы технологий».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sundberg E.J., Mariuzza R.A. // Adv. Protein Chem. 2002. V. 61. P. 119-160.
2. Sundberg E.J. // Methods Mol. Biol. 2009. V. 524. Р. 23-36.
3. Calvaresi M., Zerbetto F., Ciamician C.G., Bologna U., Selmi V.F. // ACS Nano. 2010. V. 4. № 4. P. 2283-2299.
4. Dunbar J., Krawczyk K., Leem J., Baker T., Fuchs A., Georges G., Shi J., Deane C.M. // Nucl. Acids Res. 2014. V. 42. № D1.
P. D1140-D1146.
5. Abbott W.M., Damschroder M.M., Lowe D.C. // Immunology. 2014. V. 142. № 4. P. 526-535.
6. Wilson I.A., Rini J.M., Fremont D.H., Fieser G.G., Stura E.A. // Methods Enzymol. 1991. V. 203. P. 153-176.
7. Clementi N., Mancini N., Castelli M., Clementi M., Burioni R. // Drug Discov. Today. 2013. V. 18. № 9-10. P. 464-471.
8. Narciso J.E.T., Uy I.D.C., Cabang A.B., Chavez J.F.C., Pablo J.L.B., Padilla-Concepcion G.P., Padlan E.A. // Nat. Biotechnol. 2011. V. 28. № 5. P. 435-447.
9. Malito E., Carfi A., Bottomley M. // Int. J. Mol. Sci. 2015. V. 16. № 12. P. 13106-13140.
10. Jeevanandam J., Barhoum A., Chan Y.S., Dufresne A., Danquah M.K. // Beilstein J. Nanotechnol. 2018. V. 9. № 1. P. 1050-1074.
11. Boraschi D., Italiani P. // Vaccines. 2015. V. 3. № 4. P. 930-939.
12. Sun T., Zhang Y.S., Pang B., Hyun D.C., Yang M., Xia Y. // Angew. Chemie Int. Ed. 2014. V. 53. № 46. P. 12320-12364.
13. Stylianopoulos T., Jain R.K. // Nanomedicine Nanotechnology. Biol. Med. 2015. V. 11. № 8. P. 1893-1907.
14. Castro E., Garcia A.H., Zavala G., Echegoyen L. // J. Mater. Chem. B. 2017. V. 5. № 32. P. 6523-6535.
15. Braden B.C., Goldbaum F.A., Chen B.X., Kirschner A.N., Wilson S.R., Erlanger B.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 22. P. 12193-12197.
16. Chen B.-X., Wilson S.R., Das M., Coughlin D.J., Erlanger B.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 18. P. 10809-10813.
17. Hendrickson O.D., Fedyunina N.S., Martianov A.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // J. Nanoparticle Res. 2011. V. 13. № 9.
P. 3713-3719.
18. Hendrickson O., Fedyunina N., Zherdev A., Solopova O., Sveshnikov P., Dzantiev B. // Analyst. 2012. V. 137. № 1. P. 98-105.
19. Kabsch W. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2010. V. 66. № 2. P. 125-132.
20. Winn M.D., Ballard C.C., Cowtan K.D., Dodson E.J., Emsley P., Evans P.R., Keegan R.M., Krissinel E.B., Leslie A.G.W.,
McCoy A., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2011. V. 67. № Pt 4. P. 235-242.
21. Long F., Vagin A.A., Young P., Murshudov G.N. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2008. V. 64. № Pt 1. P. 125-132.
22. Cygler M., Wu S., Zdanov A., Bundle D.R., Rose D.R. // Biochem. Soc. Trans. 1993. V. 21. № 2. P. 437-441.
23. Murshudov G.N., Vagin A.A., Dodson E.J. // Acta Crystallogr. Sect. D. 1997. V. 53. № 3. P. 240-255.
24. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2010. V. 66. № 4. P. 486-501.
25. The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0 Schrodinger, LLC.
26. Trott O., Olson A.J. // J. Comput. Chem. 2009. V. 31. № 2. P. 455-461.
27. Kabat E.A., Te Wu T., Foeller C., Perry H.M., Gottesman K.S. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Diane Publ. Comp. Bethesda, MD, USA, 1992.
28. Martin A.C. // Proteins. 1996. V. 25. № 1. P. 130-133.
29. Stanfield R.L., Wilson I.A. // Trends Biotechnol. 1994. V. 12. № 7. P. 275-279.
30. Weitzner B.D., Dunbrack R.L., Gray J.J., Gray J.J. // Structure. 2015. V. 23. № 2. P. 302-311.
31. Regep C., Georges G., Shi J., Popovic B., Deane C.M. // Proteins. 2017. V. 85. № 7. P. 1311-1318.
32. Kim K.H., Ko D.K., Kim Y.T., Kim N.H., Paul J., Zhang S.Q., Murray C.B., Acharya R., Degrado W.F., Kim Y.H., et al. // Nat. Commun. 2016. V. 7. A. 11429.
