CC BY
32
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.46-576.8
СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ОСНОВНЫХ ТИПОВ РАСТЕНИЙ ВЕРХОВОГО БОЛОТА*
Т.Г. Добровольская, А.В. Головченко, Е.Н. Юрченко, Н.В. Костина
Прямым методом и методом посева обнаружены высокие концентрации бактерий на растениях Carex nigra, Eriophorum vaginatum, Drosera rotundifolia и Ledum palustre. Установлена корреляция между численностью бактерий, видами и органами исследуемых растений. Выявлено доминирование протеобактерий в филлосфере, бацилл и актино-мицетов — в ризоплане и ризосферной почве. В филлосфере преобладали представители родов Pseudomonas и Erwinia. Установлены высокие показатели азотфиксирующей активности бактериальных популяций в ризосферной почве, достигающие максимума под росянкой.
Ключевые слова: верховое болото, растения, бактерии, численность, таксономический состав, нитрогеназная активность.
Введение
Микробным сообществам сфагнового мха и верхового торфа посвящено большое число как российских, так и зарубежных работ [1, 3, 11, 17, 20]. Однако практически не изучен микробный состав травянистых растений и кустарничков, произрастающих на верховых болотах. Такие исследования необходимы, так как функции этих растений весьма значимы для поддержания и работы болотных экосистем. Установлено, что травянистые растения и вересковые кустарнички вносят существенный вклад в формирование и поддержание микрорельефа, в частности, в образование кочек, где создаются стабильные температура и влажность, благоприятные для развития сфагнума [18]. Кроме того, присутствие Сагех rostrata и Scheuchzeria palustris в болотных сообществах усиливает выброс метана в атмосферу. В дневное время суток через эти растения транспортируются 52—60% объема метана, эмитированного с поверхности болота [9]. Таксономическая структура эпифитных бактериальных сообществ изучена лишь на росянке. Мо-лекулярно-биологическими методами выявлены 63 морфотипа бактерий. Среди них обнаружены 34 nifH-гена, свидетельствующих об азотфикси-рующей активности у представителей многих родов, выделенных из филлосферы и ризосферы росянки [14].
Цель работы — определение численности, изучение таксономического состава и азотфиксиру-ющей активности эпифитных и сапротрофных бактериальных сообществ осоки, пушицы, росянки и багульника.
Объекты и методы исследования
В сосняке кустарничково-пушицево-сфагно-вом (Тверская обл., Западно-Двинский лесоболот-ный стационар Института лесоведения РАН) в конце мая 2016 г. отобраны образцы представителей травянистых растений — осоки черной (Carex nigra), пушицы влагалищной (Eriophorum vaginatum), росянки круглолистной (Drosera rotundifolia), представителя вересковых кустарничков — багульника болотного (Ledum palustre). Анализировали их листья, стебли и ветви (филлосфера), поверхность корней (ризоплана) и ризосферную почву под растениями.
Численность бактерий определяли прямым методом с использованием люминесцентной микроскопии [8]. Предварительно в течение 2 мин. де-сорбировали бактериальные клетки на ультразвуковом диспергаторе «Bandelin Sonopuls HD 2070» (Германия) при мощности 50%. Приготовленные по стандартной методике препараты, окрашенные водным раствором акридина оранжевого, просматривали (120 полей зрения на один образец) на люминесцентном микроскопе «ЛЮМАМ-ИЗ» (Россия). Численность клеток бактерий в 1 г образца (^Б) определяли по формуле: Nß = Sy an/v • S2 'С, где: S1 — площадь препарата (мкм2); а — среднее число бактерий в поле зрения; n — показатель разведения суспензии (мл); v — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 — площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с — навеска образца (г).
Численность и таксономический состав бактерий сапротрофного блока определяли методом
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 16-04-00452).
посева на агаризованную глюкозо-пептонно-дрож-жевую среду. Для ингибирования грибов добавляли 50 мг нистатина на 0,5 л среды. Для посева использовали суспензию, оставшуюся после приготовления препаратов для люминесцентной микроскопии. Посев проводили в 5-кратной повторности из экспериментально подбираемых 10-кратных разведений. Инкубировали при комнатной температуре в течение двух—трех недель. Общую численность бактерий выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 г образца. Проводили дифференцированный учет колоний бактерий разных таксономических групп. Основных представителей бактерий выделяли в чистую культуру. Выделенные штаммы идентифицировали до рода на основании морфологических, культуральных и хемотак-сономических признаков [7, 10], доминирующие таксоны — по результатам секвенирования нуклео-тидных последовательностей гена 16S рДНК с использованием программы BLAST [16].
Для определения актуальной азотфиксации ризосферную почву (2—3 г) помещали в пеницил-линовые флаконы объемом 15 мл, герметично закрывали резиновыми пробками с металлическими зажимами, вводили 1 мл ацетилена и инкубировали 2 ч при 25°. Затем из флаконов шприцем отбирали 1 мл пробы и измеряли количество образовавшегося этилена на хроматографе «Кристалл-2000» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором (длина колонки — 1 м, диаметр — 3 мм, наполнитель — Porapak N 80/100); температура колонки — 60°, детектора — 160°, испарителя — 100°; расход газа-носителя (N2) — 50 мл/мин, воздуха — 280 мл/мин, водорода — 28 мл/мин [8]. Повторность 3—5-кратная. Активность азотфиксации выражали в нг С2Н4Д • ч.
Для определения потенциальной азотфиксации к навеске предварительно добавляли 1 мл раствора глюкозы (из расчета 1% от массы почвы). Дальнейшее — как описано выше.
Результаты и их обсуждение
Численность бактерий, установленная прямым подсчетом, варьировала от 0,6 до 2,4 млрд кл/г — в филлосфере, от 1,2 до 4,2 млрд кл/г — в ризо-плане растений и от 0,9 до 7,8 млрд кл/г — в ри-зосферной почве. Если сравнивать микролокусы, связанные с растениями между собой, то обнаруживается тенденция увеличения численности бактерий в ризосферной почве. Максимальные ее значения во всех микролокусах выявлены для багульника, минимальные — для росянки (табл. 1).
Анализ численности эпифитно-сапротрофно-го комплекса бактерий растений позволил установить максимальные значения плотности бактерий в филлосфере — 106—108 КОЕ/г. В ризоплане растений и ризосферной почве число бактерий на 1—3 порядка меньше. В порядке убывания плотности бактериальных популяций в филлосфере растения следует расположить в следующий ряд: пушица—осока—росянка—багульник (табл. 1). В отличие от травянистых растений у багульника во всех микролокусах численность бактерий примерно одинакова и составила (7—10) • 105 КОЕ/г. Таким образом, в филлосфере травянистых растений численность бактерий эпифитно-сапротрофного комплекса значительно выше, чем на вересковом кустарничке — багульнике. Низкая плотность их на листьях багульника связана, по-видимому, с высоким содержанием эфирных масел, ингибирующих рост микроорганизмов.
Таблица 1
Численность бактерий в микролокусах растений верховых болот
Растение Микролокус Численность бактерий
прямой метод, кл/г метод посева, КОЕ/г
Осока черная филлосфера 2,4 • 109 1,1 • 107
ризоплана 4,2 • 109 1,0 • 105
ризосферная почва 4,4 • 109 1,6 • 105
Пушица влагалищная филлосфера 2,3 • 109 4,3 • 108
ризоплана 2,2 • 109 18,6 • 105
ризосферная почва 4,4 • 109 1,0 • 105
Росянка круглолистная филлосфера 0,6 • 109 1,4 • 106
ризоплана 0,9 •Ю9 2,1 • 105
ризосферная почва 1,2 •Ю9 1,1 • 105
Багульник болотный филлосфера (1,4—2,1) • 109 9,2 • 105
ризоплана 4,2 • 109 10,3 • 105
ризосферная почва (7,5—7,8) • 109 7,1 • 105
Таблица 2
Таксономическая структура бактериальных сообществ в микролокусах растений верховых болот
Растение Микролокус Относительное обилие группы, %
протеобактерии бациллы актиномицеты
филлосфера 100 0 0
Осока черная ризоплана 0 53 47
ризосферная почва 10 89 1
филлосфера 100 0 0
Пушица влагалищная ризоплана 100 0 0
ризосферная почва 27 45 28
филлосфера 100 0 0
Росянка круглолистная ризоплана 88 12 0
ризосферная почва 54 46 0
филлосфера 25 75 0
Багульник болотный ризоплана 12 69 19
ризосферная почва 10 89 1
В составе бактериальных комплексов фил-лосферы и ризопланы травянистых растений доминировали грамотрицательные бактерии. Лишь на поверхности корней осоки в качестве доми-нантов выявлены бациллы и актиномицеты. На багульнике обнаружили иную структуру бактериальных комплексов — доминирование бацилл во всех микролокусах (табл.2). В сфагнуме преобладали протеобактерии, бациллы выступали в качестве субдоминантов, доля актиномицетов не превышала 10% [1].
Анализ доминирующих культур протеобакте-рий, выделенных из филлосферы осоки, пушицы и росянки, проведенный на основании метода 16S рДНК, позволил установить, что на всех травянистых растениях протеобактерии представлены как аэробными бактериями р. Pseudomonas, так и факультативно-анаэробными р. Erwinia. Представители этих родов типичны для филлосферы как сельскохозяйственных, так и сорных растений [4, 15, 19].
Таблица 3
Азотфиксирующая активность (АФ) ризосферной почвы под исследуемыми растениями
Растение АФ АФ с глюкозой
нг С2Н4Д субстрата • ч
Осока черная 0,098 0,235
Пушица влагалищная 0,286 0,302
Росянка круглолистная 0,318 0,297
Багульник болотный 0,227 0,423
Актуальная азотфиксирующая активность бактериальных сообществ в ризосферной почве травянистых растений изменялась в диапазоне 0,098—0,318 нг С2Н4/Г субстрата • ч, увеличиваясь в ряду: осока—багульник—пушица—росянка (табл. 3). В целом полученные значения актуальной азот-фиксации в 1,5—3 раза ниже, чем таковые, установленные для активности молибденозависимой нитрогеназы в основных типах почв европейской части России [13]. Однако известно, что азотфик-сация в почвах обладает большой пространственной изменчивостью в естественных условиях [6,12].
В вариантах с добавлением глюкозы активность азотфиксации в ризосферной почве под всеми растениями достоверно повышалась. Лишь под росянкой наблюдали незначительное снижение показателей потенциальной азотфиксации.
Заключение
Люминесцентно-микроскопическим методом установлена высокая численность бактерий на болотных растениях, достигающая миллиардов клеток на грамм субстрата. Максимальные значения выявлены в ризосферной почве. Численность бактерий эпифитно-сапротрофного комплекса выше в филлосфере. Анализ таксономической структуры бактериальных сообществ болотных растений позволил обнаружить преобладание протеобакте-рий в филлосфере, среди которых доминировали представители родов Pseudomonas и Enterobacter — типичных представителей эккрисотрофов, питающихся экзометаболитами растений. Доминирование бацилл, а на некоторых растениях (осо-
ка и пушица) и актиномицетов, в ризоплане и ризосферной почве свидетельствует о наличии в этих микронишах бактерий-гидролитиков, необходимых для переработки различных полимеров, скапливающихся на отмирающих частях растений. Такой тип распределения эколого-трофиче-ских групп бактерий по надземным и подземным ярусам характерен для всех видов наземных рас-
тений [2, 5]. Измерение азотфиксирующей активности в ризосферной почве под болотными растениями позволило установить достаточно высокие показатели, которые увеличивались при добавлении глюкозы. Таким образом, благодаря бакте-риям-азотфиксаторам происходит обогащение торфяных почв азотом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Головченко А.В., Панкратов Т.А., Добровольская Т.Г., Кухаренко О.С. Торфяные почвы как банк бактериального разнообразия // Роль почв в биосфере: Тр. Ин-та экол. почвовед. МГУ им. М.В.Ломоносова. Вып. 10. М., 2010.
2. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М., 2002.
3. Добровольская Т.Г., Головченко А.В., Звягинцев Д.Г. Анализ экологических факторов, ограничивающих деструкцию верхового торфа // Почвоведение. 2014. № 3.
4. Добровольская Т.Г., Хуснетдинова К.А., Ману-чарова Н.А., Головченко А.В. Структура эпифитных бактериальных сообществ сорных растений // Микробиология. 2017. Т. 86, № 2.
5. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Растения как центры формирования бактериальных сообществ // Журн. общ. биол. 1993. Т. 54, № 2.
6. Кононков Ф.П., Умаров М.М. Азотфиксация в лесах южной тайги // Лесоведение. 1982. № 6.
7. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий М., 2003.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М., 1991.
9. Мигловец М.Н. Эмиссия метана в растительных сообществах мезоолиготрофного болота средней тайги // Теорет. и приклад. экол. 2014. № 1.
10. Определитель бактерий Берджи. Т. 1, 2. М., 1997.
11. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных мик-
роорганизмов в сфагновых болотах методом FISH // Микробиология. 2005. Т. 74, № 6.
12. Разгулин С.М. Фиксация атмосферного азота в различных типах леса южной тайги // Лесоведение. 1995. № 4.
13. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация азота в почве. М., 2007.
14. Albino U, Saridakis D.P., Ferreira M.C. et al. High diversity of diazotrophic bacteria associated with the carnivorous plant Drosera villosa var. villosa growing in oli-gotrophic habitats in Brazil // Plant Soil. 2006. Vol. 287.
15. Jacques M.A., Morris C.E. A review of issues related to the quantification of bacteria from the phyllo-sphere // FEMS Microbiol. Ecol. 1991. Vol. 18.
16. Manucharova N.A., Vlasenko A.N., Tourova T.P. et al. Thermophilic Chitinolytic Microorganisms of Brown Semidesert Soil // Microbiology. 2008. Vol. 77, N 5.
17. OpeltK., Berg G. Diversity and antagonistic potential of bacteria associated with bryophytes from nutrient-poor habitats of the Baltic sea coast //Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol.70, N 11.
18. Pouliot R, Rochefort L, Karofeld E, Mercier C. Initiation of Sphagnum moss hummocks in bogs and the presence of vascular plants: Is there a link? // Acta Oecol. 2011. Vol.37.
19. Redford A.J., Fierer N. Bacterial succession on the leaf surface: a novel system for studying successional dynamics // Microb. Ecol. 2009. Vol. 58 (1).
20. Tsitko I., Lusa M, Lehto J. et al. The Variation of Microbial Communities in a Depth Profile of an Acidic, Nutrient-Poor Boreal Bog in Southwestern Finland // Open J. Ecol. 2014. N4.
Поступила в редакцию 27.03.2018
BACTERIAL COMMUNITIES STRUCTURE
OF THE MAIN TYPES OF BOG PLANTS
T.G. Dobrovol'skaya, A.V. Golovchenko, E.N. Yurchenko, N.V. Kostina
This research based on both direct and seeding methods revealed high bacteria concentration on bogs plants: Carex nigra, Eriophorum vaginatum, Drosera rotundifolia, Ledum palustre. There was identified a correlation between bacteria number and investigated plants' organs. Proteobacteria dominated in phyllosphere, bacilli and actinomycetes — in rizoplane and rhizospheric soil. Representatives of the genus Pseudomonas and Erwinia dominated in phyllosphere. Nitrogenase activity of bacterial populations in rhizosphere soil was high and reached the maximum in Drosera rhizospheric soil.
Key words: bog, plants, bacteria, number, taxonomical composition, nitrogenase activity.
Сведения об авторах
Добровольская Татьяна Глебовна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Е-mail: dobrtata@mail.ru. Головчен-ко Алла Владимировна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: golovchenko.alla@gmail.com. Юрченко Елизавета Николаевна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. E-mail: ybazile10@gmail.com. Костина Наталья Викторовна, канд. биол. наук, доцент каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. E-mail: nvkostina@mail.ru.
