CC BY
84
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ТЕХНОЛОГИИ
УДК 615.33.015.8:579.862.1
STREPTOCOCCUS MUTANS - ВОЗМОЖНЫЙ ФАКТОР РИСКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ Т.В. Бродина1*, А.В. Любимова1, А.Е. Фетинг1, А.В. Силин1, Р.Ф. Юсупова1, А.В. Киселев1, Е.А. Климова2
1Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова, г. Санкт-Петербург, 2Санкт-Петербургский государственный университет, Россия
STREPTOCOCCUS MUTANS - POSSIBLE RISK FACTOR FOR ANTIBIOTIC RESISTANCE PREVALENCE
T.V. Brodina1*, A.V. Lyubimova1, A.E. Feting1, A.V. Silin1, R.F. Yusupova1, A.V. Kiselev1, E.A. Klimova2
1North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, 2St. Petersburg State University, Russian Federation
Цель. Оценить распространенность эритромицин- и тетрациклинрезистентных штаммов S. mutans, изолированных из зубного налета детей. Определить ведущий механизм их устойчивости к макролидам. Материалы и методы. Исследовано 86 штаммов S. mutans, изолированных из зубного налета детей в возрасте 6-17 лет. Скрининг на резистентность к эритромицину осуществлялся двумя методами - фе-нотипическим и генотипическим, к тетрациклину - только фенотипическим. Результаты. Доля изолятов S. mutans, фенотипически резистентных к эритромицину, составила более 16,0 %, к тетрациклину - 26,7 %. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину - наличие mef A-гена (78,6 % всех эритромицинрезистентных штаммов); 10,5 % всех исследованных штаммов S. mutans являются потенциальным резервуаром генов антибио-тикорезистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче.
Ключевые слова. S. mutans, Viridans Streptococci, гены антибиотикорезистентности, erm B, mef A.
© Бродина Т.В., Любимова А.В., Фетинг А.Е., Силин А.В., Юсупова Р.Ф., Киселев А.В., Климова Е.А., 2017 тел. +7 (812) 303 50 00 e-mail: [email protected]
[Бродина Т.В. ("контактное лицо) - аспирант кафедры эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии; Любимова А.В. - доктор медицинских наук, профессор кафедры эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии; Фетинг А.Е. - студентка VI курса; Силин А.В. - доктор медицинских наук, профессор кафедры стоматологии общей практики; Юсупова Р.Ф. - студентка VI курса; Киселев А.В. - доктор медицинских наук, профессор кафедры профилактической медицины и охраны здоровья; Климова ЕА - аспирант кафедры детской стоматологии].
Aim. To assess the prevalence of erythromycin and tetracycline-resistant S.mutans strains, isolated from child dental deposit; to determine the leading mechanism of their resistance to microlides. Materials and methods. Eighty six S. mutans strains, isolated from the dental deposits of children aged 6-17 years were studied. Screening of erythromycin resistance was fulfilled with two methods - phenotypical and genotypical, tetracycline - with phenotypical alone.
Results. The share of S. mutans isolates, phenotypically resistant to erythromycin, was 16 % , to tetracycline -26,7 %. The prevailing molecular-genetic mechanism of erythromycin resistance - presence of mef A-gene (78,6 % of all erythromycin-resistant strains); 10,5 % of all the studied S. mutans strains is a potential reservoir of antibiotic resistance genes (erm B and mef A) in the horizontal transmission. Key words. S. mutans, Viridans Streptococci, antibiotic resistance genes, erm B and mef A.
Введение
S. mutans из группы Viridans Streptococci (VGS) являются частью нормальной микрофлоры ротовой полости, которая играет важнейшую роль в подавлении колонизации полости рта другими патогенами. Однако вирулентные штаммы S. mutans способны инициировать развитие кариеса зубов. У пациентов со снижением иммунитета (ней-тропения, иммунокомпромисс) их наличие считается фактором риска аутоиммунного нефрита, неалкогольного стеатогепатита, атеросклероза, они также способны вызывать серьезные инфекции - эндокардит, сепсис и менингит [1-4, 6, 7]. Кроме того, эти бактерии могут обмениваться генетическим материалом с другими микроорганизмами, разделяющими их среду обитания. Известно, что у S. mutans и других VGS растет устойчивость ко многим антибиотикам, включая макролиды и тетрациклины [4, 9].
Стрептококки приобретают устойчивость к макролидам тремя механизмами:
1) посттранскрипционной модификацией 23S субъединицы рРНК аденин^б-метил-трансферазами (кодируемые erm-геном);
2) действием эффлюксного насоса, опосредованным геном mef A, что помогает создать
низкую концентрацию внутриклеточного лекарственного средства; 3) рибосомными мутациями в ключевом сайте при связывании с антибиотиками. Наиболее распространенный способ обмена детерминантами резистентности среди близкородственных бактерий происходит через генетический перенос in vivo. В одном из исследований была показана сильная корреляционная связь между концентрацией антибиотиков в слюне и ростом уровня колонизации резистентных штаммов S. mutans [12]. И, как следствие, S. pneumoniae или S. pyogenes и многие другие патогенные стрептококки становятся все более устойчивыми к макролидам.
Наконец, индукция устойчивости к макролидам также может непреднамеренно способствовать устойчивости к тетрациклину, так как их основные детерминанты резистентности - гены erm B и tet M - часто располагаются на одном и том же мобильном элементе. Таким образом, потенциальную роль S. mutans в качестве резервуара устойчивости к макролидам нельзя игнорировать.
Цель исследования - определение распространенности эритромицин- и тетра-циклинрезистентных штаммов S. mutans, установление основного механизма приобретения резистентности.
Пермский медицинский журнал
2017 том XXXIV № 4
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Микробиологическому исследованию был подвергнут зубной налет 80 детей в возрасте 6-17 лет, полученный при профилактическом осмотре в 2016-2017 гг.
Пробы зубного налета отбирались стерильными деревянными зубочистками, образцы сразу помещались в пробирки Eppendorf. Содержимым пробирки являлась транспортная среда - триптозно-соевый бульон объемом 200 мкл с содержанием 20%-ной сахарозы и 10 %-ной глюкозы (либо THB, BHI), в который предварительно опускали диск с антибиотиком бацитрацином концентрацией 0,04 ед. в качестве селективного фактора. Пробы хранились при температуре 4 °С и доставлялись в лабораторию в первые сутки после отбора.
Культивирование S. mutans осуществлялось при t = 37 °C на дифференциально-диагностических плотных питательных средах Mitis Salivarius agar в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов.
Чувствительность к эритромицину, клиндамицину и тетрациклину определялась диско-диффузионным методом коммерческими дисками, минимальные ингибирую-щие концентрации интерпретировались в соответствии с критериями NCCLS (США) [9].
Изоляты S. mutans изучены на устойчивость к макролидам, был определен их фенотип методом «двойных дисков» на чашках Петри с Muller - Hinton агаром. Для этого диски с эритромицином (15 мкг) и клиндамици-ном (2 мкг) были размещены на расстоянии 16 мм друг от друга. После инкубации отмечались два различных вида устойчивых
фенотипов [10]. Устойчивость к клиндами-цину и эритромицину интерпретировалась как конститутивный тип макролида - линко-замидстрептомина (cMLSB). Восприимчивость к клиндамицину и резистентность к эритромицину без Д-зоны дифференцировалась как фенотип М. Чувствительность к тетрациклинам также определялась диско-диффузионным методом с концентрацией диска 30 мкг.
Геномная ДНК выделялась с помощью набора химических реагентов для получения ДНК из проб («ДНК-экспресс», производство НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с инструкциями производителя.
Наличие генов erm В и mef А определяли методом ПЦР-амплификации, используя ранее описанные специфичные праймеры 10-превалентен.
Амплификация выполнялась в термо-циклере CFX-96 (BIO-RAD, США) с последующей электрофоретической оценкой результатов реакции. Каждый раз при постановке реакции совместно с образцами ставились положительный и отрицательный контроль для предотвращения получения ложных результатов.
Анализ ПЦР-продуктов осуществлялся методом гель-электрофореза в 1,5%-ном ага-розном геле с окраской ДНК этидиумом бромида (10 MG/ML) производства «Helixon», г. Москва, и визуализацией в УФ-лучах на трансиллюминаторе «UVT1» производства «Biokom». В качестве стандарта для оценки длины полученных ампликонов использовали маркер длин фрагментов с шагом в 100 пар нуклеотидов производства НПО «Сибэн-зим» (8 мкл маркера на дорожку). Электрофорез осуществлялся при помощи источни-
ка питания для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных и акриламидных гелях «Эльф-4» и «Эльф-8». Параметры электрофореза: 180 В, 19,0 Вт, 180 мА в течение 25 минут.
Результаты и их обсуждение
За время обследования были выделены 86 штаммов S. mutans от 80 детей. Из 86 тестируемых изолятов S. mutans у 11 (12,8 %) обнаружен M-фенотип резистентности к макролидам, у 3 (3,5 %) - cMLSB-фенотип. Индуцибельный тип iMLSB выявлен не был. Остальные 72 (83,7 %) штамма были восприимчивы к антибиотикам.
Количество фенотипически резистентных штаммов S. mutans к тетрациклину -23 изолята (26,7 %).
Среди 14 резистентных к макролидам изолятов 11 (78,6%) имели mef A-ген. Один (33,3 %) штамм с cMLSB-фенотипом был позитивен на ген erm B. М-фенотип был доминирующим (78,6 %) среди устойчивых к эритромицину штаммов. Другие исследования также показали, что М-фенотип преобладает среди VGS из ротоглотки [5]. В нашем исследовании ген erm B обнаруживался в изолятах с cMLSB-фенотипом, об этом также сообщают и другие исследователи [5, 11]. Ген mef A был обнаружен исключительно у штаммов с фенотипом М.
Доля изолятов S. mutans, фенотипиче-ски резистентных к эритромицину, составила более 16,0 %, к тетрациклину - 26,7 %. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину -наличие mef A-гена (78,6 % всех эритроми-цинрезистентных штаммов). Из всех исследованных штаммов S. mutans 10,5 % являются
потенциальным резервуаром генов антибио-тикорезистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче.
Выводы
1. Обнаружена высокая частота резистентности штаммов S. mutans к макролидам и тетрациклинам у детей в Санкт-Петербурге.
2. Необходим мониторинг резистентности к антибиотикам как S. mutans, так и других видов стрептококков, в том числе и молекулярно-генетический. Это поможет координировать направления индивидуальной (ориентированной на пациента) и по-пуляционной терапевтической стратегии.
Библиографический список
1. Bruckner L., Gigliotti F. Viridans group streptococcal infections among children with cancer and the importance of emerging antibiotic resistance. Semin Pediatr Infect Dis 2006; 17: 153-160.
2. Balletto E., Mikulska M. Bacterial infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Mediterr J Hematol Infect Dis 2015; 7: 101-109.
3. Douglas C. Identity of viridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis. J Med Microbiol 1993; 39: 179-182.
4. Gordon, K.A., Beach M.L., Biedenbach D.J., Jones R.N., Rhomberg P.R., Mutnick A.H. Antimicrobial susceptibility patterns of hemolytic and viridans group streptococci: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2000). Diag Microbiol Infect Dis 2002; 43: 157-162.
Пермский медицинский журнал
2017 том XXXIV № 4
5. loannidou S., Papaparaskevas J., Tas-sios P.T., Foustoukou M., Legakis N.J., Vatopoulus A Prevalence and characterization of the mechanisms of macrolide, lincosamide and streptogramin resistance in viridans group streptococci. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 626-629.
6. Kennedy H.F., Gemmell C.G., Bagg J., Gibson B.E.S., Michie J.R. Antimicrobial susceptibility of blood culture isolates of viridans group streptococci: relationship to a change in empirical antibiotic therapy in febrile neutropenia. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 693-696.
7. Luna V.A., Coates P., Eady E.A., Cove J.H., Nguyen T.T., Roberts M.C. A variety of grampositive bacteria carry mobile mef genes. J Antimicrob Chemother 1999; 44: 19-25.
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing -Thirteenth Informational Supplement M100-S13. NCCLS, Wayne, PA, USA 2003.
9. Seppala H., Haanpera M., Al-Juhaish M., Jarvinen H., Jalava J., HuovinenJ. Antimicrobial susceptibility patterns and macrolide resistance genes of viridans group streptococci from normal flora. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 636-644.
10. Seppala H., Nissinen A., Yu Q., Huovinen P. Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland. J Antimicrob Chemother 1993; 32: 885-891.
11. Seppala H., Skurnik M., Soini H., RobertsM.C., Huovinen P. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 257-262.
12. Soriano F., Rodriguez-Cerrato V. Pharmacodynamic and kinetic basis for the selection of pneumococcal resistance in the upper respiratory tract. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2002; 50: 51-58.
Материал поступил в редакцию 26.05.2017
