CC BY
9
DOI 10.29254/2077-4214-2018-3-145-389-392 УДК 57.086.13:577.352.462:611.018.51
*Коба Л. В., **Шапкна О. О., *Жуйкова А. е., *, **Бондаренко В. А.
СТ1ЙК1СТЬ ЕРИТРОЦИТ1В ЩУР1В Р1ЗНОГО В1КУ ДО Г1ПЕРТОН1ЧНИХ УМОВ СЕРЕДОВИЩА *Хармвський нацiональний унiверситет iM. В.Н. Kapa3iHa (м. XapKiB) **1нститут проблем крюбюлогп i крiомедицини НАН УкраТни (м. XapKiB)
oleinolsh@gmail.com
Зв'язок публшацм з плановими науково-дослщ-ними роботами. Робота виконана в1дпов1дно науко-вому напрямку в1дд1лу крюцитологп 1ПК1К НАН Укра-ши за темою «Дослщження чутливост1 еритроцит1в ссавц1в до охолодження, депдратацп та заморожуван-ня при дм модиф1куючих фактор1в i крюпротектс^в», № державно'1 реестрацп 0114U0001318.
Вступ. Вiковi змiни тваринного оргашзму вплива-ють на ефективнiсть функцюнування систем, що шд-тримають його гомеостаз [1]. Плазматична мембрана клп"ин мае особливостi складу, оргашзацп, природи взаемодш мiж компонентами, що дозволяе включа-ти и в групу систем, для яких характерно наростання дестабшзацп у часi - гомеоклаз [1]. Змши стану клп"инно'| структури впливають на функцiонування ферментних i транспортних систем клiтин. Це визна-чае |'х метаболiзм, юнний гомеостаз, ефективнiсть здiйснення специфiчних функцш, адаптацiйнi мож-ливостi. В той же час особливост стану мембранних структур клп"ин на рiзних етапах онтогенезу можуть мати латентний характер, проявляти себе при достат-ньо глибокш |'х модифтацп в певних експерименталь-них умовах.
Еритроцити ссавщв е одним з найбiльш адекват-них об'ектiв для вивчення змш, що розвиваються саме на рiвнi плазматичноУ мембрани клiтин. Вiковi змши стану еритроципв можуть виявляти себе в особливос-тях Ух осмотичноУ стiйкостi [2]. Визначати и можна по збереженню бар'ерноТ функцй' мембрани при перенесены клп"ин у нефiзiологiчнi умови середовища стре-суючого рiвня, зокрема, в 4,0 М NaCl.
Багаточисленнi дослiдження показали, що кли тинними структурами, якi визначають стiйкiсть ери-троцитiв людини та деяких ссавщв до гiпертонiчного впливу, е плазматична мембрана, цитоскелет, а також характер взаемозв'язшв мiж Тх компонентами [3-7]. Структурно-функцiональний стан саме цих клiтинних структур можна змшювати, експонуючи еритроцити в певних умовах на етап початковоТ шкубацп перед дiею основного стресуючого фактору [5,6,8]. Врахову-ючи це, можна припустити, що початкова модифiкацiя еритроцитiв щурiв в розчинах сахарози з рiзною тошч-нiстю дозволить виявити вiковi особливостi Тх плазма-тичноТ мембрани та цитоскелета в умовах ппертошч-ного впливу на ^тини в 4,0 М NaCl.
Мета дослщження - вивчити осмотичну стiйкiсть еритроципв 1- та 12-мiсячних щурiв, попередньо про-iнкубованих в гiпертонiчних розчинах сахарози, в умовах ппертошчного шоку (4,0 М NaCl).
Об'ект i методи дослiдження. Дослiдження проводили на еритроцитах самщв щурiв лшп Wistar 1- i 12-мкячного вiку. Кров одержували пiд час декаштаци
тварин пiд легким ефiрним наркозом (стабшзатор гепарин, 500 од/мл). Робота з тваринами проводилась вщповщно до «Загальних принципiв експерименпв на тваринах» (V Нацiональний конгрес з бюетики, КиТв, 2013), що були узгоджен з положеннями «£вро-пейськоТ конвенцп про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та шших наукових цшей» (Страсбург, 1986).
Еритроцити вщмивали тричi фiзiологiчним розчи-ном у 10-кратному об'eмi (0,01 М фосфатний буфер, рН 7,4) шляхом центрифугування при 1500 об/хв про-тягом 10 хв (центрифуга «ОПн-3У4.2», Киргизстан/ Вiдмитi клп"ини зберiгали при температурi 0°С не бшь-ше години. Нативнi клп"ини спочатку витримували в розчинах сахарози з рiзною концентрацieю (0,27-1,0 М) на протязi 2-60 хв при 37°С. Пiсля цього клiтини поддавали гiпертонiчному шоку за допомогою перене-сення суспензп еритроцитiв у 4,0 М №С1 (0,01 М фосфатний буфер, рН 7,4) при 37°С на 5 хв. Рiвень гемолiзу еритроцитiв вимiрювали спектрофотометричним методом при довжин хвилi 543 нм i розраховували у вщ-сотках по вiдношенню до 100% гемолiзу. Статистичну обробку результат проводили загально прийнятими методами, використовуючи критери Манна-Уiтнi.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Одним iз важливих факторiв у розвитку чутливостi еритроци-тiв до гiпертонiчного шоку (4,0 М №С1) е осмолярнiсть розчишв етапу предiнкубування. Еритроцити людини та тварин набувають рiзноТ чутливостi до дм високото-нiчних середовищ, зокрема, до переносу в 4,0 М №С1, в залежност вiд ступеню Тх депдратацп на етапi початковоТ шкубацп [3,4,6,9]. Вона може зумовлювати як зростання осмотичноТ стшкосп еритроцитiв, так i рiзке зниження Тх здатност зберiгати свою цшсшсть в висо-ко гiпертонiчних розчинах №С1 [3,4,9].
На рис. 1 представлен данi щодо часовоТ залежносп гiпертонiчного гемолiзу еритроцитiв щурiв рiз-них вiкових груп у розчинах сахарози. За першi 2 хв. ш-кубацп в цих умовах зазнае гемолiзу доволi незначна кшьмсть еритроцитiв (рiвень гемолiзу до 10% ) тварин обох втових груп (рис. 1). Подовження термшу пере-бування клiтин викликае зниження Тх осмотичноТ стшкосп. Слщ зазначити, що еритроцити щурiв молод-шоТ вшовоТ групи менш стшк порiвняно з клiтинами 12-мiсячних тварин за тих же умов тошчносл та часу шкубацп. Так, максимальний рiвень гемолiзу клiтин 1-мiсячних тварин в ппертошчних розчинах сахарози досягае 44% на 30-ту хвилину та 60% - на 60-у хвилину, а 12-мкячних тварин вщповщно 28% та 42% за тих же умов шкубування.
Еритроцити тсля попередньоТ шкубацп в розчинах неелектролп"а переносили в 4,0 М №С1. Данi про
Рис. 1. Залежшсть р^вня гемолизу еритроцилв 1- та 12-мкячних щур^в в розчинах сахарози вщ часу шкубацм:
2 та 10 хв (А); 30 та 60 хв (Б).
вплив умов початковоТ шкубацм в розчинах сахарози на стшшсть еритроци™ щурiв до подальшого переносу в 4,0 М №С1 представлен на рис. 2.
Звертае на себе увагу той факт, що захисний ефект попереднього зневоднених клп"ин спостерiгаеться тiльки при нетривалому шкубуванш (2 хв) еритроцитiв 1-мкячних щурiв. У цьому випадку середовище деп-дратацм мiстило 0,5 М сахарозу. Отримаш нами дан1 взагалi узгоджуються з результатами, представлени-ми в робот [4], i свщчать, що корекцiя гшертотчно1 чутливостi еритроципв щура можлива в результат! модифiкацil вих1дного стану клiтин на етапах, як1 пе-редують гiпертонiчному впливу. Крiм того, показано [6,8], що формування стшкого стану еритроцитiв щура, людини i коня до ппертошчного шоку (4,0 моль/л NaCl, 37°С) визначаеться осмоляльнiстю середовища, а не юнною силою розчину, оскiльки вш формуеться в умовах попередньоТ шкубацм клп"ин як у сольових, так i в сахарозних середовищах, осмоляльнiсть яких скла-дае 550-700 i 550-800 мОсм/кг вiдповiдно.
З рис. 2А видно, що рiвень гемолiзу еритроцитiв тварин обох вiкових груп в 4,0 М №С1 зростае при по-передньому нетривалому шкубуванш (2 i 10 хв) у сахарозних середовищах iз концентращею 0,7 М i вище. Максимальний рiвень гемолiзу еритроцитiв 1-мкяч-них тварин в ппертошчному розчинi №С1 дорiвнюе ~70%, а 12-мiсячних щурiв - ~50%.
При збiльшеннi часу експонування (30 i 60 хв) в ппертошчних розчинах сахарози також спостер^а-еться сенсибiлiзацiя еритроцитiв тварин обох втових груп до переносу в 4,0 М №С1 (рис. 2Б). При цьому вщзначаеться зростання гемолiтичного пошкоджен-ня у ппертошчному сольовому розчиш еритроцитiв, якi були попередньо прошкубоваш у середовищах, що м^или 0,5 - 1,0 М сахарозу. Здаеться, що бтьш стшкими до дм 4,0 М №С1 е еритроцити 1-мiсячних щурiв (рис. 2Б). Але саме клп"ини тварин щеТ вшовоТ' групи значно пошкоджуються в неелектролiтному се-редовищi (рис. 1Б). Тому «стшюсть» еритроцитiв, що
спостеркаеться (рис. 2Б), обумовлена, в першу чергу, незначною кiлькiстю ^тин, що зберегли свою цшс-шсть в неелектролiтних середовищах та гемолiзують у 4,0 М NaCl.
Таким чином, представлеш на рис. 1Б даш свщ-чать про те, що еритроцити 1-мкячних щурiв зазна-ють значного гемолiзу в розчинах сахарози на етат початковоТ шкубацм при подовженш ТТ термiну до 30-60 хв. Еритроцити 12-мкячних щурiв мають бiльшу осмотичну стiйкiсть до ппертошчних умов в неелек-тролпших середовищах, але суттево сенсибiлiзуються до подальшого переносу в 4,0 М №С1 при подовженш термшу Тх початковоТ експозици в них.
Вщомо, що в гiпертонiчних розчинах як електроли тiв, так i неелектролтв еритроцити зазнають депдра-таци. 1Т ступiнь задаеться як тонiчнiстю середовища, так i часом експонування клiтин в таких умовах [10]. Експонування еритроцитв в розчинах сахарози супро-воджуеться втратою не тiльки води, а й електролтв. Втрата електролтв пов'язана з виходом анюшв С1-, для яких проникнiсть мембрани даного типу клп"ин е достатньо високою, компенсаторно залишають еритроцити катюни калш [11]. Вихiд С1- здшснюеться шляхом його обмiну на позаклп"инний ОН- або котран-спортом з протоном [11]. Внаслщок таких змш iонного складу клiтин шдвищуеться внутрiшньоклiтинне рН, що викликае сут^ змiни стану цитоскелета та його здатност зв'язуватись з компонентами мембрани. К^м того, вихiд iз клп"ини електролiтiв викликае до-даткову юн-залежну дегiдратацiю [10]. В таких умовах клп"ини втрачають не тiльки фракцш вшьноТ об'емноТ води, але й певну частину структурованоТ. Внаслiдок цього змшюеться стан бiлкiв клiтини рiзноТ локалiзацiТ, у тому числi цитоскелета та мембрани, ^ як наслщок, стан комплексу цитоскелет-мембрани в цшому._
Таким чином, у визначеннi чутливост еритроцитiв до змiни осмотичних умов важливим е вихiднi параме-три позакжтинного середовища, що визначають стан клп"ин. Пiдвищення концентрацм зовнiшнього серед-
Рис. 2. Залежшсть гемолiзу еритроцитiв 1- та 12-1шсячних щурiв в 4,0 М NaCl (37 С) вщ часу шкубацм' в розчинах сахарози:
2 та 10 хв (А); 30 та 60 хв (Б).
овища вище певних (порогових) значень може значно пiдвищити чутлив^ь клiтин до подальших змiн умов середовища i стресових впливiв [4,12]. Можливо, стан пщвищено'| чутливостi зневоднених ^тин пов'язаний з нестабiльнiстю клп~инно'| мембрани, що виникае через порушення щiльностi упаковки як компонентiв лтщного бiшару, так i бiлкiв цитоскелета.
Стан функцюнального комплексу цитоскелет-плазматична мембрана, досягнутий в умовах деп-дратацп в гiпертонiчних розчинах сахарози, визначае здатшсть еритроцитiв не тшьки зберiгати структурну цiлiснiсть за таких умов, але й характер осмотично'( чутливост до подальшого переносу в 4,0 М №С1.
Виявленi особливост осмотично'| стiйкостi еритро-цитiв щурiв 1- i 12-мiсячного вiку можуть бути наслщ-ком змiн кшьшсного складу певних бiлкiв плазматич-но'| мембрани та цитоскелета. Показано, що в процес циркуляцп в цих клп"инах знижуеться вмiст основних бшмв, що формують цитоскелет, iнтегрального бшка смуги 3, бiлкiв, якi забезпечують зв'язування мiж ци-тоскелетом i плазматичною мембраною з форму-ванням единого функцюнального комплексу з цих
структур [2,13]. Зокрема ц змши розвиваються при внутркудинному старiннi функцюнально зрiлих кли тин. ^м того встановлено, що стан лтщного бшару мембрани, вмiст спектринiв, актину, глщеральдепд-дегiдрогенази, глютатiон S трансферази в еритроцитах щурiв змiнюeться на певних етапах онтогенезу [2]. Так1 вiковi особливостi кiлькiсного складу бiлкiв еритроци-тiв, зокрема, плазматичноУ мембрани та цитоскелета, будуть впливати не ттьки на тдтримання форми ери-троцитв, пластичностi ïx мембрани, але й на стшшсть клiтин в депдратуючих умовах, при змiнi внутр^тин-ного рН та юнного гомеостазу цих клп"ин.
Висновки. Показано, що стшшсть еритроцитiв щурiв до гiпертонiчниx розчишв сахарози залежить вiд Ух тошчносп, часу шкубацм та вiку тварин. 1нкуба-цiя в гiпертонiчниx розчинах сахарози сенсибшзуе еритроцити щурiв до ппертошчного шоку.
Перспективи подальших дослщжень. В подальших дослiдженняx плануеться вивчити вплив модифи кацп взаемодп цитоскелета та мембрани еритроцитiв 1- та 12-мкячних щурiв на осмотичну стшмсть цих кли тин до ппертошчних умов.
4.
5.
9.
flrrepaTypa
Voytenko VP. Eritrotsit: Stareniye kletki i stareniye organizma. Tsitologiya i genetika. 1984;6:442-7. [in Russian].
Snegireva LV. Reologicheskiye svoystva eritrotsitov v ikh ontogeneze [avtoreferat]. Kursk: Kurskiy gosudarstvennyy meditsinskiy universitet; 2004. 22 s. [in Russian].
Bondarenko VA, Bondarenko TP, Rudenko SV. Effekty degidratatsii v kontrole kholodovoy i osmoticheskoy chuvstvitel'nosti kletok. Problemy kriobiologii. 1992;4:14-26. [in Russian].
Shpakova NM. Temperaturna ta osmotychna stiykist' erytrotsytiv riznykh vydiv ssavtsiv [avtoreferat]. Kharkiv: Instytut problem kriobiolohiyi i kriomedytsyny; 2014. 44 s. [in Ukrainian].
Shpakova NM, Orlova NV, Nipot YeYe, Shapkina OA. Vliyaniye glitserina na ustoychivost' eritrotsitov cheloveka k gipertonicheskomu i mekhanicheskomu stressu. Visnyk problem biolohiyi i medytsyny. 2015;3(2):352-5. [in Russian].
Shpakova NM, Orlova NV, Nipot YeYe, Shapkina OA, Mazur AA. Osmoticheskaya chuvstvitel'nost' eritrotsitov mlekopitayushchikh pri modifikatsii ikh iskhodnogo sostoyaniya. Visnyk problem biolohiyi i medytsyny. 2016;2(3):356-61. [in Russian].
Saito M, Watanabe-Nakayama T, Machida S, Osada T, Afrin R, Ikai A. Spectrin-ankyrin interaction mechanics: A key force balance factor in the red blood cell membrane skeleton. Biophysical Chemistry. 2015;(200-201):1-8.
Yershova NA, Shpakova NM, Orlova NV. Vliyaniye fenilgidrazina i alkilsul'fatov na osmoticheskuyu chuvstvitel'nost' eritrotsitov mlekopitayushchikh. Dopovidi NAN Ukrayiny. 2012;6:129-33. [in Russian].
Pozdnyakov VV. Vliyaniye sostav i osmolyarnosti sredy na ustoychivost' eritrotsitov k osmoticheskomu i temperaturnomu shoku [avtoreferat]. Khar'kov: Institut problem kriobiologii i kriomeditsiny; 1989. 16 s. [in Russian].
10. Pesina NI. Issledovaniye bar'yernoy ustoychivosti plazmaticheskoy membrany eritrotsitov v usloviyakh osmoticheskogo i temperaturnogo shoka: [avtoreferat]. Khar'kov: Institut problem kriobiologii i kriomeditsiny; 1993. 16 s. [in Russian].
11. Wessel JMC, Veerkap JH. Some aspects of the osmotic lysis of erythrocytes. Differenses in osmotic behaviour of erythrocytes after treatment with electrolyte and nonelectrolyte solutions. Biochim. Biophys. Acta. 1973;291(1):57-71.
12. Shpakova NM, Orlova NM, Nipot YeYe. Obezvozhivaniye eritrotsitov mlekopitayushchikh vliyayet na ikh chuvstvitel'nost' k mekhanicheskomu stressu. Problemy kriobiologii i kriomeditsiny. 2015;25(1):24-32. [in Russian].
13. Snegireva LV, Ivanov VP, Shevereva YuV. Sravnitel'nyy analiz kolichestvennogo predstavitel'stva belkov kletochnykh membran eritrotsitov raznogo vozrasta. V Materialy konf Aktual'ne problemy biologii, meditsiny i ekologii; Tomsk: Tomskiy gosudarstvennyy universitet. 2004;3(1):158-9. [in Russian].
СПЙШСТЬ ЕРИТРОЦИТ1В ЩУР1В Р1ЗНОГО В1КУ ДО Г1ПЕРТОН1ЧНИХ УМОВ СЕРЕДОВИЩА Коба Л. В., Шапкша О. О., Жуйкова А. €., Бондаренко В. А.
Резюме. Еритроцити 1- i 12-мкячних щурiв пiддaвaли ппертошчному шоку (4,0 М NaCl) пiсля початковоТ шкубацп в розчинах сахарози (0,27 - 1,0 М) на протязi 2, 10, 30, 60 хв. В ппертошчних неелектролп"них серед-овищах частина клiтин тварин обох вiкових груп зазнае rемолiзу. PiBeHb Тх пошкодження залежить вiд тонiчностi розчину, часу експонування, вшу тварин. Початкова шкубащя еритроцитiв 1- i 12-мкячних щурiв в розчинах сахарози пiдвищуе Тх чутлив^ь до подальшого переносу в 4,0 М NaCl.
Ключовi слова: осмотична стiйкiсть, еритроцити щурiв, ппертошчш розчини сахарози, riпертонiчний шок.
УСТОЙЧИВОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА К ГИПЕРТОНИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ Коба Л. В., Шапкина О. А., Жуйкова А. Е., Бондаренко В. А.
Резюме. Эритроциты 1- и 12-месячных белых крыс подвергали гипертоническому шоку (4,0 М NaCl) после их предварительной модификации в растворах сахарозы (0,27 - 1,0 М) в течение 2, 10, 30, 60 мин. В гипертонических неэлектролитных средах часть клеток животных обеих возрастных групп подвергается повреждению. Уровень их гемолиза зависит от тоничности среды, времени экспозиции и возраста животных. Исходная инкубация эритроцитов 1- и 12-месячных крыс в растворах сахарозы повышает их чувствительность к дальнейшему переносу в 4,0 М NaCl.
Ключевые слова: осмотическая устойчивость, эритроциты крыс, гипертонические растворы сахарозы, гипертонический шок.
STABILITY OF DIFFERENT AGE RAT ERYTHROCYTES TO HYPERTONIC MEDIUM Koba L. V., Shapkina O. A., Zhuikova A. E., Bondarenko V. A.
Abstract. Age-related changes in the animal organism develop at the level of cells, organs, and physiological systems. Changes in the membrane structures of cells at different stages of ontogeny can have a latent character, manifest themselves in certain experimental conditions beyond the physiological norm. Stability of mammalian erythrocytes to hypertonic influence is determined by the cytoskeleton-plasma membrane complex. Its condition can be changed by exposing erythrocytes under certain conditions at the stage of pre-incubation before the action of the main stress factor.
The aim of the study was to investigate the osmotic resistance of erythrocytes of 1- and 12-month-old white rats to hypertonic shock (4.0 M NaCl) after preliminary incubation in sucrose solutions (0.27-1.0 M).
Object and methods of research. The experiments were performed on red blood cells of male Wistar rats of 1 and 12 months. The washed red blood cells were preincubated in sucrose solutions for 2, 10, 30, 60 minutes at 37°C and then transferred to 4.0 M NaCl at the same temperature. The cells were precipitated by centrifugation. The hemoglobin content in the supernantant was measured spectrophotometrically. The level of hemolysis in the sample was expressed as a percentage of the sample with 100% hemolysis. Statistical processing of the results was carried out by conventional methods using Mann-Whitney criteria.
Result and discussion. It was found that the rat erythrocytes are hemolysed in sucrose solutions during the preincubation stage. During the first 2 minutes under these conditions not more than 10% of the cells of animals of both age groups are damaged. Longer incubation of erythrocytes in non-electrolyte media is responsible for a decrease in their osmotic stability. Rat erythrocytes of the younger age group are less stable compared to the cells of 12-month-old animals under the same conditions of tonicity and incubation time. So the level of hemolysis of cells of 1-month-old animals in hypertonic sucrose solutions reaches 44% by the 30th minute and 60% by the 60th minute, and 12-month animals, respectively, 28% and 42% under the same incubation conditions.
The character of the effect of pre-incubation conditions on the osmotic resistance of erythrocytes to further transfer to 4.0 M NaCl depends on the conditions at this stage and the age of the animals. A decrease in the level of hemolysis in 4.0 M NaCl is observed only after a 2-minute incubation of cells of 1-month-old rats in solution with 0.5 M sucrose. With an increase in the pre-exposure time (30 and 60 min), the erythrocytes of both age groups become sensitive to a transfer in 4.0 M NaCl. In this case, hemolytic damage in hypertonic saline solution of erythrocytes increases after preliminary incubation in media with 0.5-1.0 M sucrose. Thus, erythrocytes of 1-month-old rats undergo hemolysis in sucrose solutions during the pre-incubation stage with an increase in its duration to 30-60 min. The erythrocytes of 12-month-old rats have a large osmotic resistance to hypertonic conditions in non-electrolyte media, but are substantially sensitized to further transfer to 4.0 M NaCl with increasing time of their initial exposure in them.
Conclusions. It is shown that the resistance of rat erythrocytes to hypertonic solutions of sucrose depends on the tonicity of the medium, the incubation time and the age of the animals. Incubation in hypertonic sucrose solutions, mainly, sensitizes the erythrocytes of rats to hypertonic shock (4.0 M NaCl).
Key words: osmotic stability, rat erythrocytes, hypertensive sucrose solutions, hypertonic shock.
Рецензент - проф. Мщенко I. В.
Стаття надшшла 21.08.2018 року
