Стимуляция цитотоксического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток у больных раком молочной железы дендритными клетками, нагруженными антигенами опухолевых лизатов

Шевченко Юлия Александровна; Хантакова Юлия Николаевна; Курилин Василий Васильевич; Лопатникова Юлия Анатольевна; Сидоров Сергей Васильевич; Козлов Владимир Александрович; Сенников Сергей Витальевич

ИММУНООНКОЛОГИЯ

Ю.А. Шевченко1, Ю.Н. Хантакова1, В.В. Курилин1, Ю.А. Лопатникова1, С.В. Сидоров2,

В.А. Козлов1, С.В. Сенников1

СТИМУЛЯЦИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В КУЛЬТУРЕ

мононуклеарных клеток у больных раком молочной железы дендритными клетками, нагруженными антигенами опухолевых лизатов

1Лаборатория молекулярной иммунологии ФГБУ Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН, 630099, г. Новосибирск, ул. ядринцевская, д. 14; 2гБУЗ г Новосибирска городская клиническая больница № 1,630047, г. Новосибирск, ул.Залесского, 6

Для модуляции противоопухолевого иммунного ответа in vitro применяли аутологичные дендритные клетки, нагруженные антигенами опухолевого лизата, культивированные с мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови у больных раком молочной железы в присутствии интерлейкина (IL)-12 и IL-18 или без них. Эффективность модуляции оценивали по цитотоксической активности МНК против аутологичных опухолевых клеток, продукции интерферона y (IFNy), IL-10, IL-4 и количеству перфорин-позитивных лимфоцитов. Показана максимальная стимуляция Th1 и цитотоксического иммунного ответа в культуре (увеличение процента гибели аутологичных опухолевых клеток, повышение количества перфоринпозитивных лимфоцитов и продукции IFNy).

Ключевые слова: дендритные клетки, цитотоксичность, опухолевый лизат, перфорин

J.A. Shevchenko1, J.N. Khantakova1, V.V. Kurilin1, J.A. Lopatnikova1, S.V Sidorov2, V.A. Kozlov1, S.V Sennikov1

STIMULATION OF CYTOTOXIC IMMUNE RESPONSE IN BREAST CANCER PATIENTS CULTURE OF MONONUCLEAR CELLS WITH DENDRITIC CELLS LOADED BY TUMOR ANTIGENS LYSATES

Tederal State Budgetary Institution “Research Institute Of Clinical Immunology” Under The Russian Academy Of Medical Sciences Siberian Branch; 630099, Novosibirsk, Russian Federation, Yadrintsevskaya st. 14; 2State Budgetary organization of healthcare «Municipal clinical Hospital №1»; 630099, Novosibirsk, Russian Federation, zaleskov st. 6 We used dendritic cells loaded with tumor lysate antigens to stimulate the cytotoxic response in cultured mononuclear cells in patients with breast cancer. To gain T1 and cytotoxic response, we used the immunoregulatory cytokines IL-12 and IL-18. The effectiveness of modulating the immune response was assessed by cytotoxic activity against autologous tumor MNCs cell products IFN-y, IL-10, IL-4, and the number of perforin-positive lymphocytes. Shows the maximum stimulation of Th1 and cytotoxic immune response in culture under the action of IL-12 and IL-18: increased destruction of autologous tumor cells, increasing the number of perforin-positive lymphocytes and production of IFN-y.

Key worlds: dendritic cells, cytotoxity, tumor lysate, perforin

Введение

Несмотря на успехи диагностики и лечения рак молочной железы (РМЖ) до сих пор является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин [1]. Это делает актуальным поиск новых методов лечения, которые будут направлены как на первичный очаг онкологического процесса, так и на циркулирующие и диссеминированные опухолевые клетки, которые являются основной причиной развития метастазов и рецидивов заболевания. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезен-тирующими клетками [13] и индуцируют иммунный ответ путем запуска каскада иммунологических реакций. В настоящее время активно исследуется возможность индукции специфических протективных противоопухолевых иммунных реакций как in vitro, так и in vivo [11, 12, 15]. Гетерогенная природа опухоли способствует экспрессии широкого спектра опухольассоциированных антигенов, поэтому применение опухолевого лизата как источника антигенов для на-

Шевченко Юлия Александровна (Shevchenko Julija Aleksandrovna) e-mail: [email protected]

грузки ДК способствует естественному процессингу антигена и потенциально приводит к стимуляции поликлонального как OD4+-, так и CD8+-иммунного ответа и формированию иммунологической памяти [3, 5, 7. 10]. В связи с этим целью данной работы стало изучение эффективности стимуляции клеточного цитотоксического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток (МНК) у больных раком молочной железы с помощью ДК, нагруженных антигенами лизата аутологичных опухолевых клеток.

Материалы и методы. В работе использовали периферическую кровь и образцы опухоли у 22 пациентов с раком молочной железы I-II стадии, проходивших лечение на базе 3-го онкологического отделения МУЗ Городской клинической больницы № 1 г Новосибирска. Все больные дали информированное согласие на проведение процедуры забора материала.

Получение ДК. МНК периферической крови у пациенток выделяли стандартным методом на градиенте фиколла-урографина (р = 1,077 кг/см3). Из полученной популяции МНК выделяли клетки с повышенной способностью к адгезии с помощью кратковременной инкубации (в течение 2 ч) в культуральном флаконе (75 см2) в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыво-

- 327 -

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013

%

Рис. 1. Цитотоксический ответ совместной культуры МНК у больных (п = 22) РМЖ и аутологичных ДК против аутологичных опухолевых клеток.

Здесь и на рис. 2, 3: данные представлены в виде медианы и межквар-тильного интервала; стрелками показаны достоверные различия при p < 0,05. МНК - контрольная культура МНК; МНК + ДК (0) - совместная культура МНК и ДК, не нагруженных антигенами опухолевого лизата; МНК + ДК (лизат) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных антигенами опухолевого лизата.

ротки (HyClone), 40 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 200 ЕД/мл бензилпенициллина (ЗАО «Синтез» Курган), 2 мМ L-глутамина (Биолот, Россия), 5-10-5M 2-меркаптоэтанола HEPES (Sigma, США), 10 мМ HEPES (Sigma, США) (далее полная среда RpMI-1640) при 5% СО2 и 37°С. Прилипшую фракцию культивировали в 48-луночном планшете при концентрации 1 млн/мл, в объеме 0,5 мл в полной среде RPMI-1640 при 5% СО2 и 37°С. К прилипшей фракции МНК добавляли 50 нг/мл rhGM-CSF, 100 нг/мл rhIL-4 (BioVision, США) для получения незрелых ДК на протяжении 4 сут. К незрелым ДК добавляли лизат аутологичных опухолевых клеток в концентрации 100 мкг/мл. В качестве контрольной группы применяли ДК, ненагруженные антигенами опухолевого лизата. Для созревания в течение последующих 24 ч в культуру вносили 25 нг/мл rhTNFa (ФБУН ГНЦ «Вектор», Новосибирск) в свежей порции культуральной среды эквивалентного объема. Фракцию неприлипших клеток сохраняли в культуральном флаконе (75 см2) в концентрации 2 млн/мл в полной среде RPMI-1640 при 5% СО2и 37°С до проведения процедуры ссаживания.

Совместное культивирование ДК и МНК проводили в параллельных культурах при концентрации неприлипших МНК 1 млн/мл, соотношении ДК:МНК - 1:10 для последующего проведения различных функциональных тестов. Для стимуляции ТЫ-поляризации применяли 10 нг/мл rhIL-12 (PeproTech, США) и 100 нг/мл rhIL-18 (MBL, США). МНК, предназначенные для оценки цитотоксической активности против аутологичных опухолевых клеток, культивировали 4 сут в полной среде в присутствии или в отсутствие рекомбинантных цитокинов. МНК, предназначенные для оценки цитокин-продуцирующей активности и внутриклеточного маркера перфорина, культивировали 2 сут в полной среде RPMI-1640 в присутствии или в отсутствие рекомбинантных цитокинов, затем культуры отмывали от ростовых факторов и дополнительно культивировали в течение последующих 2 сут.

Получение лизата опухолевых клеток и аутологичных опухолевых клеток. Образец опухоли отмывали в среде RPMI-1640 с двухкратной концентрацией антибиотиков и делили на две части. Для получения лизата фрагмент опухоли подвергали механической гомогенизации и 3-кратному циклу замораживания при -70°С и оттаивания при +37°С, клеточную массу осаждали центрифугированием, затем стерилизовали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (TPP, Швейцария). Общую концентрацию белка в лизате определяли на приборе «NanoDrop» (Thermo Scientific, США) по

%

Рис. 2. Содержание перфоринпозитивных клеток в совместной культуре МНК у больных (п = 22) РМЖ и аутологичных ДК.

соотношению оптической плотности на 260/280 нм. Для получения аутологичных опухолевых клеток фрагмент опухоли измельчали и оставляли на ночь в 0,25% растворе трипсина (“ПанЭко”, Москва) при +4°С, для инактивации действия фермента добавляли теплую полную среду RPMI-1640. Клеточную суспензию пропускали через фильтр для удаления крупных агрегатов, отмывали 2 раза, затем замораживали в эмбриональной телячьей сыворотке с 10% DMSO (Panreac, Испания).

Оценка цитотоксической активности. Цитотоксический эффект изучали, оценивая содержание ЛДГ в кондиционной среде, полученной при совместном культивировании МНК, стимулированных ДК, и опухолевых клеток. Процедуру проводили согласно инструкции производителя набора (CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, США).

Определение содержания перфоринпозитивных клеток. Анализируемые клетки однократно отмывали в забуферен-ном физрастворе (PBS), фиксировали в течение 20 мин 1% раствором параформальдегида (Fluka, Германия) в холодном PBS. Фиксированные клетки инкубировали 20 мин для пер-меабилизации клеточной мембраны в PBS с 0,2% Tween 20 (Panreac, Испания), после чего клетки отмывали и инкубировали с моноклональными антителами, меченными флюорох-ромами (Perforin-FITC, BD) в течение 30 мин. Клетки отмывали от метки и определяли количество позитивных клеток методом проточной цитометрии (BD FACS Aria) в лимфоцитарном регионе.

Содержание иммунорегуляторных цитокинов интер-ферона-у (IFNy), IL-4 и IL-10 в кондиционных средах совместных культур МНК с аутологичными ДК оценивали с помощью иммуноферментного анализа с применением соответствующих коммерческих тест-систем производства «Вектор-Бест» согласно протоколу производителя.

Статистическая обработка данных. Результаты статистически обрабатывали при помощи программы «Statistica 6.0». При ненормальном распределении выборки для статистической проверки использовали непараметрический критерий Уилкоксона, данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.

Результаты и обсуждение. В настоящее время одно из перспективных направлений в лечении онкологических заболеваний - применение специфической иммунотерапии, в основе которой лежит использование опухольассо-циированных антигенов для «обучения» клеток-эффекторов больного (Т-лимфоциты, NK-клетки) посредством естественного представление антигена через антигенпрезентирующие клетки. Терапевтические противоопухолевые вакцины имеют две основных цели: праймирование антигенспецифических Т-клеток и/или перепрограммирование одного типа иммунного ответа в другой, например от регуляторного к цитотоксическому [14]. Основной задачей в этом направлении является получение аутологичных ДК, способных стимулировать

- 328 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

пг/мл

Спонтанная 88881 IL-18+IL-12

Рис. 3. Продукция IFNy МНК у больных (n = 22) РМЖ, культивированных с аутологичными ДК.

противоопухолевый иммунитет. При культивировании in vitro происходит естественная нагрузка антигеном ДК, что способствует преодолению толерантности T-клеток к опухолевым антигенам и развитию полноценного иммунного ответа [9]. В дополнение к распознаванию антигена и экспрессии костимуляторных факторов ДК для направленной поляризации иммунного ответа и развития соответствующих популяций лейкоцитов необходимы различные ростовые факторы [4]. Праймирование и активация противоопухолевого ответа идеально происходит в условиях TM-поляризации, которое обеспечивается IFNy и характеризуется присутствием CD8+ T-клеток, CD4+ T-хелперов 1 типа и NK-клеток [6, 17]. IL-12 оказывает плейотропное действие путем индукции Th1-клеток из Th0, стимуляции продукции IFN-y, пролиферации T-клеток и NK-клеток и усиления цитотоксического ответа NK-клетками и лимфокинактивированными T-клетками. IL-18 играет основную роль в запуске Thl-ответа in vivo, стимулирует активацию и цитолитическую активность, опосредованную через Fas-FasL зависимый механизм [2]. Совместное применение IL-12 и IL-18 приводит к максимальной стимуляции продукции IFNy [8].

Иммунный ответ против злокачественных новообразований подразумевает разрушение опухолевых клеток. Основным механизмом элиминации опухолевых клеток является их непосредственный лизис, поэтому провели оценку цитотоксической активности МНК, которые активированы ДК, нагруженными антигенами лизата опухолевых клеток, против опухолевых клеток колориметрическим методом, что позволило провести определение содержания ЛДГ - цитозольного фермента, выделяющегося из лизированных клеток. Применение ДК, нагруженных антигенами опухолевого лизата, приводит к усилению цитотоксической активности МНК против аутологичных опухолевых клеток по сравнению с клетками исходной популяции (рис. 1). Добавление IL-12 и IL-18 при совместном культивировании МНК и ДК, нагруженных лизатом, вызывает еще более выраженное повышение цитотоксической активности против опухолевых клеток по сравнению с таковым без применения цитокинов. Кроме того, уровень цитотоксичности достоверно отличается от данного показателя в исходной популяции МНК и при использовании ДК, ненагруженных антигенов при тех же условиях культивирования. Таким образом, ДК и дополнительные факторы естественного микроокружения создают в культуре МНК условия для оптимального проявления цитотоксической активности.

Одним из возможных механизмов лизиса опухолевых клеток является перфоринзависимый механизм, при котором происходят образование пор в цитоплазматической мембране и лизис клеток-мишеней [16]. Для проверки предположения о возможном механизме лизиса опухолевых клеток определяли содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный

белок перфорин, в культуре МНК после сокультивирования с ДК, нагруженными антигенами опухолевого лизата (рис. 2). Применение ДК, нагруженных антигенами опухолевого лизата, способствует максимальному повышению содержания перфоринпозитивных клеток в популяции МНК при совместном культивировании по сравнению как с клетками исходной популяции, так и с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген в культурах с дополнительной стимуляцией секреции перфорина с помощью цитокинов. По спонтанной секреции перфорина без дополнительных стимуляторов достоверные различия отметили только при сравнении групп с использованием ДК, нагруженных и не нагруженных антигенами опухолевого лизата. При этом содержание пер-форинпозитивных клеток в общей популяции лимфоцитов после максимально эффективной стимуляции не превышает 5%, что может быть связано как с уже состоявшейся дегрануляцией эффекторных клеток, так и с механизмами, которые препятствуют накоплению большого количества перфорина, способного давать апоптогенный эффект не только на клетки-мишени, но и на эффекторные T-клетки [18].

В реализации цитотоксического эффекта лимфоцитов против опухолевых клеток активно участвуют различные иммунорегуляторные молекулы. Поэтому посчитали необходимым оценить продукцию IFNy, IL-4 и IL-10 в совместной культуре МНК и ДК при предварительной обработке культуры клеток иммунорегуляторными цитокинами IL-12 и IL-18.

Добавление иммунорегуляторных цитокинов IL-12 и IL-18 при совместном культивировании ДК и МНК у больных РМЖ приводит к длительной и устойчивой продукции IFNy при последующем удалении IL-12 и IL-18 из культуры. Применение ДК, нагруженных антигенами опухолевого лизата, также вызывает повышение секреции IFNy МНК при совместном культивировании по сравнению как с клетками исходной популяции, так и с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген в культурах с дополнительной стимуляцией продукции IFNy с помощью IL-12 и IL-18. По спонтанной секреции продукции IFNy без дополнительных стимуляторов достоверные различия отметили только при сравнении групп с использованием ДК, нагруженных и не нагруженных антигенами опухолевого лизата с МНК исходной популяции. При исследовании продукции IL-10 выявили, что ДК, нагруженные антигенами опухолевого лизата, не стимулировали продукцию IL-10 при совместном культивировании с МНК, что позволяет предположить отсутствие появления регуляторных IL-10-продуцирующих Т-клеток, которые участвуют в формировании толерантности на опухольассоциированные антигены собственных тканей пациента. Концентрация IL-4 в совместных культурах определяли на уровне пороговых значений (рис. 3).

Таким образом, при культивировании зрелых аутологичных ДК, нагруженных антигенами опухолевых лизатов, при дополнительном присутствии иммунорегуляторных факторов IL-12- и IL-18-ответа происходят лизис опухолевых клеток, накопление внутриклеточных медиаторов, необходимых для лизиса клеток-мишеней, и устойчивая секреция ключевого цитокина IFNy, что свидетельствует о формировании эффективного TM-ответа, способствующего активации противоопухолевого иммунного ответа.

Работа поддержана ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» (соглашение № 8265).

ЛИТЕРАТУРА

1. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В., ред. Состояние онкологической помощи населению России в 2011 году. М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, 2012.

15. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе. Медицинская иммунология. 2005; 7 (4): 355-64.

- 329 -

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013

REFERENCES

1. Chissov V.I., Starinskij V.V., Petrova G.V., eds. Condition cancer care in Russia in 2011. M.: FGBU «MNIOI im. P.A. Gercena» Minzdravsocrazvitija Rossii; 2012 (in Russian).

2. Palucka K., Ueno H., Fay J., Banchereau J. Dendritic cells and immunity against cancer. J. Intern. Med. 2011; 269 (1): 64-73.

3. Mohamadzadeh M., Luftig R. Dendritic cells: In the forefront of immunopathogenesis and vaccine development. A review. J. Immune Based Ther. Vaccines. 2004; 2 (1): 1.

4. O’NeillD.W., AdamsS., BhardwajN. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004; 104 (8): 2235-46.

5. Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. Cancer Invest. 2003; 21 (6): 873-8.

6. Bohnenkamp H.R., Coleman J., Burchell J.M., Taylor-Papadimitriou J., Noll T. Breast carcinoma cell lysate-pulsed dendritic cells cross-prime MUC 1-specific CD8+ T cells identified by peptide-MHC-class-I tetramers. Cell. Immunol. 2004; 231 (1-2): 112-25.

7. Chiang C.L., Maier D.A., Kandalaft L.E., Brennan A.L., Lanitis E., Ye Q. et al. Optimizing parameters for clinical-scale production of high IL-12 secreting dendritic cells pulsed with oxidized whole tumor cell lysate. J. Transl. Med. 2011; 9: 198. doi: 10.1186/1479-5876-9-198.

8. Delirezh N., Moazzeni S.M., Shokri F., Shokrgozar M. A., Atri M., Kokhaei P. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce T cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. Cell. Immunol. 2009; 257 (1-2): 23-31.

9. Kass R., Bellone S., Palmieri M., Cane S., Bignotti E., Henry-Tillman R. et al. Restoration of tumor-specific HLA class I restricted cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes of advanced breast cancer patients by in vitro stimulation with

tumor antigen-pulsed autologous dendritic cells. Breast Cancer Res. Treat. 2003; 80 (3): 275-85.

10. Pandolfi F., Cianci R., Pagliari D., Casciano F., Bagala C., As-tone A. et al. The immune response to tumors as a tool toward immunotherapy. Clin. Dev. Immunol. 2011; 2011: 894704. doi: 10.1155/2011/894704.

11. Jeras M., Bergant M., Repnik U. In vitro preparation and functional assessment of human monocyte-derived dendritic cells-po-tential antigen-specific modulators of in vivo immune responses. Transplant. Immunol. 2005; 14 (3-4): 231-44.

12. Boudreau J.E., Bonehill A., Thielemans K., Wan Y. Engineering dendritic cells to enhance cancer immunotherapy. Mol. Ther. 2011; 19 (5): 841-53.

13. Colomb M.P., Trinchieri G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2002; 13 (2): 155-68.

14. Yang Y., Huang C.T., HuangX., PardollD.M. Persistent Toll-like receptor signals are required for reversal of regulatory T cell-mediated CD8 tolerance. Nature Immunol . 2004; 5 (5): 508 -15.

15. Jakushenko E.V., Lopatnikova Ju.A., Sennikov S.V Interleukin-18 and its role in the immune response. Medicinskaja immunologija. 2005; 7 (4): 355-64 (in Russian).

16. Iinuma H., Okinaga K., Fukushima R., Inaba T., Iwasaki K., Oki-naga A. et al. Superior protective and therapeutic effects of IL-12 and IL-18 gene-transduced dendritic neuroblastoma fusion cells on liver metastasis of murine neuroblastoma. J. Immunol. 2006; 176 (6): 3461-9.

17. Voskoboinik I., Dunstone M.A., Baran K., Whisstock J.C., Trapani J.A. Perforin: structure, function, and role in human immu-nopathology. Immunol. Rev. 2010; 235 (1): 35-54.

18. Zhou F. Perforin: more than just a pore-forming protein. Int. Rev. Immunol. 2010; 29 (1): 56-76.

Поступила 15.03.13

ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ

УДК 616.36-002.2-022-053.2:575.174.015.3

С.В. Романова, Т.А. Видманова, Е.А. Жукова, И.В. Маянская, Н.И. Толкачева,

Е.В. Ермолина, Т.А. Тимченко

роль генетического полиморфизма tlr3 при хронических вирусных гепатитах в и с У детей

ФГБУ Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Минздрава России, 603950, г Нижний Новгород, Россия

В статье представлены результаты исследования взаимосвязи полиморфизма гена TLR3 с особенностями клинического течения хронических вирусных гепатитов В (ХгВ) и С (ХгС) у 43 детей в возрасте от 6 до 17 лет. Выявление полиморфизма гена TLR3 Phe 412 Leu проводили методом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции, детекцию продуктов амплификации осуществляли с помощью горизонтального электрофореза. Замена Phe на Leu в положении 412 гена TLR3 у детей с ХгВ и ХгС была ассоциирована со снижением эффективности адаптивного иммунитета в виде уменьшения численности СD3-лимфоцитов (р = 0,037), гиперпродукцией интерлейкина (IL)-ip и IL-6 и иммуноглобулинов IgG (р = 0,025) и IgA (р = 0,011) на фоне низкого уровня виремии НВV и 4CV (р = 0,034), что может способствовать длительному торпидному течению заболевания с отсутствием элиминации возбудителя и активацией аутоагрессивных реакций. Кроме того, гетерозиготы и патологические гомозиготы по данному полиморфизму характеризовались достоверно более частыми гематологическими осложнениями при проведении им противовирусной терапии.

Ключевые слова: полиморфизм генов, толл-подобные рецепторы, хронические вирусные гепатиты, дети

Романова Светлана Владимировна (Romanova Svetlana Vladimirovna), е-mail: [email protected]

- 330 -