CC BY
1
БИОТЕХНОЛОГИЯ (В ТОМ ЧИСЛЕ БИОНАНОТЕХНОЛОГИИ)
DOI - 10.32743/UniChem.2024.123.9.18131
СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ МИКРОБАМИ, СИНТЕЗИРУЮЩИМИ МЕЛАНИН
Разикова Маликахон
докторант,
Ташкентского государственного технического университета
имени Ислама Каримова, Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: razikova.malikaxon@gmail.com
Сайидхонов Тойирхон
докторант,
Самаркандского государственного университета имени Шарафа Рашидова, Республика Узбекистан, г. Самарканд.
E-mail: s.toyirxon@gmail.com
Кучкарова Дилафруз
доц. кафедры
технология гидротехнического и геотехнического проектирования, Ташкентского архитектурно-строительного университета, Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: dkuchkarova1975@mail.ru
Хужамшукуров Нортожи
профессор
Ташкентского химико-технологического института,
зав. лабораторией Научно-производственного центра по выращиванию и переработке лекарственных растений, Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: nkhujamshukurov@mail. ru
STIMULATION OF PLANT GROWTH BY MICROBES SYNTHESIZING MELANIN
Malikaxon Razikova
doctoral student,
Tashkent State Technical University named after Islam Karimov,
Republic of Uzbekistan, Tashkent.
Toyirkhon Sayidkhonov
doctoral student,
Samarkand State University named after Sharaf Rashidov, Republic of Uzbekistan, Samarkand.
Dilafruz Kuchkarova
Associate professor,
Department of Hydraulic and Geotechnical Design Technology, Tashkent University of Architecture and Civil Engineering, Republic of Uzbekistan, Tashkent
Библиографическое описание: СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ МИКРОБАМИ, СИНТЕЗИРУЮЩИМИ МЕЛАНИН // Universum: химия и биология : электрон. научн. журн. Разикова М. [и др.]. 2024. 9(123). URL: https://7universum.com/ru/nature/archive/item/18131
• 7universum.com
J A UNIVERSUM:
№ 9 (123)_химия и биология_сентябрь. 2024 г.
Nortoji Khujamshukurov
professor
Tashkent Chemical-Technological Institute, head of the Laboratory Scientific and Production Center for the cultivation and processing of medicinal plants, Republic of Uzbekistan, Tashkent
АННОТАЦИЯ
В данной работе изучили влияние биопрепарата нового поколения (btmstr-биопрепарат), созданного на основе метаболитов гриба Trichoderma harzianum и бактерии Bacillus thuringiensis, на урожайность растения маша. По результатам btmstr-биопрепарат, приготовленный из культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum sp.76, синтезирующего ИСК а также из мутантного штамма бактерии Bacillus thuringiensis var.thuringiensis синтезирующего меланин, показал возможность получения урожая на 77,4% больше, чем контрольный вариант (биопрепарат Btnms), или на 61,4% больше по сравнению с эталонным вариантом. В ходе исследований было установлено, что в производственных условиях на растении маш возникают поражения различными тлей, усачами, кандалой, травяной плодожоркой, листоедами и грибами вызывающими фузариоз, а также микробиологическими объектами вызывающими бактериальную пятнистость. Поэтому данный биопрепарат рекомендован к применению для повышения урожайности сельскохозяйственных растений и борьбы с различными болезнями и вредителями.
ABSTRACT
In this work, we studied the effect of a new generation biopreparation (btmstr-biopreparation), created on the basis of metabolites of the fungus Trichoderma harzianum and the bacterium Bacillus thuringiensis, on the yield of mung bean plants. According to the results, the btmstr biopreparation, prepared from the culture fluid of the Trichoderma harzianum sp.76 strain synthesizing ISC, as well as from the mutant strain of the Bacillus thuringiensis var.thuringiensis bacterium synthesizing melanin, showed the possibility of obtaining a yield 77.4% greater than the control variant (biopreparation Btnms), or 61.4% greater compared to the reference variant. During the research it was established that in production conditions the Mung bean plant is affected by various aphids, longhorn beetles, burdock, codling moth, leaf beetles and fungi causing fusarium, as well as microbiological objects causing bacterial spotting. Therefore, this biological product is recommended for use to increase the yield of agricultural plants and combat various diseases and pests.
Ключевые слова. Bacillus thuringiensis, Trichoderma harzianum, биостимулятор, меланин, индол-уксусная кислота.
Keywords: Bacillus thuringiensis, Trichoderma harzianum, biostimulant, melanin, indole-acetic acid.
Введение. При выращивании сельскохозяйственной продукции в нашей стране в результате различных насекомых-вредителей и микробиологических заболеваний теряется 20-30% урожайности. Практические опыты показали, что от 10% до 50% урожая сельскохозяйственных растений теряется в результате развития некоторых крайне вредных микроорганизмов. Практические исследования показывают, что урожайность сельскохозяйственных культур -достигается за счет увеличения объемов внесения минеральных удобрений и химических препаратов, что, в свою очередь, приводит к резкому повышению уровня загрязнения окружающей среды.
В настоящее время основное внимание ученых уделяется созданию экологически чистых, контролирующих рост растений - стимуляторов биотехнологическим путем и их широкому внедрению в практику [1, 4].
Основной целью данной исследовательской работы является изучение влияния биопрепарата нового поколения (биопрепарат BtmsTr), созданного на базе Научной лаборатории кафедры "биотехнология" ТХТИ с использованием метаболитов грибка Trichoderma harzianum и бактерии Bacillus thuringiensis, на урожайность растения маша.
Гриб Trichoderma широко распространен в природе и отмечен как микробиологический объект, легко отделяемый в чистом виде, с очень быстрым образованием биомассы, а также с высоким уровнем биологической активности по сравнению с фитопато-генными грибами без ущерба для растения [7]. Этот гриб получил особое признание ученых как идеальный биологический объект для контроля роста и развития фитопатогенных грибов. Следовательно, предполагается что биопрепарат -btmstr, разработанный как биопрепарат нового поколения, проявляет биологическую активность против фитопатогенных микроорганизмов, обнаруженных в растении маша, поскольку он содержит культуральную жидкость гриба Trichoderma.
Кроме того, поскольку 50% биопрепарата составляет культуральная жидкость мутантного штамма бактерии Bacillus thuringiesis, синтезирующей меланин, тот факт, что в этом биопрепарате, помимо его свойства положительно влиять на рост и развитие растений, также хранятся Спорово-кристаллические токсины, которые обладают инсектицидной активностью против некоторых вредных насекомых, обнаруженных в них, указывает на то, что они обладают как минимум двумя сферами действия [13, 16]. Также, как часто отмечается
в научных источниках, наличие у штаммов энто-мопатогенных бактерий Bacillus thuringiesis активности против различных грибковых и бактериальных заболеваний растений с противогрибковым и антибактериальным действием также может быть причиной признания этой бактериальной жидкости одним из многообещающих агентов [2, 3, 5, 9, 12].
Целью исследования является определение влияния биопрепаратов нового поколения, созданных на основе метаболитов Trichoderma harzianum и бактерий Bacillus thuringiensis, на урожайность растений маша.
Материалы и методы. Использованы Bacillus thuringiensis var, thuringiensis-M 1th [17] и Bacillus thuringiensis var. Thuringiensis мутантные штаммы -btms, а также штамм sp.76 Trichoderma harzianum хранящиеся в коллекции Ташкентского химико технологического института, научной лаборатории кафедры "Биотехнология" Trichoderma harzianum sp. штамм 76 был выращен на питательной среде Мендельса с изменениями, а штамм бактерии Bacillus thuringiensis был выращен на нестандартной питательной среде, рекомендованной для производства [10].
При приготовлении биопрепарата нового состава проводилась работа по следующей схеме:
1- Btnms - Bacillus thuringiensis var..thuringiensis -M1th - штамм, не синтезирующий меланин (культивировался 72 часа, необработанный, принят в качестве контрольного варианта);
2-Btms-Bacillus thuringiensis var.thuringiensis-культуральная жидкость мутантного штамма, синтезирующего меланин btms (культивируется в течение 72 часов, принимается в качестве шаблонного варианта по сравнению с биопрепаратом btmstr);
3- Btmstr -культуральная жидкость штамма Trichoderma harzianum sp.76, синтезирующего ИСК а также мутантного штамма бактерии Bacillus thuringiensis var.thuringiensis, синтезирующего меланин 76 (культивируется от 72 часов, соотношение 1:1).
Опыты по внедрению в производство проводились на примере растения Маш, посаженного в качестве второй культуры на территории хозяйства "Шаббода шамоли" Бахт СИУ, Зарбдорский район, Джизакская область.
Для экспериментов были отобраны участки общей площадью 6 га. Культурные жидкости вводили путем замачивания семян в течение 4 часов перед посевом маша. Также после прорастания семян, их обрабатывали листовым опрыскиванием с помощью дождевального трактора ОВХ-600 из расчета 200 л на гектар при наличии двух листьев. При посеве маша использовала трактор-сеялку, который использовался при посеве пшеницы.
Результаты и обсуждение. Результаты, полученные на основе биопрепарата btnms (не синтезирующего меланин), отражены в таблице 1. Под действием биопрепарата btnms (культуральная жидкость) среднее количество листьев растения Маш составляет 52. Видно, что эти листья имеют в среднем 5,0 см в ширину и в среднем 6,0 см в длину. Длина стебля составляла в среднем 11,1 см, а длина образующихся шипов-в среднем 7,9 см. Установлено, что количество колосьев на одном растении соответствовало 33,7, а незрелых колосьев-9,8, то есть 29,0%. Замечено, что вес полученных зерен составляет 11,6 грамма.
Влияние биопрепарата btms (синтезирующего меланин)- на развитие растения Маша представлено в таблице 2. По результатам было отмечено, что количество листьев в среднем составляет 117,3, что на 65 (55,52%) больше, чем у биопрепарата btnms (который не синтезирует меланин). Также было обнаружено, что средняя ширина листьев составляет 6,54 см, а высота-7,55 см. Это показывает на то, что листья были на 1,54 см в ширину и на 1,55 см в высоту по сравнению с результатами, полученными на основе биопрепарата btnms (который не синтезирует меланин).
Таблица 1.
Влияние биопрепарата btnms на рост и развитие растения Маш
Источники измерения Варианты экспериментов (на примере 10 саженцев, взятых через каждые 10 метров в шахматном порядке) Средним
Btnms-1 Btnms-2 Btnms-3 Btnms-4 Btnms-5 Btnms-6 Btnms-7 Btnms-8 Btnms-9 Btnms-10
Количество листьев, шт. 42 54 30 81 54 59 69 39 37 46 52,1
Ширина листа, см 4,7 5,8 4,7 5,1 4,28 5,6 6,1 5,2 4 4,55 5,0
Высота листа, см 5,6 6,6 6,1 6,5 5,8 6,03 7,05 7,1 3,9 5,52 6,0
Длина корня, см 10,1 8,5 17 8,7 10,8 10,5 10,5 12,3 8,8 13,7 11,1
Длина шипа, см 6,9 8,8 7,39 7,6 9,6 8,7 6,8 7,8 7,57 7,7 7,9
Количество колосьев, шт. 16 28 38 55 44 39 22 38 19 38 33,7
Количество незрелых колосьев 0 9 16 10,8 19 13 9 21 9,8
Масса зерна, гр 8,07 14,05 8,17 10,8 12,19 15,02 15,02 12,02 7,99 12,96 11,6
Таблица 2.
Влияние биопрепарата btms на рост и развитие растения Маш
Источники измерения Варианты экспериментов (на примере 10 саженцев, взятых через каждые 10 метров в шахматном порядке) Средний
Btms-1-1 Btms-1-2 Btms-1-3 Btms-1-4 Btms-2-1 Btms-2-2 Btms-2-3 Btms-2-4
Количество листьев, штук 124 78 93 81 129 156 135 142,0 117,3
Ширина листа, см 5,6 6,6 6,8 6,5 6 6,8 6,8 7,20 6,54
Высота листа, см 7,5 7,6 8,1 8,3 7,4 7,5 6,8 7,20 7,55
Длина корня, см 11,1 8,2 12,5 13,2 21,7 33,6 19,82 22,45 17,82
Длина шипа, см 8,3 10,5 9,1 10,5 10,2 7,7 12,5 10,80 9,95
Количество колосьев, шт. 51 46 70 55 63 106 76 96,00 70,38
Количество незрелых колосьев 8 33 17 17 27 12 14 18 18,25
Масса зерна, гр 18,35 8,02 20,26 19,21 10,12 35,76 18,9 27,8 19,80
НСР-0,5
Кроме того, было обнаружено, что количество шипов в биопрепарате Btms составляет 70,38, что на 36,6 больше, чем в биопрепарате Btnms, а длина шипов составляет 2,05 см. Эти показатели биопрепарата -Btms оказывают огромное влияние на урожайность мошки.
В экспериментах установлено, что масса зерна под действием биопрепарата Btms на 8,2 г больше, чем у биопрепарата Btnms. Эта небольшая разница может быть объяснена количеством незрелых шипов в обоих вариантах. Например, в биопрепарате btnms среднее количество незрелых шипов составляло 9,8,
а в биопрепарате btms - 18,25. На основании этого показателя можно дать высокую оценку биологической эффективности биопрепарата Btms . Есть Bacillus thuringiensis.thuringiensis-это культуральная жидкость мутантного штамма, синтезирующего меланин btms, и sp гриба Trichoderma, синтезирующего ISK.
Результаты, полученные на основе btmstr-биопрепарата, приготовленного из культуральных жидкостей штамма 76 в соотношении 1:1, отражены в таблице 3.
Таблица 3.
Влияние биопрепарата BtmsTr на рост и развитие растения Маш
Источники измерения Варианты эксперимента (на примере 10 саженцев, взятых через каждые 10 метров в шахматном порядке) Средний
BtmsTr-1 BtmsTr-2 BtmsTr-3 BtmsTr-4
Количество листьев, штук 152 168 132 154 151,5
Ширина листа, см 7,6 7,1 7,8 7 7,4
Высота листа, см 8,1 7,5 8,8 9,7 8,5
Длина корня, см 26,3 20,1 22,3 19,8 22,1
Длина шипа, см 12,9 11,1 12,9 10,3 11,8
Количество колосьев, шт. 164 97 133 69 115,8
Количество незрелых колосьев 28 17 39 34 29,5
Масса зерна, гр 80,1 45,1 50,3 30,25 51,4
НСР-0,5
По полученным результатам было отмечено, что количество листьев растения Маш, обработанного биопрепаратом BtmsTr, составило в среднем 151,5, то есть на 65,6% (99,4 штуки) больше, чем у биопрепарата Btnms, и на 22,5% (34,2 штуки)
больше, чем у биопрепарата Btms. Также установлено, что средняя ширина листьев составляет 8,0 см, а высота-9,0 см. Это показало, что по сравнению с результатами, полученными на основе биопрепарата Btnms, листья были на 2,1 см шире, а высота листьев
на 2,5 см больше. По этим же показателям видно, что ширина листа на 0,86 см, а высота листа на 0,95 см больше, чем у биопрепарата Btms.
При этом количество спайков у биопрепарата BtmsTr составляет 115,8, то есть на 82,1 больше, чем у биопрепарата Btnms, и на 45,42 больше, чем у биопрепарата Btms. Было замечено, что у растений, обработанных биопрепаратом BtmsTr, средняя длина шипов составляла 11,8 см, что на 3,9 см длиннее, чем у биопрепарата Btnms, и на 1,85 см длиннее, чем у биопрепарата Btms. Эти показатели, подобные приведенным выше, безусловно, оказывают свое влияние на урожайность растения.
Анализируя данные, представленные в таблицах 1-3, можно увидеть, что в растительных вариантах, обработанных биопрепаратом BtmsTr, средний вес зерна составлял 51,4 грамма, что на 39,8 грамма больше, чем у биопрепарата Btnms, и на 31,6 грамма больше, чем у биопрепарата Btms. Если проанализировать количество незрелых шипов, можно увидеть, что варианты растений, обработанные биопрепаратом BtmsTr, имели 29,5 незрелых шипов, в то время как в биопрепарате Btnms они составляли 9,8, а в биопрепарате Btms - 18,25.
Поскольку количество и вес незрелых колосьев не измерялись в ходе исследований, теоретически, если считать зерно незрелых колосьев, можно признать, что даже по этому показателю биопрепарат BtmsTr оказывает положительное влияние на урожайность Маша.
Основываясь на этих экспериментах btmstr-биопрепарат, приготовленный из культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum sp.76, синтезирующего ИСК а также из мутантного штамма бактерии Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, синтезирующего меланин, показал возможность получения урожая на 77,4% больше, чем контрольный вариант (биопрепарат Btnms), или на 61,4% больше по сравнению с эталонным вариантом.
При сравнении этих данных, полученных на основе производственных экспериментов, с данными из научных источников, опубликованных на международном уровне, можно увидеть, что они соответствуют результатам, признанным несколькими учеными [6, 8, 15, 11, 14].
Эти полученные результаты показали, что результаты значительно отличались от результатов, полученных на фермерском хозяйстве "Джурабек", расположенной в территории Бахт СИУ, Зарбдорского района. В частности, в исследованиях, проведенных на ферме" Джурабек " по вышеуказанной схеме, были отмечены следующие результаты: Bacillus
thuringiensis \аг.мутантный штамм бактерии thuringiensis, синтезирующей меланин, а также SP гриба Trichoderma, синтезирующего ISK.
Было отмечено, что биопрепарат btmstr, приготовленный из культурных жидкостей штамма 76 в соотношении 1:1, дает на 82,0% больше урожайности, чем вариант контроля урожайности растений Mosh (биопрепарат btnms), или на 60,4% больше, чем вариант шаблона. Было отмечено, что исследования по одной и той же схеме, проведенные в двух регионах, показали различия в урожайности биопрепарата BtmsTr по сравнению с контрольным вариантом (биопрепарат Btnms) на 4.6% или 1.0% по сравнению с вариантом шаблона.
Учитывая, что полученные результаты как теоретически, так и практически повторяют друг друга, BtmsTr-биопрепарата, приготовленного из культуральных жидкостей штамма 76 гриба Trichoderma, синтезирующего ИСК а также меланин-синтезирующего мутантного штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, в соотношении 1:1, является экологически чистым, проявляет свойства контроля роста растений, позволяет признать его биопрепаратом с низкой стоимостью и удобством использования на практике.
Заключение. Btmstr-биопрепарат, приготовленный из культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum sp.76, синтезирующего ИСК а также из му-тантного штамма Btms бактерии Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, синтезирующего меланин, дает возможность получения урожая на 77,4% больше, чем контрольный вариант (биопрепарат Btnms), или на 61,4% больше по сравнению с эталонным вариантом (биопрепарат Btms). Поэтому мы рекомендуем использовать этот биопрепарат для повышения урожайности сельскохозяйственных растений и борьбы с различными болезнями и вредителями.
В ходе исследований было установлено, что в производственных условиях на растении Маш возникают поражения различными тлей, усачами, кандалой, травяной плодожоркой, листоедами и грибами, вызывающими фузариоз, а также микробиологическими объектами, вызывающими бактериальную пятнистость. Обработку микробиологическим биопрепаратом BtmsTr следует проводить также в тот момент, когда на растения начинают нападать насекомые-вредители. Мы рекомендуем, что это еще больше увеличит доступность BtmsTr-микробиологического биопрепарата в сельскохозяйственной практике.
Список литературы:
1. Abdel-Razek A.S., Talkhanb F.N., Marwa M.Azzamb. 2013. Efficacy of UV radiation on Bacillus thuringiensis mutants against Lepidopterous Insects. International Journal of Development, Vol.2, No.(1) (2013): 113-126.
2. Adounigna Kassogué, Amadou Hamadoun Dicko, Diakaridia Traoré, Rokiatou Fané, Fernando Hercos Valicente and Amadou Hamadoun Babana. 2016. Bacillus thuringiensis Strains Isolated from Agricultural Soils in Mali Tested for Their Potentiality on Plant Growth Promoting Traits. British Microbiology Research Journal 14(3):1-7.
UNIVERSUM:
химия И биология
3. Armada E, Probanza A, Roldán A, Azcón R. 2015. Native plant growth promoting bacteria Bacillus thuringiensis and mixed or individual mycorrhizal species improved drought tolerance and oxidative metabolism in Lavandula dentata plants. J. Plant. Physiol. 2015;192:1-12.
4. Avetisyan S.V., Hovsepyan A.S., Aghajanyan A.E., Azaryan K.G., Petrosyan T.R., Saghyan A.S. Water-soluble bacterial melanin: obtaining, biological activity, application perspectives // 2nd International Scientific Conference of Young Researchers "Contribution of the young generation in the development of biotechnology" Dedicated to the 70 th Anniversary of the National Academy of Sciences of Armenia, Yerevan, October 1-4, 2013, p. 48.
5. Barboza-Corona JE, Contreras JC, Velázquez-Robledo R, Bautista-Justo M, Gómez-Ramírez M, Cruz-Camarillo R, Ibarra JE. 1999. Selection of chitinolytic strains of Bacillus thuringiensis. Biotechnol Lett 21:1125-9.
6. Coyne V.E., Al-Harthi L. 1992. Induction of melanin biosysthesis in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 58,
7. Grondona I., Hermosa R., Tejeda M., Gomis MD., Mateos PF., Bridge PD., Monte E. Garcia Acha I. 1997. Physiological and biochemical characterization of Thrichoderma harzianum, a biological control agent against soilborne fungal plant pathogens. Appl Environ Microbiol 63(8):3189-98.
8. Hoti, S.L., Balaraman, K. 1993. Formation of melanin pigment by a mutant of Bacillus thuringiensis H-14. J. Gen. Microbiol. 139, 2365-2369.
9. Kassogué A,Mai'ga K, Traoré D, Dicko AH, Fané R, Guissou T, Faradji FA, Valicente FH, Babana AH. 2015. Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis (Ernst Berliner) strains indigenous to agricultural soils of Mali. African Journal of Agricultural Research. 2015;10(28):2748-2755.
10. Khujamshukurov N., Yusupov T., Khalilov I., Guzalova A., Muradov M. And Davranov K. 2001. The Insektisidial Activity of Bacillus thuringiensis Cells. J. Applied Biochemistry and Microbiology, V.37, 6:596-598.
11. Liu F, Yang W, Ruan L, Sun M. 2013. A Bacillus thuringiensis host strain with high melanin production for preparation of light-stable biopesticides. Ann Microbiol 63: 1131-1135.
12. Raymond B., Johnston P.R., Nielsen-LeRoux C., Lereclus D., Crickmore N. 2010. Bacillus thuringiensis: An impotent pathogen? Trends Microbiol. 18, 189-194.
13. Reyes-Ramírez A., Escudero-Abarca B.I., Aguilar-Uscanga G., Hayward-Jones P.M., Eleazar Barboza-Coron J. 2004. Antifungal Activity of Bacillus thuringiensis Chitinase and Its Potential for the Biocontrol of Phytopathogenic Fungi in Soybean Seeds. Journal of food science. Vol.69, Nr.5. Pp.131-134.
14. Sansinenea E., Ortiz A. 2015. Melanin: a photoprotection for Bacillus thuringiensis based biopesticides. Biotechnol Lett. V. 37:483-490.
15. van de Sande W.W., de Kat J., Coppens J., a Ahmed A.O., Fahal A., Verbrugh H., and van Belkum A. 2007. Melanin biosynthesis in Madurella mycetomatis and its effect on susceptibility to itraconazole and ketoconazole. Microbes Infect., 9, 1114-1123.
16. Коробов Я.А., Каменек Л.К. 2010. Ростостимулирующее действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на Capsicum annuum. Материалы III-й Международной научно-практической конференции молодых учёных "Молодёжь и наука XXI века". T.III. "Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии", Ульяновск, 2010. -с. 35-37.
17. Хужамшукуров Н.А., Халилов И.М., Гузалова А.Г., Мурадов М.М., Троицкая Е.Н., Юсупов Т., Давранов К.Д. 2006. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var.thuringiensis 45Mnh №СКВ-349 для производства инсектицидного препарата против насекомых вредителей». Патент РУз. №IAP 03054. 15.05.2006 г.
2861-2865.
