CC BY
39
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ СТИМУЛЯЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ... 49
УДК 615.277.3.015.46:616-092.9
Э.Г. Щербакова1, В.М. Бухман2, Е.Б. Исакова3, Н.Н. Липатов4
СТИМУЛЯЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА СОЧЕТАНИЕМ НИЗКОДОЗОВОГО ЦИКЛОФОСФАМИДА
С ПЕРОРАЛЬНЫМ ВВЕДЕНИЕМ ЛИЗОЦИМА И НУКЛЕИНАТА НАТРИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
1 Российская медицинская академия последипломного образования, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
3НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва 4НИИ Детского Питания РАСХН, МО
Контактная информация:
Бухман Владимир Михайлович, заведующий лабораторией фармакологии и токсикологии адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)-324-22-44; моб. +7(916)-410-20-42 e-mail: bukhman@mail. ru
Статья поступила: 26.06.2009, принята к печати 20.10.2009.
Резюме
Длительное, на протяжении 6 нед., введение через рот комбинации нуклеината натрия (низкомолекулярная РНК из пекарских дрожжей) с лизоцимом белка куриных яиц значительно усиливает резистентность обработанных низкодозовым циклофосфамидом (100 мг/кг, в/бр, однократно) мышей-гибридов (C57Bl/6J*DBA2)F1 к трансплантатам Т-клеточной лимфомы EL4 (полусингенная система). Более пожилые, 4-месячные мыши, проявили большую резистентность и лучше отвечали на лечение по сравнению с более молодыми мышами 2-месячного возраста.
Ключевые слова: низкодозовый циклофосфамид, лизоцим белка куриных яиц, нуклеинат натрия, противоопухолевая резистентность, мыши.
E.G. Shcherbakova1, V.M. Bukhman2, E.B. Isakova3, N.N. Lipatov4 STIMULATION OF THE HOST ANTITUMOR RESISTANCE BY COMBINATION OF LOW-DOSE CYCLOPHOSPFAMIDE WITH LYSOZYME AND NUCLEONATE NATRY IN EXPERIMENTAL MODEL
'Russian Medical Academy of Prolonged Education, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
3Gause Institute of New Antibiotic, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
4Institute of Baby Feeding, Russian Academy of Agricultural Sciences, Moscow Region
Abstract
Long-continued, throughout 6 weeks, oral administration of a combination sodium nucleinate (low-molecular RNA from baking yeast) with lysozyme of the chicken egg white considerably intensifies resistance of mice-hybrids (C57Bl/6J DBA2)Fl to transplants T-cell lymphoma EL3 (semisyngeneic system) treated with low dose of cyclophosphamide (single injection of 100 mg/kg, ip). More elderly, 3 monthly mice, have shown the increased resistance and they better respond to the treatment in comparison with younger mice of 2 monthly age.
Key words: low dose of cyclophosphamide, lysozyme of the chicken egg white, sodium nucleinate, antitumor resistance, mice.
Введение
Одним из актуальных направлений улучшения результатов лечения онкологических пациентов является иммунотерапия. Среди средств иммунотерапии существенное место принадлежит биологически активным веществам, проявляющим иммуномодулирующую активность.
В частности перспективным представляется разработка методов усиления противоопухолевой резистентности организма путем комбинирования препаратов, угнетающих супрессорные механизмы, с препаратами, активирующими эффекторные звенья противоопухолевого иммунитета. Ниже мы приводим результаты опытов, демонстрирующих возможность повышения противоопухолевой резистентности организма с помощью сочетания антисупрессорной обработки организма мышей циклофосфамидом с длительным введением лизоцима белка куриных яиц и нуклеината натрия (натриевая соль низкомолекулярной РНК из пекарских дрожжей).
Материалы и методы
Животные
Самцы мышей линии С57ВЖТ (В6) и гибридов (С57ВШхБВА/2)Р1 (В6Б2Р1), разводки питомника РАМН «Крюково». Мыши содержались в клетках по 5-10 голов, получали стандартную диету и имели свободный доступ к воде.
Опухоль
В работе использован штамм перевиваемой Т-клеточной лимфомы БЬ4, который был получен из Т-клеточной лимфомы, индуцированной ДМБА у мыши линии В6 в 1947 г [6]. Штамм хранится в азотном банке при t = -196 °С. После размораживания штамм поддерживаели в сингенных условиях, в асцитной форме серийными, каждые 10 суток, внутрибрюшин-ными (в/бр) пассажами асцитных опухолевых клеток (по 0,2 мл разведенного в 100 раз асцита) на мышах чистой линии В6. В опытах мышам В6Б2Р1 вводили по 5* 104 асцитных опухолевых клеток в/бр в день 0.
50 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ СТИМУЛЯЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ...
Препараты
Для введения животным использовали коммерческие препараты: лизоцим гидрохлорид (ЛИЗ) фирмы «Ве1оуо» (Бельгия), нуклеинат натрия (НИ) фирмы «БИОСИНТЕЗ, ОАО» (Россия) и циклофос-фан-ЛЭИС (циклофосфамид, ЦФ) фирмы «ЛЭИС-ФАРМ» (Россия). Препараты растворяли и разводили в воде и/или физиологическом растворе №С1 непосредственно перед введением. Внутрижелудочное введение ЛИЗ и ИИ проводили через рот с помощью приготовленного из инъекционной иглы изогнутого зонда. Пути введения, дозы, схемы, режимы в конкретных опытах даны в разделе «Результаты».
Параметры оценки эффекта
Противоопухолевый эффект оценивали по принятым в экспериментальной онкологии параметрам - выживаемости, а также доле вылеченных мышей и изменению массы тела. Последний параметр прямо коррелирует с накоплением асцита, хотя на нем отражаются и проявления взаимодействия опухоли и препаратов с организмом.
УПЖ % =
(СПЖо - СПЖк) х 100
, где
СПЖк
УПЖ - увеличение продолжительности жизни, СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни в днях соответственно в опыте и контроле (мыши, не получавшие препараты - контроль роста опухоли). День прививки опухолевых клеток принят за 0.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ. Достоверность различий выживаемости животных определяли по И-критерию Вилкоксона, различий средних величин - по 1-критерию Стьюдента, а достоверность различий в долях выживших животных - по критерию х2. За достоверные принимали различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Биологическая активность биотерапевтиче-ской комбинации ЛИЗ+НН была оценена в двух опытах на разработанной нами ранее чувствительной модели [1; 4]. Особенностью модели является сочетание двух экспериментальных приемов для облегчения проявления испытуемыми препаратами противоопухолевой активности:
1. Использован феномен гибридной резистентности: лимфома БЬ4 мышей линии В6 привита гибридам В6Б2Б1 [7],
2. Проведена антисупрессорная обработка организма мышей, привитых опухолью, однократным введением ЦФ в относительно низкой дозе [5].
В проведенных экспериментах резистентность организма мышей оказалась неодинаковой, что, возможно, связано с различием в возрасте животных. В первом опыте были использованы мыши в возрасте около 2,5 мес со средней массой тела около 20 г (молодые мыши). Во втором опыте были использованы мыши в возрасте около 4 мес. со средней массой тела около 27 г (пожилые мыши).
Результаты первого опыта представлены в табл. 1 и на рис. 1. О противоопухолевой активности сравниваемых препаратов судили по торможению нарастания асцита и выживаемости. Влияние на накопление асцита оценено по параметру изменения массы тела к 18 суткам опыта.
В этом опыте были использованы интенсивно растущие животные - масса тела интактных мышей выросла к указанному сроку в среднем на 19 % по отношению к начальной массе тела. Масса же тела нелеченых мышей (КРО) выросла, за счет накопления асцита, значительно больше - на 28 %. Однократная обработка мышей ЦФ привела к торможению накопления асцита. Введение же мышам, обработанным ЦФ, НН, одного или в комбинации с ЛИЗ, приводило не только к отсрочке накопления асцита, но и ослаблению прироста массы тела. Сама обработка ЦФ привела к значительному увеличению продолжительности жизни подопытных мышей. Введение мышам, обработанным ЦФ, НН одного и особенно в комбинации с ЛИЗ приводило к еще большему увеличению выживаемости. Причем в случае использования комбинации ЦФ+ЛИЗ+НН у 2 мышей опухоли не развились. Однако в группах мышей, получивших один ЦФ или ЛИЗ после обработки мышей ЦФ, по одной мыши пало в результате развития летальной токсичности.
Результаты второго опыта представлены в табл. 2 и на рис. 2. В этом опыте нелеченные мыши проявили определенную резистентность к трансплантату: ТРО у мышей, не получавших препараты, был медленнее, чем в первом опыте, а прививаемость составила 92 %. Исследуемые препараты усилили резистентность мышей к трансплантируемой опухоли: у животных, получивших ЦФ, ЦФ+ЛИЗ и ЦФ+ЛИЗ+ НН, опухоль не развилась у 45 %; 27 % и 83 % мышей, соответственно. Влияние на накопление асцита оценено по параметру изменения массы тела к 20 суткам опыта. В этом опыте были использованы пожилые животные - масса тела интактных мышей выросла в среднем на 6 % по отношению к начальной массе тела. Масса же тела нелеченых мышей (КРО) выросла за счет накопления асцита значительно больше, на 19 %, прежде всего за счет накопления асцита. В опытных группах наблюдалось достоверное ингибирование накопления асцита. Однако в группе мышей, получивших комбинацию ЦФ+ЛИЗ, у 3 мышей наблюдалось сильное похудание, одна из них пала в результате развития летальной токсичности. Таким образом, в обоих опытах комбинация вводившихся длительно через рот ЛИЗ и НН значительно усилила резистентность получивших антисупрессорную обработку ЦФ мышей-гибридов В6Б2Р1 к трансплантатам опухоли БЬ4, происходящей от мышей родительской линии В6. Механизм этого эффекта требует специального изучения. Известно, что гибридная резистентность в примененной модельной системе определяется сочетанием врожденного и приобретенного иммунитета. Кроме того, ЦФ в использованном режиме наряду с опосредованным через иммунную систему действием проявляет и прямое угнетающее действие на опухоль. НН - известный модулятор реактивности организма [3]. Интересно отметить, что в последние годы пристально изучается биологическая активность низкомолекулярных двуспиральных интерферирующих РНК - специфических ингибиторов синтеза белков. В этой связи следует отметить, что в составе НН имеется близкая по свойствам фракция, проявляющая противоопухолевую активность [2].
Вывод
Обработка низкодозовым ЦФ в сочетании с длительным пероральным введением комбинации ли-зоцима белка куриных яиц с нуклеинатом натрия (натриевая соль низкомолекулярной РНК из пекарских дрожжей) сопровождается значительным увеличением резистентности мышей к опухолевым трансплантатам.
Таблица 1
Активность препаратов на молодых мышах с привитой опухолью
Группа п МТ 0-18, % СПЖ, сут Ранж, сут УПЖ, % Выл., % ЛГ, %
ИК 10 119и±2 - - - - -
КРО 10 128±3 24,8 24-29 - 0 -
ЦФ 10 117и±3 37,1 24-45 50 100 10
ЦФ+НН 10 103іис±3 40,0 17-60 61 100 10
ЦФ+ЛИЗ+НН 10 101іис±1 41,0 30-740 65 80 0
Использованы самцы мышей-гибридов Б6Б2Б1, 2,5-месячного возраста. Опухоль прививали введением по 5*104 асцитных клеток БЬ4 в/бр в д. 0. Начало лечения - д. 3; окончание - д. 41. ЦФ - 100 мг/кг, в/бр, в д. 3, однократно. ЛИЗ и НН - через рот. Разовые дозы: ЛИЗ - 100 мг/кг; НН - 125 мг/кг. п - количество мышей; СПЖ - средняя продолжительность жизни; УПЖ - увеличение продолжительности жизни мышей с привившейся опухолью; Выл. - «вылеченные» мыши, у которых лимфома не развилась к 90 суткам опыта; ЛГ - лекарственная гибель; ИК - интактный контроль; КРО - контроль роста опухоли; і, и, с - достоверное отличие от групп ИК, КРО и ЦФ, соответственно.
Таблица 2
Активность препаратов на пожилых мышах с привитой опухолью
Группа п МТ0-20, % СПЖ, сут Ранж, сут УПЖ, % Выл., % ЛГ, %
ИК 10 106и±1 - - - - -
КРО 13 119±3 31,7 25-52 - 8 -
ЦФ 11 101и±1 44,2 33-63 39 45 0
ЦФ+ЛИЗ 11 95и±5 38,0 33-43 20 27 9
ЦФ+ЛИЗ+НН 12 100и±1 52,0 50,54 64 83 0
В опыте использованы 4-месячные самцы мышей Б6Б2Б1. Начало лечения - день 4, окончание - день 43. Забой выживших животных на день 111. Остальное смотри в примечаниях к табл. 1.
Рис. 1. Активность препаратов на молодых мышах с привитой опухолью.
Рис. 2. Активность препаратов на пожилых мышах с привитой опухолью.
Литература
1. Бархоткина М.Ф., Пименов A.A., Черткова А.И. и др. Развитие противоопухолевой резистентности и Т-клеток иммунологической памяти при химиотерапии Т-клеточного лейкоза мышей // Иммунология. - 1985. - №2. - С. 30-4.
2. Захарян Р.А., Месропян Н.П., Мовсесян А.В. и др. Противоопухолевая активность Ca-двуспиральной РНК из нуклеината натрия // Эксп. Онкол. - 1985. - Т. 7, № 3. - С. 54-6.
3. Земсков А.М., Земсков В.М., Передерий В.Г. : Модулирующая функция дрожжевой РНК // ЖМЭИ. -1982. - № 9. - С. 9-13.
4. Черткова А.И., Бухман В.М., Сыркин A.Б. Потенцирование бластолизином противоопухолевого эффекта циклофосфана при T-клеточном лейкозе мышей // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 1984. - Т. 98, № 7. - С. 57-9.
5. Ben-Efraim S. Immunomodulating anticancer alkylating drugs: Targets and mechanisms of activity // Current Drug Targets. - 2001. - 2. - Р. 197-212.
6. Gorer P.A. Antibody response to tumor inoculation in mice with special reference to partial antibodyes // Cancer Res. - 1947. - 7(10). - Р. 634-41.
7. Kumar V., Luevano E., BennettM. Hybrid resistance to EL-4 lymphoma cells. I. Characterization of natural killer cells that lyse el-4 cells and their distinction from marrow-dependent natural killer cells // J. Exp. Med. - 1979. - 150. - P. 531-47.
