CC BY
157
Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов
Р.Ф. Масгутов 1 23, И.И. Салафутдинов 12, А.А. Богов 3, А.А. Трофимова 12,
И.Г. Ханнанова 1, Р.И. Муллин 1, Р.Р. Исламов 23, Ю.А. Челышев 2 3, А.А. Богов 1, А.А. Ризванов 1 23
1 ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ Республики Татарстан, Казань
2 ФГАО УВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань
3 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань
Stimulation of rat's sciatic nerve post-traumatic regeneration using plasmids expressing vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor
R.F. Masgutov123,I.I. Salafutdinov12, A.A. Bogov3, A.A. Trofimova 12,I.G. Khannanova 1, R.I. Mullin 1,
R.R. Islamov23, Yu.A. Chelyshev23, A.A. Bogov1, A.A. Rizvanov12'3
1 Republic Clinical Hospital, Kazan
2 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan
3 Kazan State Medical University, Kazan
Разработка эффективных методов лечения больных с повреждением периферических нервов является актуальной задачей биомедицины. «Золотым стандартом» в восстановлении целостности нервных проводников является аутонервная пластика, при которой дефект периферического нерва замещают с помощью аутогенной нервной вставки. Предложен способ стимулирования реваскуляризации и регенерации аутонервной вставки с помощью локальной инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2). Показано, что прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва, а также в саму аутонервную вставку, стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы и восстанавливает двигательную активность.
Ключевые слова: сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБОР), основной фактор роста фибробластов (РОР2), генная терапия, плазмида, аутологичная трансплантация, периферический нерв, аутонервная вставка.
The development of effective treatments for patients with peripheral nerve injury is an urgent task of biomedicine. «Gold» standard in restoring the integrity of nerve conduits is auto-nerve transplantation in which a peripheral nerve defect is corrected with autologous nerve graft. Here we propose a method for stimulating revascularization and regeneration of auto-nerve graft by a local injection of plasmid pBud-VEGF-FGF2, expressing vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (FGF2). It is shown that direct injection of plasmid pBud-VEGF-FGF2 in the proximal and distal segments of nerve, as well as in the auto-nerve graft, stimulates the regeneration of the rat's sciatic nerve and restores motor activity.
Key words: vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (FGF2), gene therapy, plasmid, autologous transplantation, peripheral nerve, auto-nerve graft.
Повреждения периферических нервов с наличием посттравматического дефекта являются актуальной проблемой медицины. Ежегодно в мире проводят более 2 млн реконструктивных операций с целью восстановления нервных стволов [1]. Несмотря на широкое применение различных подходов и методов лечения, остается проблема высокой степени инва-лидизации больных [2—3].
Перспективным направлением для стимуляции посттравматической регенерации поврежденных нервных проводников представляется использование нейротрофических и ангиогенных факторов. В качестве таких стимуляторов особый интерес представляют сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБОР) и основной фактор роста фибробластов (РОР2).
УБОР проявляет свойства типичного нейротро-фического фактора. Он поддерживает выживание чувствительных [4] и двигательных [5] нейронов. Вместе с тем, УБОР стимулирует пролиферацию астроцитов [6], нейральных стволовых [7] и ключевых для регенерации периферического нерва шван-
е-таП: [email protected]
новских клеток [4]. VEGF обладает выраженным стимулирующим влиянием на процесс неоваскуля-ризации, что важно для устранения эффекта посттравматической ишемии тканей.
Другой, не менее важный для нейрорегенерации ангиогенный и нейротрофический фактор — FGF2. На модели преодоления 10 мм диастаза седалищного нерва крысы при помощи кондуита из хитозана с гидрогелевым матриксом на основе гепарина-фибрина-фибронектина, содержащего FGF2, показано существенное превышение показателей регенерации по сравнению с контролем (PBS вместо гидрогеля c FGF2) и их приближение к модели аутонервной вставки [8].
Однако при непосредственной доставке нейротрофических факторов в область повреждения терапевтический эффект ограничен по времени из-за короткого периода жизни рекомбинантных белков в тканях in vivo. Для достижения устойчивого и пролонгированного действия терапевтических молекул представляется более целесообразным доставлять не рекомбинантные нейротрофические факторы, а
гены, кодирующие их биосинтез. Доставка в область повреждения терапевтических генов считается одним из перспективных направлений для стимуляции нейрорегенерации. Остается неясным, какие гены или их комбинаций наиболее эффективно стимулируют посттравматическую регенерацию нерва. Для решения этой задачи в данной работе выбрана комбинация генов vegf и fgf2, кодируемых ранее разработанной нами плазмидой pBud-VEGF-FGF2 [9].
Цель работы: выявить влияние прямой генной терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на посттрав-матическую регенерацию седалищного нерва крысы при замещении его дефекта с помощью аутонервной вставки.
Материал и методы
Двухкассетный экспрессионный плазмидный вектор pBud-VEGF165-FGF2 создан на основе плазмиды рBudCE4.1 (Invitrogen) субклонированием кДНК генов vegf (изоформа 165) и fgf2 под контролем промоторов EF-1 а и CMV соответственно [9]. Ранее нами было показано, что при трансфекции клеток человека различных типов плазмидой pBud-VEGF165-FGF2 происходит конститутивная и независимая экспрессия двух терапевтических генов vegf и fgf2 [9—10]. Плазмидную ДНК для введения подопытным животным выделяли из рекомбинантного штамма Escherichia coli с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit в соответствии с инструкциями производителя (QIAGEN).
В работе использовали белых беспородных крыс. У животных в левом седалищном нерве на уровне середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм, иссеченный фрагмент нерва тотчас подшивали в сформированный дефект. Через 7 сут. производили повторный доступ к нерву. Животным опытной группы вводили с помощью инъекции плазмиду pBud-VEGF-FGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва, отступая 1 мм от линии шва, а также в саму вставку, отступая 2,5 мм от линии шва; по 5 мкл в каждую точку (всего 45 мкг плазмидной ДНК в 15 мкл PBS). Животным контрольной группы в те же точки и в том же объеме вводили раствор фосфатного буфера (PBS). Начиная со вторых суток после второй операции, для оценки двигательной функции использовали метод стимуляционной электронейромиографии.
С помощью игольчатых электродов регистрировали суммарный потенциал икроножной мышцы, а именно порог возникновения моторного ответа, латентный период, длительность, амплитуду максимального моторного ответа, количество двигательных единиц крысы на стимуляцию седалищного нерва до операции, через 7 сут. после операции, через 28 и 56 сут. после введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2, а также у интактных животных. На 60 сут. после операции забирали 5 мм фрагмента периферического отрезка седалищного нерва дистальнее линии шва вставки, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, дофиксировали в 2% растворе четырех-окиси осмия и заливали в эпон-аралдит. На полутон-ких срезах, окрашенных толуидиновым синим, под световым микроскопом подсчитывали количество миелиновых волокон. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.
Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике [11].
Результаты и обсуждение
Начиная со 2-х сут. после операции, произведена оценка динамики восстановления двигательной функции икроножной мышцы, иннервируемой седалищным нервом. В таблице представлены данные амплитуды моторных ответов подопытной и контрольной групп животных в сравнении с группой интактных животных.
Исходя из полученных данных, лучшие результаты наблюдали в группе животных с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 — средние значения амплитуды максимального моторного ответа икроножной мышцы на 56 сут. составили 63% относительно интактной конечности, а в контрольной группе результат — 22%.
В работе C. Fu et al. (2007) при перерезке седалищного нерва крысы без формирования диастаза к 8 неделе после операции и одновременного однократного введения 50 мкг плазмидного вектора phVEGF165 суммарный потенциал икроножной мышцы возрастал по сравнению с контролем (введение физраствора вместо плазмиды) в среднем в 1,5 раза [12]. В нашем случае на том же сроке наблюдения и приблизительно при той же дозе вводимой
Амплитуда суммарного потенциала икроножной мышцы на электростимуляцию седалищного нерва
Сроки Интактная группа Контрольная группа (PBS) Группа с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2
До операции 45,23±3,2 46,15±3,9 46,15±3,9
7 сут. после операции 45,23±3,2 7,18±3,21 8,04±1,76
7 сут. после введения плазмиды 45,23±3,2 8,49±1,01 9,47±1,16
28 сут. после введения плазмиды 45,23±3,2 9,55±2,01 11,16±2,74
56 сут. после введения плазмиды 45,23±3,2 10,27±1,45 29,38±1,45*
Примечание: * — отмечены параметры статистически значимо отличающиеся от значений зарегистрированных у контрольной группы (значение р<0,05).
однократно плазмиды pBud-VEGF-FGF2 амплитуда моторных ответов икроножной мышцы увеличивалась почти в 3 раза. Учитывая наличие диастаза в наших экспериментах, т.е. существенно более т
сложные условия для регенерации нервных воло- g
кон, зарегистрированный нами результат по данному §
электрофизиологическому показателю превосходит з
результаты работы С. Fu et al., что может быть свя- °
зано с доставкой в область повреждения нерва одновременно двух терапевтических генов, экспрессирующих in vivo комбинацию нейротрофических и ангиогенных факторов. На модели диабетической нейропатии у крыс и кроликов через 4 нед. после прямого введения в мышцу плазмиды с рекомбинантными генами человека VEGF-1 (VEGF165) или VEGF-2 (VEGFC) по критериям неоваскуляризации и электро-физиологическим параметрам для нервных волокон большого и малого диаметра также был зарегистрирован устойчивый позитивный результат [13].
Через 60 сут. после операции во всех группах забирали проксимальный фрагмент периферического отрезка седалищного нерва для оценки количества регенерирующих миелиновых волокон. При эксплантации седалищного нерва крыс подопытной группы с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 была выявлена выраженная реваскуляризация аутонервной вставки (рис. 1). При гистологическом исследовании показано, что количество миелиновых волокон в дистальном отрезке седалищного нерва было на 98,4% (р<0,05) больше по сравнению с контрольной группой (введение PBS) (рис. 2).
Рис. 1. Аутонервная вставка седалищного нерва крысы через 60 сут. после операции (опытная группа животных) с признаками интенсивной неоваскуляризации. Черными стрелками показано место шва центрального отрезка со вставкой
Группы
Рис. 2. Количество регенерирующих миелиновых волокон в аутонервной вставке седалищного нерва крысы
В условиях генной терапии увеличение количества миелиновых волокон может быть результатом прямого поддерживающего влияния нейротрофических факторов на выживание и дифференцировку шванновских клеток, а также на процесс ремиели-низации аксонов.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2 стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы и восстанавливает двигательную активность конечности. При этом усиливается реваскуляриза-ция аутонервной вставки и, вероятно, активируется пролиферация шванновских клеток и экспрессия в них ряда стимуляторов нейрорегенерации, таких как нейротрофичекие факторы, молекулы адгезии, молекулы внеклеточного матрикса и др. Наблюдаемые нами эффекты улучшения показателей регенерации нерва могут быть результатом локальной сверхэкспрессии терапевтических генов и прямого влияния кодируемых ими нейротрофи-ческих и одновременно ангиогенных факторов на клетки-мишени в поврежденной ткани.
Благодарности
Работа частично финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований, государственным контрактом ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 16.512.11.2101, Министерством Здравоохранения Республики Татарстан. Работа частично выполнена на оборудовании Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) и научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского] федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Sharon I., Fishfeld C. Acute nerve injury. Med. J. 2002; 3(6): 69-75.
2. Шевелев И.Н., Вашин Н.Н., Лошаков В.А. Результаты интер-фасцикулярной аутотрансплантации в лечении травматических повреждений срединного и локтевого нервов. Вопросы нейрохирургии им. Бурденко. 1983; 5: 45-51.
3. Lee S.K., Wolfe S.W. Peripheral nerve injury and repair. J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2000; 8(4): 243-52.
4. Sondell M., Lundborg G., Kanje M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. J. Neurosci. 1999; 19(14): 5731-40.
5. Islamov R.R., Chintalgattu V., Pak E.S. et al. Induction of VEGF and its Flt-1 receptor after sciatic nerve crush injury. Neuroreport. 2004; 15(13): 2117-21.
6. Rosenstein J.M., Mani N., Silverman W.F. et al. Patterns of brain angiogenesis after vascular endothelial growth factor administration in vitro and in vivo. PNAS USA 1998; 95(12): 7086-91.
7. Sun J., Sha B., Zhou W. et al. VEGF-mediated angiogenesis stimulates neural stem cell proliferation and differentiation in the premature brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 394(1): 146-52.
8. Han H., Ao Q., Chen G. et al. A novel basic fibroblast growth factor delivery system fabricated with heparin-incorporated fibrin-fibronectin matrices for repairing rat sciatic nerve disruptions. Biotechnol. Lett. 2010; 32(4): 585-91.
9. Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Ялвач М.Э. и др. Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибро-бластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5(2): 62—7.
10. Rizvanov A.A., Guseva D.S., Salafutdinov I.I. et al. Genetically modified human umbilical cord blood cells expressing vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice. Exp. Biol. Med. 2011; 236(1): 9l—8.
11. Генин А.М., Ильин А.Е., Капланский А.С. и др. Биоэтиче-ские правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине. Авиакосмическая и экологическая медицина 2001; 4: 14-20.
12. Fu C., Hong G., Wang F. Favorable effect of local VEGF gene injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve. J. Huazhong. Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2007; 27(2): 186-9.
13. Schratzberger P., Walter D.H., Rittig K. et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. J. Clin. Invest. 2001; 107(9): 1083-92.
Поступила 03.07.2011
-Therakos
(ПСІ ЄЧЛ .СГЯ ВрФНС.ІПШН 1«П p-lhUginiipH. І l-l»UI й flH.ií.lJlípr Ч - tV Vk \TN І brr.ikii1-м.СШАі
'їкгрмиріьчрллмімІІ ф™г*|*срп гтрслстї P TWTT СзбоМ ■ИСГР.Т, ОСЦПАЯНІ^Й1 тіа
\ІІУІі_' І 4ЯІІІМ ЛСІІКІіфсрСШ II' tffhyffilllll .ІГПНі'іиіИЧ. ІіргМКіріІ І l'TI.MII üAfuAüTJllllUX (jíílílXCliChriMLLnUIOfKJM І R- ЬІСІЯЇС IUIi.'OfULK1IDfei І.
і1і]ш|іііі і Ь-Ччіии и ,|MáJÍJ. нищ А (.420 - *КШр ііи і
<М| ІЛ-Cl lL і І ) ІГІ -144 ■ ІС- Н І І п.
ЛоїСІІМ иііниніялічссип. «ГИЛІЧЧІ ШіШ_ лсрмвписі їгкїиі. І' нрїшіфе|хтшішх ин'-ллегаїїлн ■* Г-р Г(Нііеи і, ■ г.імспріїпіі-- щ»і|пічяітаШі
- .і ’ і -5 j ІП■,і . І II .'|'1І.І < її І,
■ LlCK'pi' ІСрЯІч.
* ГКІТрНП І.
* f4.-rr.l-, ! гі lilUW J¡4|'. чіЕІІірКІІіи: №1 ПНЯ ГКШН7
* ■, -U L-11 L .и:. з 111 l1 рснтпі IpJH'i . йм и М|-І її h ÚMÉnibJ ' І'І [ ІЛі
1'UiHHi-irllOf 11! «гісГгЧІФ:
ІЙгЮііягПй^сі. і ІН ипцрігКІр:
* і '.тора шиї oil eou расіїлиіиі. члсріи.
* íktl iimfiiiiL ра*:«и в*'..умінні itióoiiiu,
- »1,1 SbHitillr pü. II _i¡\ii:milí
* PbTiltK »ШЖІ№ i imtpú І* ІНч ЧуіІ КПІМ ЯІП н ияі y.liniii,
* Ніікгр ПІв ай І^СІІІІЯ І СПІЛОК.
* шигрсль киїрютп ибпр« її *иііцшш;ііііі іравк tiiiineiirv.
* taíiuiieiioc і ь її ішжиня іирииґі ріні і ¡ріли-ссі в ic'icnud ііроосдури
* при neufv.t4iHi«Pii wwmrmt'íbfi* ftщвіччвдгасж »«.‘wu чяпк фш.к-н
ГІрілімпн v рлСоїс гі *бс.і7 жимліім:
■ 5- Ь ■*-ili!V II.. .,і li. MiltAIIU£ a ¡I OIK^UIl.fiJ
* иііп, І |г, я: |ііш . 1111 =_і: 11.x п jia: «і і.ми і ü.ii ц-рнл :¡ і» ІЩінріяві і ь і iUiu.ni ч. І Ь
і:оііій*:-п iqpn шрут,
* ■лііііілрЛіііі і>сп\ її і .піл.
■ . і.і Ііі.Іі üHliftlJJilLlUH« ІірОІІС.ЇЦ'ри,
* iJiTl [Kn.' II {< КШКЗІІК Н ih 1С1СННС кі'МІІгМСІІПІІі ll pone.турі «Itu liJCOfH IHKJhC мвсріїгч'іііін !it>nnr:ijir"J
* і. ‘,ii4U£ • ihNlu І ЛІНІ U Лі, її- Ііііірі'-Ііфіїшіфугії:* Ьі lillij->pUJlllii іі ІІрОГЇ-lJJllii« il|4.4|L4-. J
:=ЬІОЬвГе
Í"ісгіj >іл І 1U IIu ir IL-IIIIH і,-1 цл шпиг ц-щ-ньк - Чгрлг і ■.Н.іп^йГг-, tf|рунилріші
■ ГяМН ч-'ЧрС V ЛМІЛІ. М'ЧІІЛК1НМ СЯГГСИЙ. ІІВДКіМІІПШІІ HIJ К ть Е~І№»Н » ЦІ.-
jumen іп ііуігсіміїїміпіі її пфіі4-.,р*і,іімцімЦ крали, і іаьгж? п і ипгпілга uinra ч П і,-і ІJ-X*" ЬІП, Гтм+ ЛДІ rUMkírjh4l ИРПГ4ЧЯ**Ц«ІІrfsfyéofPM Іцр'ПІ»
с іисакпп ^-равіїсії ■иіііссі№[ойііосгі< клгтін шіслс прпііслури.
* Sojlü. ПіїШіЛКГ Гф«'іНІг1ІГГЬ ilffUÓOEby IpCJhll І fUUAJX ¥ ЛрігНІШЖІІІ
* J Ipunuiin К'ІІП МІЙ S-if-JT. •>.' ililUII lia сеплраїшп LIl ІІірііфуі IÍJ4.ÍBJJlililí паїюіякчагч раїлслні. тьі№ііі.‘ігги »типі« * сдопстігтіііи ґ пя
иаішостил к рипсфіші -
* С'жтснл Іірслиишчска ДЯІ lipihlCIICirili ■ KHClL’LllllM ECpjllMII. ЕЗС іівдАксмиіші muj’IFJI'bf сміредакиіиия ншіьі|і«іті|і яроьц
* CVftUjtiJU крсші II,-.11 Сі ктиііМЛйІи* иромошдаї !Ь LLif и ІчіІІ ГІ qilLlUaiill ищгреиґ,
“ Кілиіюїтіти іфііпіі сц^нраитсі ■ стиишрпіьх- шгоілі и гп-тльи ги .илміеЦниш finíft 1% чжлніч 4'^ііішимссрніи<«і Параіиякілпг іп vilm, nípc-iiiHfliiK- пяііттт) И .ір І.
hr^aÉi italiHMfl «pucnm№ * И.ІП*ІІМійиНАі|Иім(ММг І riHiUvl йй-
^ln«K№h Jrrf» ИмІї* <fp«iit№ А. 4, реррії. 15, тр.ї-'^піст; »7і-*Ч5іЛЧа-Зі-4ї ЕншІІі
drjtflnniví ііімгМііч гі , К.ҐГВЧІ mín ь«3і .у (litin^iieií ,гн. »tH>iií'Pmv.f(íiíirií*.Mir£
p*
і
>l.talv4lJ І й I rl^Hib JJIpJ JV L llL. І г*!ІЛі L I n IfldHtJINU ЇІ HiLIUHVIL Ь-ІСІ ІМ! b iUIkvII d.441.1 г
HlrrA^rJihf І-.ТІЇ*ГІІ.П|ІГ№Г%І1И1 С lU.^lL
ГІІСТГШ ртьч^щ»!! 1ІЙ 3t*Lb обра ШН<Н L'EWI№fU\ К. Will*
* І Ikl ІІ.АІ V ІЧЧ! 1Ц.Ч.- : I І. IL-'iUii-.'IMI- IO rffKJIItíL.4 X
- Hmkiiii рлі.Лі'і і ■нлїаііі> Я ни й ЇМ іМімі і^чрл жг| ДО врсМн грщъ-мНя н пСячімчипОги ілщіраяпміигі
> Прліяічгіімсі итшггпгянроаіпіиП гфоіксс стршшгт нрсыя рктГмги І
П£рСШІЖЛЛ
* ["hrfirlmlÉ Ucpui lili л ■ iLnüliilL
- Hff IppSyCWJ бмМИіЧї! WtíflWVÍ» .Ips-Mpt* Al# ^ряіісшия І гмmí емггена НкіЛлЬпт івипііпг fr-T лілпорпіїї
* Нй іігчіїї.'.lu*і я кгіроаініл. просрвииііиті ичсіряаліиїтііігіі
* |і<Ь4ІН»ни,'1».И MUHlM
■ | |і.м\ 11LJIU ІДЛ ïHCEMhU iuiqUUMK!! Hf LlfdTEIIK' ■ НІГ1 lui ULKfU l-jp*
- Hs-Iivuiiu íes nrfipVi.ii-i.il г- Цім Лін. і II*! і».. fc*f! p-iuet'imi. il «ФПІ |f. dp
irffülni H случае 6ПЯЮЧСНМ WWTpPMtnfl ШЄГГііЦ^С»
' ГІцрамсіри 24'і жскяіі плггрйля її уирмыпгчя Лкіутін iLtmaiiH в erf*-SbiiiiiBL.f'iiiij урнами яп.шігік вкггя
ЯДЛ ЛОСТЭПЩ
ЯІII і г( plifn'ih J II IIUII П fill I piirilBUii U«l«pdXXaiTt.]b
- Мннмиігі11р>«ї líUUefJiypll üs1 ШМиШІІН
- *Зі«ртЄІ*^пЯ ТТМІ рУЧЙ»« *trf4THINJa l^VMUl IIІ і|рЄ»-р*ЧЧЖіП* Ц^іріі*І1мі№ 11 • ДМИЦі Л1І «рвікяіій
Kpiii'h'.'ii г4 пін зі ні 25 м.і
- ГІШГШШІїиН І«Л»РГр«і|Еті.ЖМи IpilUff «ІріТі-Іл
■ ЁкУСПрМПМЪЛНГЫЫЛ гтрпоссс UWpMI'll .LEI иклтй СЛНІІПШ
- El^siUíHKiiiicik [нйкіЕіаіираіиніїніи ljl ií ilii на крлненнс її ійіврсч£міі£ im'^u наш -ГіІПаагїСі H.-p,i»!iB.-Htb |І4І||Ґм*і, l пі і і і і і | і іі'і ç 4vHH*r^\knU флЦигр^А]
ГііГіГЧЯ ^ПряМСІГІІ* Ііґфй ІІ|Г»И
■ Ікпилк таняс шгрні n:.li ікклкчлсі єіііміпи. прп іісрсчпіи-ііин іх^ииіш » Опст ÜB ойрхщу
bÍL Ифііи nCfuuM
Нкнмщишншй
Е'си^ДІІК ВІРОІЧКВКІІОІІЯ
WWW, thírmo|¿cnri¡is.ru
І-ІЇНІ lilUr Ні і і -1111 л IU I і ii сЛ .1 lit HiiiipHñritali H [ІіяІміїІ.іІ, b.IrlnU ■! r IK .тлі ш - H I i |,i йанігй I luiUII ItVIU < L'lH.ln I.IH ».lUllllikpAAriailil t.Kli’t h UKflbTEUl ClflCIÿülril
- CtBCn IIÎ4' ЛЯШ fcVruri!t4«f*iM*IIW ÏWMiitHiiriT*lft««lX p-hçlük,
^K-ticïCT».. T-nariw
* 4,'dHïirw IK' .і її і,>іі<ганірі-ЯуЗіп!і' іпі.прігшіич і ісі'-'і
IriVL'LI hL-pl-lJlMUU І %'рц I U І РІЬПпіІ
* Sí 'С.%1 Д ,і кЛ,І&1аШІІ|иИШІІІгі ЦЯеі'ІІі і'і і ll'ilfVllf і Іі|' іі і і і і і г ■ ¡ iiL. і.
РЛГІОР. SKn.iflW- T-PL4fíWt
* 14' .г.» «у.інлкІїр-ііииїМ .TTiEJinrriEui. ■*. епі»
Ііі^ .і 1.11 раліііі Me »ииііш ^ шс і.ііг fC-.IUJMU 11 1 tc lion J
fXHiie іініїміЦгім
Дія уЯС^ІІІ'КІІІІгі ГЕЧОІМІ IJN'ICE РІП Лр(КЇПІГК>риУЯ S 5ÍTVK. NK-Ü.itiicd.
Txirrai it дсядриіимчи»січі_________________________________________________
